CC BY
8Первая находка почвенной цианобактерии Nodosilinea epilithica (Synechococcales, Cyanobacteria) в России
А. Д. Темралеева, С. А. Дронова
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, ул. Институтская, д. 2, г. Пущино, Московская обл., 142290, Россия; [email protected]
Резюме. Nodosilinea epilithica Perkerson et Casamatta впервые приводится для территории России. Вид обнаружен в фоновой каштановой почве в зоне сухих степей (Волгоградская область). Определение подтверждено с помощью морфологического и молекулярно-генетического анализа. Характерной особенностью изученного штамма является способность формировать узелки в условиях нормальной освещенности (60-75 мкмоль фотонов • м-2 • с-1). Предполагается, что количество узелков может быть связано с возрастом цианобактериальной культуры.
Ключевые слова: цианобактерии, Nodosilinea, новая находка, морфология, 16S рРНК, каштановая почва, сухие степи, Волгоградская область.
First record of the soil cyanobacterium Nodosilinea epilithica (Synechococcales, Cyanobacteria) in Russia
A. D. Temraleeva, S. A. Dronova
Institute of Physico-Chemical and Biological Problems in Soil Science of RAS, Institutskaya Str., 2, Pushchino, Moscow Region, 142290, Russia; [email protected]
Abstract. Nodosilinea epilithica Perkerson et Casamatta is reported for the first time for Russia. The sample was isolated from a typical chestnut soil in the zone of dry steppes (Volgograd Region) and its identity was confirmed by morphological and molecular analyses. The specific feature of the studied strain is its ability to form nodules at normal (60-75 ^mol photons • m-2 • sec-1) light. The number of nodules is supposed to be related to the age of a cyanobacterial culture.
Keywords: cyanobacteria, Nodosilinea, new record, morphology, 16S rRNA, chestnut soil, zone of dry steppes, Volgograd Region.
Введение
Род цианобактерий Nodosilinea Perkerson et Casamatta был выделен из полифилетичного рода Leptolyngbya Anagnostidis et Komarek и описан на основании морфологического и молекулярно-генетиче-ского анализа (Perkerson et al., 2011). Представители рода принадлежат к порядку Synechococcales, семейству Leptolyngbyaceae Komarek, Kastovsky, Mares et Johansen (Komarek et al., 2014). Виды Nodosilinea характеризуются следующими морфологическими признаками: уни-
кальной способностью формировать узелки (nodules), нитчатой организацией таллома, наличием тонкого, мягкого и бесцветного чехла, париетальным расположением тилакоидов. Нити неподвижные с неявной или отчетливой перешнуровкой, клетки изодиаметрические или вытянутые, аэротопы отсутствуют. Некоторые виды способны к азотфиксации. Размножение гормогониями или с помощью не-кридий. По литературным данным, все известные виды способны формировать узелки в условиях низкой освещенности: 4-6 мкмоль фотонов • м-2 • с-1 и ниже (Li, Brand, 2007; Perkerson et al., 2011). В настоящее время в состав рода включают 4 вида (Guiry, Guiry, 2016), характеристика которых приведена ниже.
N. nodulosa (Li et Brand) Perkerson et Casamatta [= Leptolyngbya nodulosa Li et Brand] — номенклатурный тип названия рода Nodosilinea — принадлежит к морским цианобактериям. Характеризуется распростертыми нитями с цилиндрическими клетками 1.2-1.4 мкм дл. и 1.1-1.5 мкм шир. Размножение фрагментацией трихомов в местах расположения некридий и гормогониями (Li, Brand, 2007). От остальных видов отличается преимущественно изодиаме-трическими клетками. Референсный штамм: N. nodulosa UTEX 2910. Изолирован из пробы морской воды, взятой на глубине 10 м (ЮжноКитайское море).
N. bijugata (Kongisser) Perkerson et Kovâcik [= Phormidium bijugatum Kongisser; = Leptolyngbya bijugata (Kongisser) Anagnostidis et Komârek] — пресноводный вид. Нити неветвящиеся, формируют узелки редко, чехлы часто отсутствуют (если присутствуют, то тонкие и бесцветные). Трихомы слегка перешнурованные. Гормогонии, некридии и меристематические зоны отсутствуют. Клетки цилиндрические, часто с 1-2 гранулами у перегородок, изодиаметрические или вытянутые, 1.5-6.2 мкм дл. и 1.5-1.7 мкм шир. Терминальные клетки закругленные, удлиненные. Париетальное расположение тилакоидов плохо различимо в световой микроскоп. От остальных видов отличается отсутствием некридий и меристематических зон. Референсный штамм: N. bijugata Kovâcik 1986/5a. Изолирован на литорали озера (Польша).
