CC BY
45
УДК: 617.54-089.85:611-018.2/.7
ПЕРВЫЙ ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ТОРАКАЛЬНОЙ ХИРУРГИИ
В.И. Егоров1, П.М. Ионов1, Ю.В. Юркевич2,3, А.Б. Смолянинов2,3, Н.К. Беседина1, А.Л. Акопов4 Ютделение торакальной хирургии ГБУЗ «Городская Покровская больница», Санкт-Петербург, Россия 2НИЛ клеточных технологий ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», Санкт-Петербург, Россия 3ООО «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, Россия 4 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова,
Санкт-Петербург, Россия
Бронхоскопическая тактика закрытия бронхиальных свищей, несмотря на достоинства, остается недостаточно разработанной и имеет ограниченное применение. Один из новых путей совершенствования данного направления может заключаться в эндобронхиальной окклюзии свища бронха с использованием клеточных технологий. В данной работе проведено обоснование возможности укоренной репарации послеоперационных бронхиальных свищей путем введения in situ суспензии культивированных аллогенных фибробластов человека.
В исследование включено 10 пациентов с бронхоплевральными свищами после перенесенной пневмонэктомии по поводу рака легкого и инфекционно-деструктивного процесса. Диаметр дефекта культи бронха составлял в среднем 5 мм. Эндобронхиальное вмешательство заключалось в подслизистой инъекции суспензии аллофибробластов человека в зону фистулы культи бронха. Введение клеточной суспензии осуществлялось в изотоническом солевом растворе в подслизистый слой бронха в зону свища в 2-5 точках общим объемом 1,5 мл. Концентрация аллофибробластов - 3х106 клеток/мл. Состояние культи бронха и остаточной плевральной полости контролировалось выполнением бронхоскопии, рентгенографии легких, КТ исследования.
Показано, что после эндобронхиального введения суспензии фибробластов просвет свищей не определялся в 6 наблюдениях из 10. Обтурация просвета бронха наступала через 7-9 суток после пересадки клеток. У остальных больных свищевой ход сохранялся, что потребовало повторной клеточной инфильтрации. При контрольной бронхоскопии в двух случаях свищ слепо заканчивался и не сообщался с плевральной полостью, диаметр свищевого отверстия у двух пациентов существенно уменьшился, но полностью не закрылся. Таким образом, бронхоэндоскопическое субмукозное введение суспензии аллофибробластов в проекцию бронхиального свища следует рассматривать в качестве перспективного способа консервативного лечения несостоятельности культи бронха после радикальных операций на легких, позволяющего в 60-80% случаев избежать повторного открытого хирургического вмешательства.
Ключевые слова: аллогенные фибробласты, клеточные технологии, бронхиальный свищ, эндоскопическое лечение, заживление.
Введение
В структуре торакальных операций пневмонэктомии занимают значительное место [1, 2]. Однако, несмотря на разработку современных шовных материалов, новых способов ушивания и пластики культи бронха, совершенствование хирургической техники, число бронхиальных осложнений после удаления легкого остается высоким [3, 4]. Из них наиболее грозными являются бронхиальные свищи, частота развития которых составляет 3-16% [5, 6], а летальность достигает 20-75% [7].
Существующие консервативные способы лечения пострезекционных бронхиальных свищей являются длительными и, зачастую, малоэффективными. Положительные результаты
при использовании этих методов, по данным исследователей, не превышают 30-40% [8]. Эффективность хирургических методов закрытия бронхиальных свищей после пневмонэктомии несколько выше по сравнению с консервативными методами [9]. Тем не менее, выполняемые с этой целью операции, отличаются травматич-ностью, сопряжены с риском осложнений и летальностью, достигающей 20-40%, а также высокой частотой повторной несостоятельности культи бронха [10, 11]. Попытки применения малоинвазивных эндобронхиальных и торако-скопических вмешательств (прижигание свища, электрокоагуляция, применение клеевых композиций и др.) для лечения несостоятельности культи бронха также оказались малоуспешны-
ми, эффективность их ограничена обычно единичными наблюдениями [12].