N. conica Perkerson et Johanansen и N. epilithica Perkerson et Casamatta являются наземными видами. N. conica отличается от остальных видов рода более широкими трихомами и коническими клетками. Нити неразветвленные, узелки образуются редко. Чехлы мягкие, тонкие, бесцветные. Трихомы слегка перешнурованные, без некридий, есть меристематические зоны и гормогонии. Трихомы на концах суженные. Париетальное расположение тилакоидов отчетли-
во заметно в световом микроскопе. Клетки изодиаметрические или более короткие, 0.9-2.4 мкм дл. и 2.5-2.7 мкм шир. Терминальные клетки в зрелых трихомах конической формы. Референсный штамм: N. conica SEV4-5-c1. Изолирован из почвы пустыни (США).
N. epilithica близок по морфологии к N. nodulosa, но отличается более широкими трихомами. Узелки наблюдаются часто. Нити обычно неветвящиеся, редко с ложным ветвлением. Чехлы тонкие, бесцветные, иногда расширяющиеся и расплывающиеся. Трихомы 1.52.5 мкм шир., слегка или отчетливо перешнурованные, некридии и меристематические зоны отсутствуют. Размножение гормогониями. Клетки обычно бочонковидные, 1.0-8.0 мкм дл., часто с 1-2 гранулами в центроплазме. Терминальные клетки закругленные, сходные по морфологии с интеркалярными. Референсный штамм: N. epilithica Kovacik 1998/7. Изолирован из зеленой бактериальной пленки на стене дома (Италия).
Таким образом, разделение видов основано на таких морфологических признаках, как размеры клеток, степень перешнуровки трихомов, форма терминальных клеток, а также особенностях размножения (фрагментация трихомов, гормогонии).
В России представители рода Nodosilinea были найдены в Кулун-динских степных содовых озерах с высокой щелочностью (pH до 10.3) и соленостью до 200 г/л (Samylina et al., 2014). Вид N. bijugata (как Phormidium bijugatum и Leptolyngbya bijugata) неоднократно приводился для водных и наземных экосистем страны (Patova, 1995; Ya-rushina et al., 2004; Komulaynen et al., 2006; Bioraznoobrazie..., 2010; Федоров, 2011; Shargaeva et al., 2012; и др.). Однако молекулярно-ге-нетическое подтверждение находок было получено только в первой из цитированных работ (Samylina et al., 2014). Информация же о находках вида N. epilithica в России отсутствует. Данная работа представляет собой первое описание, основанное на морфологическом и молекулярно-генетическом изучении коллекционного штамма.
Материал и методы
Изоляция и культивирование штамма. Объектом исследования послужил штамм ACSSI 34 из альгологической коллекции Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (ИФХиБПП) (Algal Collection of Soil Science Institute, ACSSI). Штамм был изолирован авторами из верхнего горизонта А1 фоновой каштановой почвы (Волгоградская область, Россия, зона сухих степей). Географические координаты места пробоотбора: 47°53'21" с. ш., 44°0'50" в. д. Культивирование штамма проводили на среде
BG11 с азотом (1%-ный агар, pH = 7.0) в климатостате (температура +23-25 °С, освещенность люминесцентными лампами FLUORA 60-75 мкмоль фотонов • м-2 • с-1, фотопериод 12 ч).
Микроскопия. Морфологию и жизненный цикл штамма ACSSI 34 изучали методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) в ЦКП ИФХиБПП. Результаты наблюдений документированы рабочими рисунками и фотографиями, снятыми с помощью цветных цифровых камер «Видеозавр» (Россия) и Carl Zeiss MRc 5 (Германия). Сроки наблюдения за штаммом составляли от 2 недель до 4 месяцев.
Выделение, амплификация, очистка и секвенирование ДНК. ДНК выделяли из цианобактериальной биомассы с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, США), следуя протоколу производителя. При амплификации использовали готовую смесь для ПЦР Screen Mix-HS (Евроген, Россия). Праймеры и условия для амплификации гена 16S рРНК указаны в таблице 1 (Flechtner et al, 2002; Strunecky et al., 2010). Детекцию целевых ПЦР-продуктов проводили электрофоретически в 1%-ном агарозном геле. Для дальнейшей очистки ампликонов из геля применяли набор Cleanup Mini (Евро-ген, Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей осуществляли на базе ЗАО «Синтол» (Россия).
Молекулярно-филогенетический анализ. Для молекулярно-фило-генетического анализа была составлена выборка последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащих некультивируемым образцам из природной среды и культивируемым штаммам рода Nodosilinea (табл. 2). В выборку включены таксоны, имеющие > 97 % сходства по алгоритму BLAST с последовательностью гена 16S рРНК исследуемого штамма и длину последовательности целевого фрагмента не менее 1300 пар нуклеотидов (п. н.). Согласно требованию к длине последовательностей из набора данных были исключены короткие нуклеотидные последовательности Nodosilinea sp. FI2-2HA2 (HM018678), Nodosilinea epilithica Kovacik 1990/52 (HM018679), Leptolyngbya sp. Kovacik 1986/5a (EU528669), Leptolyngbya sp. NB1a--A5 (EU528666), Leptolyngbya sp. NB1b-A5 (EU528668), Leptolyngbya sp. SEV4-5-c1 (EU528667) и Leptolyngbya sp. Rehakova 1960/20 (DQ085091), использованные в работе Perkerson с соавт. (Perkerson et al., 2011). В качестве внешней группы были выбраны представители других родов того же семейства Leptolyngbyaceae: Halomicronema и Prochlorothrix. Суммарно в выборку вошли 64 нуклеотидные последовательности, выравнивание которых выполнили в программе
BioEdit по алгоритму ClustalW. Общая длина последовательностей для дальнейшего анализа составила 1427 п. н. Для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jModelTest. Оптимальной для исследуемого набора данных стала модель GTR+I+G. Реконструкцию филогенетических взаимосвязей осуществляли методом максимального правдоподобия (ML) в программе PhyML. Статистическая поддержка топологии дерева была оценена с помощью бут-стреп-анализа (1000 повторностей) и указана в узлах ветвей в виде процентов. Генетические различия между нуклеотидными последовательностями гомологичных генов охарактеризовали с помощью генетических дистанций. Мерой генетических различий являлся процент несовпадений нуклеотидов при попарном сравнении выровненных последовательностей, вычисление которого проводили в программе MEGA 5.0.
Таблица 1
Праймеры и условия амплификации фрагмента гена 16S рРНК
Primers and amplification conditions for 16S rRNA gene analysis
Праймер Primer Последовательность (5'-3') Sequence (5'-3') Условия амплификации Amplification conditions
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 °C — 5 min; 94 °C — 45 sec, 54 °C — 45 sec, 72 °C — 2 min, 35 cycles; 72 °C — 7 min
CYA781R GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT
359F GGGGGATTTTCCGCAATGGG 94 °C — 5 min; 94 °C — 1 min, 59 °C — 1 min, 72 °C — 2 min, 35 cycles; 72 °C — 5 min
1467R AAGGAGGTGATCCAGCCACA
Таблица 2
Выборка таксонов цианобактерий рода Nodosilinea для 16S рРНК-анализа
Dataset of Nodosilinea taxa for 16S rRNA analysis
Название таксона в GenBank Taxon name in GenBank Штамм Strain Номер в GenBank GenBank Accession number Среда обитания, место изоляции Habitat Источник Reference
Nodosilinea epilithica Kovácik 1998/7* HM018677 Зеленая пленка на стене дома, Италия Green biofilm on the wall of the house, Italy Perkerson et al., 2011
Leptolyngbya sp. Kovácik 1999/1 GQ495618 Зеленая пленка на стене церкви, Словакия Green biofilm from interior church wall, Slovakia
Продолжение табл. 2
Название таксона в GenBank Taxon name in GenBank Штамм Strain Номер в GenBank GenBank Accession number Среда обитания, место изоляции Habitat Источник Reference
Pseudanabaena-ceae cyanobac-terium DPG1-KK5 EF654067 Почва, США Soil, USA Siegesmund et al., 2008
Phormidium sp. SAG 61.90 EU624415 Река Мёз, Бельгия Meuse River, Belgium -
Oscillatoriales cyanobacterium EcFYyyy400 KC463194 Почва, Южная Африка Soil, South Africa Dojani et al., 2014
Leptolyngbya subtilissima EcFYyyy700 KC463197 Почва, Южная Африка Soil, South Africa Dojani et al., 2014
Phormidium sp. 195-A12 EU282429 Сибирская вечная мерзлота, Колыма, Россия Siberian permafrost, Kolyma River, Russia
Leptolyngbya sp. LEGE 07080 HM217085 Эстуарии, Португалия Estuaries, Portugal Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07298 HM217044 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07314 HM217061 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07309 HM217053 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07084 HM217072 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07296 HM217082 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 06069 HM217073 Там же Same Lopes et al., 2012е
Leptolyngbya sp. LEGE 07091 HM217068 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07311 HM217056 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07088 HM217064 Там же Same Lopes et al., 2012
Leptolyngbya sp. LEGE 07312 HM217066 Там же Same Lopes et al., 2012
Nodosilinea nodulosa (T) UTEX 2910* KF307598 Южно-Китайское море South China Sea Li, Brand, 2007
Leptolyngbya sp. 0BB24S04 AJ639893 Пруд, Италия Pond, Italy Castiglioni et al., 2004