В последнее время в нашей стране и за рубежом большое внимание уделяется инновационным клеточным технологиям [13]. Современное развитие представлений о заживлении ран основывается на изучении клеточных и мо-лекулярно-генетических основ репарации тканей [14]. Одним из перспективных направлений является использование для лечения ран культивированных in vitro клеток - фибробла-стов, являющихся основными клетками соединительной ткани [15, 16]. Состояние основных внеклеточных компонентов соединительной ткани, коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон и межклеточного матрикса зависят от функциональной активности фибро-бластов [17]. Ускорение заживления ран при трансплантации культивированных фибро-бластов обусловлено также продукцией различных иммунологически активных факторов, влияющих на рост всех типов клеток в зоне повреждения [18]. К настоящему времени получены многочисленные экспериментальные и клинические доказательства индуцирующего влияния данного типа культивированных клеток на течение репаративных процессов [19]. Тем не менее, несмотря на реальные перспективы использования культивированных фи-бробластов в торакальной хирургии, должного практического опыта в этом направлении к настоящему времени не накоплено.
Цель исследования - изучение эффективности эндоскопического лечения послеоперационных бронхиальных свищей с применением культивированных аллогенных фибробластов.
Материал и методы. Материал исследования составили 10 больных (6 мужчин и 4 женщины). Возраст пациентов варьировал от 56 до 74 лет. Девяти пациентам была выполнена пневмонэк-томия по поводу рака легкого (7 пациентов) и неспецифического острого инфекционно-де-структивного процесса (2 пациента). Еще в одном наблюдении произведено удаление нижней доли правого легкого по поводу рака. В послеоперационном периоде в сроки от 6 до 22 суток у всех пациентов развилась несостоятельность культи главного бронха и эмпиема плевры. Диаметр дефекта культи бронха не превышал 5 мм. Всем пациентам производилось дренирование плевральной полости с ее ежедневными санациями антисептическими препаратами, назначалась внутривенная антибактериальная и дезин-
токсикационная терапия. Осуществлялся курс санационных бронхоскопий.
После купирования острой фазы воспаления больным под местной анестезией и седацией выполняли эндобронхиальное вмешательство, заключающееся в подслизистой инъекции суспензии аллогенных фибробластов человека в зону фистулы культи бронха. Процедура выполнялась с использованием видеоэндоскопа фирмы «Olympus». Диаметр рабочего канала - 5 мм. Введение клеточной суспензии осуществлялось с помощью бронхоскопической канюли MTW в подслизистый слой бронха в зону свища в 2-5 точках общим объемом 1,5 мл. Концентрация аллофибробластов составляла 3*106 клеток/мл. В дальнейшем состояние культи бронха и остаточной плевральной полости контролировалось выполнением бронхоскопии, рентгенографии легких, КТ-исследования. В среднем, бронхоскопическое введение суспензии фибробластов производилось через 7-10 суток после развития несостоятельности вследствие резекционной операции. Состояние всех пациентов на момент выполнения лечебной бронхоскопии расценивалось как удовлетворительное, признаки дыхательной недостаточности имели место у 2 из 10 пациентов. Длительность эндоскопической операции составляла в среднем от 5 до 15 минут. Технических сложностей не наблюдалось. Интраоперацион-ных осложнений не отмечали. Больные переносили бронхоскопию с дискомфортом, характерным обычной диагностической процедуре.