Leptolyngbya sp. 0BB19S12 AJ639895 Там же Same Castiglioni et al., 2004
Продолжение табл. 2
Название таксона в GenBank Taxon name in GenBank Штамм Strain Номер в GenBank GenBank Accession number Среда обитания, место изоляции Habitat Источник Reference
Leptolyngbya sp. 0BB32S02 AJ639894 Там же Same Castiglioni et al, 2004
Leptolyngbya sp. 0BB30S02 AJ639892 Там же Same Castiglioni et al., 2004
Nodosilinea sp. CENA167 KC695860 Почва, мангровые экосистемы, Бразилия Soil, mangrove ecosystems, Brazil Silva et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA147 KC695841 Там же Same Silva et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA183 KC695874 Там же Same Silva et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA144 KC695838 Там же Same Silva et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA137 KC695831 Перифитон, мангровые экосистемы, Бразилия Periphyton, mangrove ecosystems, Brazil Silva et al., 2014
Leptolyngbya sp. PCC7104 AB039012 Почва около береговой линии, США Soil near shoreline, USA
Leptolyngbya margaretheana 1T12 FR798934 Биопленка в фонтане, Италия Biofilm in a fountain, Italy Cuzman et al., 2010
Uncultured Nodosilinea sp. clone TPB GMAT SPRING12 36 HF677144 Микробный мат, Индия Microbial mat, India
Leptolyngbya cf. halophila LEGE 06152 HQ832915 Песчано-каменистый пляж, Португалия Sandy-stony beach, Portugal
Uncultured cyanobacterium clone UMAB-cl-62 FN811246 Почва, Земля Александра I, Антарктика Soil, Alexander I Island, Antarctica Chong et al., 2012
Uncultured bacterium clone GBI-89 GQ441269 Морские микробные маты песчаного пляжа, Нидерланды Marine microbial mats from a sandy beach, Netherlands
Uncultured bacterium clone GBI-83 GQ441263 Там же Same -
Продолжение табл. 2
Название таксона в GenBank Taxon name in GenBank Штамм Strain Номер в GenBank GenBank Accession number Среда обитания, место изоляции Habitat Источник Reference
Uncultured bacterium clone GBII-35 GQ441307 Там же Same -
Uncultured bacterium clone GBII-15 GQ441289 Там же Same -
Uncultured bacterium clone GBII-24 GQ441296 Там же Same -
Uncultured cyanobacterium clone LiUU-11-427.2 HQ386384 Озеро, Швеция Lake, Sweden -
Oscillatoria neglecta IAM M-82, NIES-2116 AB003168 Пресноводный, Япония (?) Freshwater, Japan (?) Honda et al., 1999
Uncultured Leptolyngbya sp. clone EHFS1 S05b EU071483 Чистые комнаты Европейского космического научно-технического центра ESTEC, Голландия Clean rooms of European Space Research and Technology Centre (ESTEC), Netherlands
Nodosilinea cf. nodulosa LEGE 10377 JQ927349 Морские губки, Португалия Marine sponges, Portugal
Leptolyngbya antarctica ANT.LAC.1 AY493588 Бентосные озерные микробные маты, Антарктида Benthic lacustrine mi-crobial mats, Antarctica Taton et al., 2006
Uncultured cyanobacterium clone Alchichica AL31_2_1B_140 JN825335 Щелочное озеро, Мексика Alkaline lake, Mexico Couradeau et al., 2011
Uncultured cyanobacterium clone Alchichica AL67 2 1B202 JN825336 Там же Same Couradeau et al., 2011
Uncultured cyanobacterium clone T-05_20 KP793943 Гейзер, Чили Geyser, Chile -
Uncultured cyanobacterium clone T-05_10 KP793940 Там же Same -
Uncultured cyanobacterium clone T075-A_1 KP793930 Там же Same -
Uncultured cyanobacterium clone T-05_9 KP793939 Там же Same -
Uncultured bacterium clone DP10.3.47 FJ612388 Озеро, Китай Lake, China -
Продолжение табл. 2
Название таксона в GenBank Taxon name in GenBank Штамм Strain Номер в GenBank GenBank Accession number Среда обитания, место изоляции Habitat Источник Reference
Nodosilinea sp. CENA515 KF246482 Щелочное озеро, Бразилия Alkaline lake, Brazil Andreote et al, 2014
Nodosilinea sp. CENA523 KF246490 Там же Same Andreote et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA512 KF246481 Там же Same Andreote et al., 2014
Nodosilinea sp. CENA522 KF246489 Там же Same Andreote et al., 2014
Leptolyngbya sp. KIOST-1 JX401929 Озеро, Южная Корея Lake, South Korea -
Uncultured cya-nobacterium clone R8-R56 DQ181691 Микробный мат из озера, Антарктида Microbial mat from lake, Antarctica
Uncultured cya-nobacterium clone A132 DQ181668 Там же Same -
Nodosilinea bijugata PACC 8602 KF770966 Река, Болгария River, Bulgaria -
Uncultured bacterium clone SINH475 HM128037 Гипергалинное озеро, Китай Hypersaline lake, China Zhang et al., 2013
Uncultured bacterium clone GBII-87 GQ441350 Микробный мат с песчаного пляжа, Нидерланды Microbial mat from sandy beach, Netherlands
Nodosilinea epilithica ACSSI 34 Каштановая почва, Волгоградская обл., Россия Chestnut soil, Volgograd Region, Russia Ориг. Original
Halomicronema excentricum (T) TFEP1* AF320093 Микробный мат из пруда, Израиль Microbial mat from a pond, Israel Abed et al., 2002
Prochlorothrix hollandica (T) AJ007907 - -
Prochlorothrix hollandica (T) AF132792 - -
Примечание. (Т) — типовой вид рода, * — аутентичный штамм; прочерк (-) означает отсутствие данных.
Note. (T) — type species of the genus, * — authentic strain; dash (-)—missing data.
Результаты и обсуждение
Nodosilinea epilithica Perkerson et Casamatta, 2011, J. Phycol. 47(6): 1397.
Морфология штамма ACSSI 34. Нити длинные, прямые, часто с плотно свернутыми, компактными или рыхлыми, диффузно переплетенными узелками (табл. I, a, b). В основном нити одиночные, редко скрученные друг вокруг друга в виде жгутов (табл. I, c, d). Ветвление не отмечено. Чехлы тонкие, бесцветные, иногда расширяющиеся и расплывающиеся. Размножение гормогониями, которые свободно выходят из открытых на концах чехлов (табл. I, e). Обычно в одном чехле присутствует один, иногда два трихома. Трихомы 1.5-2.0 мкм шир., отчетливо перешнурованные, некридии и меристематические зоны отсутствуют. Клетки бочонковидные, как правило, до 3.0 мкм дл., часто с 1 или 2 гранулами у поперечных перегородок (табл. I, f). Терминальные клетки закругленные, сходные по морфологии с ин-теркалярными. Колонии ярко-сине-зеленого цвета, плохо снимаются с поверхности агара.
Интересной особенностью данного штамма явилась способность образовывать узелки в условиях нормальной освещенности (60-75 мкмоль фотонов • м-2 • с-1), в то время как ранее описанные штаммы формировали узелки при низкой освещенности: 4-6 мкмоль фотонов • м-2 • с-1 и ниже (Li, Brand, 2007; Perkerson et al., 2011), причем при перемещении их в условия с освещенностью 60 мкмоль фотонов • м-2 • с-1 узелки исчезали в течение 1-2 недель (Li, Brand, 2007). По нашим наблюдениям, возможно, количество узелков связано не с уровнем освещенности, а с возрастом цианобактериальной культуры. Так, узелки встречались единично в молодой двухнедельной культуре, но их количество значительно увеличивалось в старой культуре (3 месяца и более). Функция этих структур до сих пор не установлена, но одним из предположений было их участие в азотфиксации (Li, Brand, 2007). Этой ролью узелков может объясняться увеличение их количества при длительном культивировании цианобактериального штамма, когда запасы доступного азота в культуральной среде исчерпаны. Гипотеза требует дальнейшего подтверждения.
Молекулярно-филогенетический анализ рода Nodosilinea. Все культивируемые штаммы и некультивируемые цианобактерии из образцов окружающей среды, предварительно отобранные из генетического банка данных, образовали монофилетичную кладу с максимальной статистической поддержкой (рис.). Таксономически она была отнесена к роду Nodosilinea, в который вошли цианобактерии,
первоначально описанные как виды родов Leptolyngbya, Phormidium Ktitz. ex Gomont, Oscillatoria Vaucher ex Gomont и собственно Nodosilinea. Значительная часть нуклеотидных последовательностей клады принадлежала к так называемым некультивируемым циано-бактериям из природных проб. Однако большинство исследователей, как правило, и не пытаются выделить микроорганизмы из таких образцов, используя для определения таксономического разнообразия метод клоновых библиотек или метагеномный анализ и a priori определяя их как некультивируемые. В случае с Nodosilinea выделение и культивирование штаммов не вызывает трудностей: цианобактерии легко переходят из субстрата в накопительные смешанные культуры, а затем в монокультуры на питательных средах (Z-8, BG11). Несмотря на то что представители рода широко распространены в экосистемах всего земного шара (табл. 2), формирование внутри клады групп в зависимости от среды обитания и географического распространения цианобактерий не наблюдалось. Тем не менее, отметим, что многие штаммы Nodosilinea были изолированы из щелочных и соленых условий.