В исследовании использовали культивированные аллогенные фибробласты человека, имеющие полную паспортную характеристику [20]. Культуры клеток получали из послеоперационных фрагментов кожи пациентов мужского пола в возрасте 2-5 лет при выполнении плановых хирургических вмешательств. Культивирование фибробластов осуществляли с использованием общепринятых методических приемов [21]. Проведены контроль вирусной и бактериальной контаминации, а также цито-генетический анализ хромосом для подтверждения нормального кариотипа культур клеток. Культуры, удовлетворяющие критериям контроля качества, помещали на длительное криогенное хранение. Последующее субкультивирование осуществляли при достижении 80% конфлюентности. Культуры поддерживали в среде альфа-МЕМ с добавлением 20% феталь-ной бычьей сыворотки (Gibco, США) при периодическом пассировании с частотой один раз в 3-4 дня с использованием трипсина (Invitrogen,
США) и раствора Версена (Биолот, Россия) в соотношении 1:3 для снятия клеток со стенок культурального флакона и получения суспензии [22]. Антибиотики на этом этапе не применяли для предупреждения развития аллергических реакций, обусловленных индивидуальной непереносимостью антибиотика [23].
Результаты исследования и обсуждение.
При бронхоскопии, выполненной через 3 недели после эндобронхиального введения суспензии фибробластов, просвет свищей не определялся в 6 наблюдениях из 10. Обтурация просвета бронха наступала через 7-9 суток после пересадки клеток. У остальных больных свищевой ход сохранялся, что потребовало повторной клеточной инфильтрации. При контрольной бронхоскопии в двух случаях свищ слепо заканчивался и не сообщался с плевральной полостью, диаметр свищевого отверстия у двух остальных пациентов существенно уменьшился, но полностью не закрылся.
Следовательно, в 6 из 10 наблюдений клинические признаки бронхиального свища отсутствовали полностью, явления эмпиемы купированы, что позволило удалить дренаж из плевральной полости. Данная процедура позволила избежать открытого хирургического вмешательства. Остальным пациентам (40%) потребовалось повторное введение культивированных клеток, что обеспечивало у 20% больных полное закрытие свищевого хода. В двух случаях сохранялось поступление воздуха из плевральной полости через дренаж при кашле.
Показательными являются следующие клинические наблюдения.
Пациент С. поступил в апреле 2013 г. с правосторонней послеоперационной эмпиемой плевры. В марте 2013 г. выполнена правосторонняя пневмонэктомия по поводу рака легкого. Спустя 10 суток после операции развились явления эмпиемы плевры, плевральная полость дренирована. При поступлении рентгенологически определялась свободная плевральная полость после правосторонней пульмонэктомии с уровнем жидкости. При бронхоскопии в дистальной части культи правого главного бронха имелся дефект диаметром около 5 мм (рис. 1).
Больному начато проведение антибактериальной, симптоматической терапии, проводились ежедневные санации плевральной полости. После купирования острой фазы воспаления выполнено обкалывание зоны свища суспензией аллофибробластов в 3-х точках (рис. 2).
Рис. 1. Эндоскопическая картина культи правого главного бронха
Рис. 2. Эндоскопическое обкалывание зоны дефекта культи бронха
Пациент выписан в удовлетворительном состоянии через 14 суток. При контрольном бронхоскопическом обследовании спустя 4 недели дефект культи бронха не определялся (рис. 3).
/
1г "к к. -«1
.4. ' -
Рис. 3. Контрольная бронхоскопия через 4 недели после вмешательства
При рентгенологическом исследовании определялся формирующийся правосторонний фиброторакс без признаков эмпиемы (рис. 4).
Рис. 4. Правосторонний фиброторакс после пневмонэктомии
Следующее наблюдение связано с дефектом культи левого главного бронха. Пациентка В., 63 года, была госпитализирована с левосторонней послеоперационной эмпиемой плевры. Больной выполнена левосторонняя пневмонэк-томия по поводу рака легкого в онкологическом стационаре. На второй неделе послеоперационного периода появились жалобы на слабость, озноб, отмечалась лихорадка до 38 °С. При поступлении в отделение выявлена эмпиема плевральной полости (рис. 5). Установлен дренаж в левую плевральную полость.
Рис. 5. Эмпиема левой плевральной полости после пневмонэктомии
При бронхоскопическом исследовании в дистальной части культи бронха выявлен дефект стенки диаметром 5 мм (рис. 6).