По данным анализа 16S рРНК гена исследуемый штамм являлся представителем рода Nodosilinea, внутри которого устойчиво группировался с аутентичным штаммом N. epilithica (рис.). Генетические различия между штаммом ACSSI 34 и N. epilithica Kovâcik 1998/7 составили всего 0.4 %, в то время как с другими штаммами Nodosilinea — от 1.1 до 3.9 %. В целом, внутри рода генетические различия варьировали до 6.3 %. Межродовые генетические дистанции были на уровне 6.6-8.6 % при сравнении сестринских видов родов Nodosilinea и Halomicronema, 8.0-9.9 % при сравнении Nodosilinea и Prochlorothrix, 9.1-9.2 % при сравнении видов Prochlorothrix и Halomicronema. Уровень генетических различий внутри рода Nodosilinea позволяет прогнозировать большой потенциал для открытия новых видов. Об этом же косвенно свидетельствует эврибионтность представителей рода, которые были изолированы из проб воздуха, пресных и морских вод, почвенных образцов и аэрофитных субстратов различных стран (табл. 2). Но, так как основная доля штаммов на филогенетическом дереве рода не объединялась в группы с высокой или умеренной статистической поддержкой, можно предположить, что для установления видовых границ следует использовать более вариабельный, чем ген 16S рРНК, молекулярный маркер, например регион 16S-23S ITS (Perkerson et al., 2011). Однако следует подчеркнуть, что выбор маркера для молекулярно-генетиче-ской идентификации организмов в первую очередь определяется воз-
можностью сравнить собственные данные с референсными нукле-отидными последовательностями, т. е. наличием выбранных генов или спейсеров в генетических базах данных.
Рис. Укорененное филогенетическое дерево цианобактерий рода Nodosi-linea, построенное методом максимального правдоподобия (ML), на основе последовательностей гена 16S рРНК (1427 п. н.).
Примечание. В качестве статистической поддержки узлов дерева указаны бут-стреп-значения ML; значения < 70 % не показаны. Модель нуклеотидных замен: GTR+I+G. Жирным шрифтом выделены типовые виды, звездочкой (*) — аутентичные штаммы.
The rooted phylogenetic tree of Nodosilinea cyanobacterial genus constructed by maximal likelihood method (ML) based on 16S rRNA gene sequence data
(1427 bp).
Note. Node support of the tree is given as ML bootstrap values; values < 70 % are not shown. Model of nucleotide changes is GTR+I+G. Type species are marked by a bold font, authentic strains — by an asterisk (*).
Заключение
Сравнительный анализ последовательностей фрагмента гена 16S рРНК подтвердил принадлежность штамма ACSSI 34 к виду N. epilithica. По морфологии изученный штамм не отличался от аутентичного штамма N. epilithica Kovácik 1998/7, но был способен формировать узелки в условиях нормальной освещенности (60— 75 мкмоль фотонов • м-2 • с-1). При этом количество узелков значительно увеличивалось в старой культуре (3 месяца и более). Этот факт, возможно, связан с участием узелков в азотфиксации, но требует дальнейшего подтверждения. Таким образом, впервые на территории России был обнаружен вид N. epilithica, изолированный из фоновой каштановой почвы Волгоградской области. Также это вторая находка представителей рода Nodosilinea в России, достоверно подтвержденная и морфологическим, и молекулярно-генетическим анализом.
Благодарности
Авторы выражают признательность к. б. н., с. н. с. лаборатории археологического почвоведения ИФХиБПП М. В. Ельцову за организацию полевой экспедиции и помощь в отборе почвенных проб.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60020 мол_а_дк.
Литература
Abed R. M. M., Garcia-Pichel F., Hernández-Mariné M. 2002. Polyphasic characterization of benthic, moderately halophilic, moderately thermophilic cyanobacteria with very thin trichomes and the proposal of Halomicronema excentricum gen. nov., sp. nov. Arch. Microbiol. 177: 361-370. Andreote A. P. D., Vaz M. G. M. V., Genuário D. B., Barbiero L., Rezende-Filho A. T., Fiore M. F. 2014. Nonheterocytous cyanobacteria from Brazilian saline-alkaline lakes. J. Phycol. 50: 675-684. doi: 10.1111/jpy.12192 Anagnostidis K., Komárek J. 1988. Modern approach to the classification system of
cyanophytes. 3. Oscillatoriales. Arch. Hydrobiol. / Algol. Stud. 80: 327-472. [Bioraznoobrazie...] Биоразнообразие водных и наземных экосистем бассейна реки Кожым (северная часть национального парка «Югыд ва»). 2010. Сыктывкар: 192 с.
Castiglioni B., Rizzi E., Frosini A., Sivonen K., Rajaniemi P., Rantala A., Mugnai M. A., Ventura S., Wilmotte A., Boutte C., Grubisic S., Balthasart P., Consolandi C., Bordoni R., Mezzelani A., Battaglia C., De Bellis G. 2004. Development of a universal microarray based on the ligation detection reaction and 16S rRNA gene polymorphism to target diversity of cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70: 7161-7172.
Chong C. W., Convey P., Pearce D. A., Tan I. K. P. 2012. Assessment of soil bacterial communities on Alexander Island (in the maritime and continental Antarctic transitional zone). Polar. Biol. 35: 387-399. doi: 10.1007/s00300-011-1084-0
Couradeau E., Benzerara K., Moreira D., Gérard E., Kazmierczak J., Tavera R., López-García P. 2011. Prokaryotic and eukaryotic community structure in field and cultured microbialites from the alkaline Lake Alchichica (Mexico). PLoS One. 6(12): e28767. doi: 10.1371/journal.pone.0028767
Cuzman O. A., Ventura S., Sili C., Mascalchi C., Turchetti T., D'Acqui L. P., Tiano P.
2010. Biodiversity of phototrophic biofilms dwelling on monumental fountains. Microb. Ecol. 60: 81-95.
Dojani S., Kauff F., Weber B., Büdel B. 2014. Genotypic and phenotypic diversity of cyanobacteria in biological soil crusts of the Succulent Karoo and Nama Karoo of southern Africa. Microb. Ecol. 67: 286-301.
[Fedorov] Федоров В. Г. 2011. О цианобактериях водоемов Омской области. Альманах современной науки и образования. 8(51): 102-107.
Flechtner V. R., Boyer S. L., Johansen J. R., DeNoble M. L. 2002. Spirirestis rafaelensis gen. et sp. nov. (Cyanophyceae), a new cyanobacterial genus from arid soils. Nova Hedwigia. 74: 1-24.
Guiry M. D., Guiry G. M. 2016. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org
Honda D., Yokota A., Sugiyama J. 1999. Detection of seven major evolutionary lineages in cyanobacteria based on the 16S rRNA gene sequence analysis with new sequences of five marine Synechococcus strains. J. Mol. Evol. 48(6): 723-739.
Komárek J., Kastovsky J., Mares J., Johansen J. R. 2014. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86: 295-335.
[Komulaynen et al.] Комулайнен С. Ф., Чекрыжева Т. А., Вислянская И. Г. 2006. Альгофлора озер и рек Карелии. Таксономический состав и экология. Петрозаводск: 81 с.
Li Z., Brand J. 2007. Leptolyngbya nodulosa sp. nov. (Oscillatoriaceae), a subtropical marine cyanobacterium that produces a unique multicellular structure. Phycologia. 46(4): 396-401.
Lopes V. R., Ramos V., Martins A., Sousa M., Welker M., Antunes A., Vasconcelos V. M. 2012. Phylogenetic, chemical and morphological diversity of cyanobacteria from Portuguese temperate estuaries. Mar. Environ. Res. 73: 7-16. doi: 10.1016/j. marenvres.2011.10.005
[Patova] Патова Е. Н. 1995. Почвенные азотфиксирующие водоросли в фитоце-нозах Большеземельской тундры. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб.: 21 с.
Perkerson R. B. III, Johansen J. R., Kovácik L., Brand J., Kastovsky J., Casamatta D. A.
2011. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data. J. Phycol. 47(6): 1397-1412. doi: 10.1111/j.1529-8817.2011.01077.x
Samylina O. S., Sapozhnikov F. V., Gainanova O. Yu., Ryabova A. V., Nikitin M. A., So-rokin D. Yu. 2014. Algo-bacterial communities of the Kulunda steppe (Altai Region, Russia) Soda Lakes. Microbiol. 83(6): 849-860. doi: 10.1134/S0026261714060162
[Shargaeva et al.] Шаргаева О. В., Цыренова Д. Д., Бархутова Д. Д. 2012. Разнообразие цианобактерий гидротерм Баунтовской группы (Северное Забайкалье). Актуальные аспекты современной микробиологии: Сборник тез. VIII Молодежной школы-конф. с междунар. участием. М.: 96-98.
Siegesmund M. A., Johansen J. R., Karsten U., Friedl T. 2008. Coleofasciculus gen. nov. (Cyanobacteria): morphological and molecular criteria for revision of the genus Microcoleus Gomont. J. Phycol. 44: 1572-1585. doi: 10.1111/j.1529-8817.2008.00604.x
Silva C. S. P., Genuário D. B., Vaz M. G. M. V., Fiore M. F. 2014. Phylogeny of cul-turable cyanobacteria from Brazilian mangroves. Syst. Appl. Microbiol. 37: 100112.