Рис. 6. Фистула культи левого главного бронха
После проведения санационной, антибактериальной терапии через 20 дней выполнено эндоскопическое обкалывание зоны свища суспензией аллофибробластов (1,5 мл) в 3-х точках. При контрольном обследовании через 3 месяца на рентгенограммах грудной клетки определялся левосторонний фиброторакс (рис. 7).
Рис. 7. Левосторонний фиброторакс после пневмонэктомии
При культиграфии поступления контраста в плевральную полость не выявлено, что доказывало закрытие бронхиального свища.
В современной литературе имеется ограниченное количество работ, посвященных обоснованию применения клеточных технологий в торакальной хирургии с целью заживления бронхиальной культи после пневмонэктомий. Почти все такие исследования выполнены на экспериментальных животных и не могут, в полной мере экстраполироваться на челове-
ка. В то же время данное направление вселяет оптимизм. К примеру, в опытах на козах авторы применяли аутологичные костномозговые мононуклеары для заживления бронхиальных фистул и получили положительные результаты усиления пролиферации фибробластов и ускоренное развитие коллагеновой матрицы в зоне введения клеточной суспензии [24]. Другими исследователями также показано, что использование аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга позволило добиться лучшего заживления культи бронха у крыс за счет уменьшения воспалительных явлений, ускорения регенерации тканей, снижения выраженности спаечного процесса [25]. Отечественные авторы [26] опубликовали результаты аутоло-гичного применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у 5 больных с хроническими бронхиальными свищами. Во всех наблюдениях свищи закрылись в течение 5 месяцев после лечения.
Рис. 8. Фистулограмма культи левого главного бронха
Заключение
Результаты первого опыта применения клеточных технологий у больных с послеоперационными бронхиальными свищами небольших размеров свидетельствуют о том, что при использовании суспензии аллофибробластов человека в 60% отмечается отчетливый окклю-зионный эффект. В 20% случаев при наличии эндоскопической картины дефекта в культе бронха происходит закрытие свища путем развития соединительной ткани вокруг дистально-го отверстия (со стороны плевральной полости). Такое рубцевание свищевого хода подтверждается дополнительными методами исследования (компьютерной томографией, культиграфией).
Литература
1. Колесников, И.С. Хирургия легких и плевры [Текст] / И.С. Колесников, М.И. Лыткин. -Л.: Медицина, 1988. - 384 с.
2. Cariati, A. Postpneumonectomy bronchial stump recurrence and bronchopleural fistula [Текст] / A. Cariati, E. Piromalli // Asian Cardiovascular. Thoracic. Ann. - 2012. - Vol. 20, №4. -P. 439-442.
3. Левченко, Е.В. Бронхиальная фистула -факторы риска, пути профилактики и лечения в онкопульмонологии [Текст] / Е.В. Левченко, В.А. Шутов, А.А. Тришин и др. // Вестн. хир. им. И.И. Грекова. - 2005. - № 3. - С. 15-22.
4. Javadpour, H. Bronchopleural fistula after pneumonectomy [Текст] / H. Javadpour, P. Sidhu, D.A. Luke // Ir. J. Med. Sci. - 2003. - Vol. 172, № 1. - P. 13-15.
5. Порханов, В.А. Свищ главного бронха старая проблема в новых условиях [Текст] /
B.А. Порханов // Материалы 2-й междунар. конф. по торакальной хирургии, посв. 40-летию профильных отделений РНЦХ РАМН. - М., 2003. - С. 212-223.
6. Llewellyn-Bennett, R. Prophylactic flap coverage and the incidence of bronchopleural fiatulae after pneumonectomy [Текст] / R. Llewellyn-Bennett, R. Wotton, D. West // Int. Cardiovascular Thoracic. Surg. - 2013. - Vol. 16, № 5. - P. 681-685.
7. Бисенков, Л.Н. Профилактика и лечение первичной несостоятельности культи бронха после пневмонэктомии [Текст] / Л.Н. Бисенков, Р.Ш. Биходжин // Хирургия. - 2007. - №1. -
C. 59-62.
8. Вагнер, Е.А. Лечение бронхиальных свищей [Текст] / Е.А. Вагнер, А.Н. Кабанов, К.К. Козлов, В.В. Павлов. - Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1993. - 194 с.
9. Deschamps, C. Empyema and bronchopleural fistula after pneumonectomy: factors affecting incidence [Текст] / C. Deschamps, A. Bernard, F.C. Nichols III et al. // Ann. Thorac. Surg. - 2001. - Vol. 72, № 1. - P. 243-247.
10. Проценко, А.В. Профилактики и лечение бронхиальных свищей после пульмонэктомин по поводу рака лёгкого [Текст] / А.В. Проценко, Ю.Б. Ивченко, В.И. Лукьянов // Вопр. онкологии. - 1991. - № 11-12. - С. 1082-1086.
11. Suzuki, M. Bronchopleural fistula after lung cancer surgery: multivariate analysis of risk factors [Текст] / M. Suzuki, M. Otsuji, M. Baba et al. // J. Cardiovasc. Surg. (Torino). - 2002. - Vol. 43. -P. 263-267.
12. Чичеватов, Д.А. Хирургическая профилактика бронхоплевральных свищей после резекции легких и пневмонэктомий [Текст] / Д.А. Чичеватов, А.Н. Горшенев, Е.Н. Синев // Вестн. хир. им. И.И. Грекова. - 2004. - Т. 163, №5. - С.125-127.
13. Abbott, S. Twenty years of the International Society for Cellular Therapies: the past, present and future of cellular therapy clinical development [Текст] / S. Abbott, G. Mackay, Durdy M., S. Solomon, C. Zylberberg // Cytotherapy. - 2014. -Vol. 16, № 4. - S. 112-119.
14. Helary, C. Fibroblasts within concentrated collagen hydrogels favour chronic skin wound healing [Текст] / C. Helary, M. Zarka, M.M. Giraud-Guille // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2012. -Vol. 6, № 3. - P. 225-237.
15. Седов, В.М. Использование биотрансплантата в виде фибробластов, включенных в коллагеновый гель, для пластики грыжевых дефектов брюшной стенки [Текст] / В.М. Седов, С.Д. Тарбаев, Г.П. Пинаев, А.Х. Хамид // Цитология. - 2004. - Т. 46, № 10. - С. 939.
16. Price, R.D. The role of allogenic fibroblasts in an acute wound healing model [Текст] / R.D. Price, V. Das-Gupta, P.A. Harris // Plast. Reconstr. Surg. -2004. - Vol. 113, № 6. - P. 1719-1729.
17. Manzar, G.S. Skin deep: from dermal fibroblasts to pancreatic beta cells [Текст] / G.S. Manzar, E.M. Kim, P. Rotti, N. Zavazava // Immunol. Res. - 2014. - Vol. 59, № 1-3. - P. 279-286.
18. Kazemi-Darabadi, S. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial [Текст] / S. Kazemi-Darabadi, F. Sarrafzadeh-Rezaei, A.A. Farshid, B. Dalir-Naghadeh // Int. J. Surg. - 2014. - Vol. 12, № 8. - P. 751-756.
19. Klar, A.S. Differential expression of granulocyte, macrophage, and hypoxia markers during ear-
ly and late wound healing stages following transplantation of tissue-engineered skin substitutes of human origin [Текст] // A.S. Klar, S. Bottcher-Haberzeth, T. Biedermann et al. // Pediatr. Surg. Int. - 2014. - Vol. 30, № 12. - Р. 1257-1264.
20. Применение культивированных фибро-бластов в комбустиологии: пособие для врачей / Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе. - СПб., 2014. - 28 с.
21. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков [Текст] / Р. Адамс. - М.: Мир, 1983. - 263 с.
22. Пат. 23207200 Российская Федерация, МПК51 d2N 5/08 A61L/27/38. Способ культивирования фибробластов для заместительной терапии [Текст] / Е.В. Парфенова, В.А. Ткачук, Н.И. Калинина [и др.]; № 2006102043/15; заявл. 25.01.06; опубл. 27.03.08, Бюл. № 9. - 13 с.: ил.
23. Туманов, В.П. Способ получения трансплантата из культивированных фибробластов человека для лечения обожженных [Текст] /
B.П. Туманов // Тез. докл. межд. симп. «Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи». - Тула, 1996. -
C. 11-12.
24. Petrella, F. Stem Cell Transplantation Effectively Occludes Bronchopleural Fistula in an Animal Model [Текст] / F. Petrella, F. Toffalori, S. Brizzola. et al. // Ann Thorac Surg. - 2014. -Vol. 97, № 2. - P. 480-483.
25. Gomez-de-Antonio, D. Stem cells and bronchial stump healing [Текст] / D. Gomez-de-Antonio, M. Zurita, J.M. Santos et al. // Thorac Cardio-vasc Surg. - 2010. - Vol. 140, № 6. - P. 1397-1401.
26. Polyakov, I. Mesenchimal stem cells in the treatment of choronic fistula of the main bronchus [Текст] / I. Polyakov, V. Porhanov, A. Kovalenko et al. // Interact Cardiovasc Thorac Surg. - 2013. -Vol. 17, № 2. - P. 90.
Ю.В. Юркевич
Тел.: +7(962)705-38-28
E-mail: [email protected]
В.И. Егоров1, П.М. Ионов1, Ю.В. Юркевич23, А.Б. Смолянинов23, Н.К. Беседина1, А.Л. Акопов4 Первый опыт применения клеточных технологий в торакальной хирургии // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. — 2015. — Том 7, № 2. — С. 7—13.
V.I. Egorov, P.M. Ionov, Y.VJurkiewicz, A.B. Smolyaninov, N.K. Besedina, A.L. Akopov FIRST EXPERIENCE OF CELL TECHNOLOGIES IN THORACIC SURGERY
Bronchoscopic bronchial fistulas closing tactics, despite the merits, is not sufficiently developed and is of limited use. One of the new ways of improving this area may consist of endobronchial bronchus occlusion of the fistula using cellular technology. The purpose of this study was to evaluate the effectiveness of endoscopic treatment of postoperative bronchial fistulas using cultured allogeneic fibroblasts.
The study included 10 patients with bronchopleural fistula after pneumonectomy transferred for lung cancer and infectious and destructive process. The diameter of the defect bronchial stump averaged 5 mm. Endobronchial intervention consisted of submucosal injection of a suspension allofibroblas-tov human bronchial stump fistula zone. Introduction of cell suspension was carried out in an isotonic saline submucosal fistula bronchus area 2-5 points total volume of 1.5 ml. Concentration allofibroblas-tov - 3x106 cells / ml. State of bronchial stump and residual pleural cavity to monitor the implementation of bronchoscopy, chest X-ray, CT scan.
It is shown that after endobronchial administration fibroblast suspension clearance fistula was not detected in 6 cases out of 10. obturation of the lumen of the bronchus occurs within 7-9 days after cell transplantation. In the remaining patients fistula persisted, requiring re-cellular infiltration. Follow-up bronchoscopy in two cases the fistula ended blindly and do not communicate with the pleural cavity, the diameter of the fistula opening in two patients decreased significantly, but not completely closed. Thus, bronhoendoskopic submucosal administration of a suspension allofibroblasts in projection bronchial fistula should be considered as a promising method of conservative treatment failure bronchial stump after radical operations on the lungs, allowing 60-80% of cases, to avoid re-open surgery.
Key words: allogeneic fibroblasts, cell technology, bronchial fistula, endoscopic treatment, healing.
Authors
Yu.V. Yurkevich
Tel.: +7(962)705-38-28
E-mail: [email protected]
V.I. Egorov, P.M. Ionov, YV.Jurkiewicz, A.B. Smolyaninov, N.K. Besedina, A.L. Akopov First experience of cell technologies in thoracic surgery // Herald of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov. — 2015. - Vol. 7, № 2. - P. 7-13.