Strunecky O., Elster J., Komárek J. 2010. Phylogenetic relationships between geographically separate Phormidium cyanobacteria: is there a link between north and south polar regions? Polar Biol. 33: 1419-1428. doi: 10.1007/s00300-010-0834-8
Taton A., Grubisic S., Ertz D., Hodgson D. A., Piccardi R., Biondi N., Tredici M. R., Mainini M., Losi D., Marinelli F., Wilmotte A. 2006. Polyphasic study of Antarctica cyanobacterial strains. J. Phycol. 42: 1257-1270. doi: 10.1111/j.1529-8817.2006.00278.x
[Yarushina et al.] Ярушина М. И., Танаева Г. B., Еремкина Т. В. 2004. Флора водорослей водоемов Челябинской области. Екатеринбург: 308 с.
Zhang R., Wu Q., Piceno Y. M., Desantis T. Z., Saunders F. M., Andersen G. L., Liu W. T. 2013. Diversity of bacterioplankton in contrasting Tibetan lakes revealed by high-density microarray and clone library analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 86(2): 277-287. doi: 10.1111/1574-6941.12160
References
Abed R. M. M., Garcia-Pichel F., Hernández-Mariné M. 2002. Polyphasic characterization of benthic, moderately halophilic, moderately thermophilic cyanobacteria with very thin trichomes and the proposal of Halomicronema excentricum gen. nov., sp. nov. Arch. Microbiol. 177: 361-370.
Andreote A. P. D., Vaz M. G. M. V., Genuário D. B., Barbiero L., Rezende-Filho A. T., Fiore M. F. 2014. Nonheterocytous cyanobacteria from Brazilian saline-alkaline lakes. J. Phycol. 50: 675-684. doi: 10.1111/jpy.12192
Anagnostidis K., Komárek J. 1988. Modern approach to the classification system of cyanophytes. 3. Oscillatoriales. Arch. Hydrobiol. / Algol. Stud. 80: 327-472.
Bioraznoobrazie vodnykh i nazemnykh ekosistem basseyna reki Kozhym (severnaya chast natsionalnogo parka «Yugyd-va») [Biodiversity of water and terrestrial ecosystems of Kozhym River basin (northern part of National Park «Jugyd Va»)]. 2010. Syktyvkar: 192 p. (In Russ.).
Castiglioni B., Rizzi E., Frosini A., Sivonen K., Rajaniemi P., Rantala A., Mugnai M. A., Ventura S., Wilmotte A., Boutte C., Grubisic S., Balthasart P., Consolandi C., Bordoni R., Mezzelani A., Battaglia C., De Bellis G. 2004. Development of a universal microarray based on the ligation detection reaction and 16S rRNA gene polymorphism to target diversity of cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70: 7161-7172.
Chong C. W., Convey P., Pearce D. A., Tan I. K. P. 2G12. Assessment of soil bacterial communities on Alexander Island (in the maritime and continental Antarctic transitional zone). Polar. Biol. 35: 387-399. doi: 1G.1GG7/sGG3GG-G11-1G84-G
Couradeau E., Benzerara K., Moreira D., Gérard E., Kazmierczak J., Tavera R., López-García P. 2G11. Prokaryotic and eukaryotic community structure in field and cultured microbialites from the alkaline Lake Alchichica (Mexico). PLoS One. 6(12): e28767. doi: 1G.1371/journal.pone.GG28767
Cuzman O. A., Ventura S., Sili C., Mascalchi C., Turchetti T., D'Acqui L. P., Tiano P. 2G1G. Biodiversity of phototrophic biofilms dwelling on monumental fountains. Microb. Ecol. 6G: 81-95.
Dojani S., Kauff F., Weber B., Büdel B. 2G14. Genotypic and phenotypic diversity of cyanobacteria in biological soil crusts of the Succulent Karoo and Nama Karoo of southern Africa. Microb. Ecol. 67: 286-3G1.
Fedorov V. G. 2G11. O tsianobakteriyakh vodoemov Omskoy oblasti [Cyanobacteria of waterbodies of the Omsk Region]. Almanakk sovremennoy nauki i obrazovaniya. 8(51): 1G2-1G7. (In Russ.).
Flechtner V. R., Boyer S. L., Johansen J. R., DeNoble M. L. 2GG2. Spirirestis rafaelensis gen. et sp. nov. (Cyanophyceae), a new cyanobacterial genus from arid soils. Nova Hedwigia. 74: 1-24.
Guiry M. D., Guiry G. M. 2G16. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org
Honda D., Yokota A., Sugiyama J. 1999. Detection of seven major evolutionary lineages in cyanobacteria based on the 16S rRNA gene sequence analysis with new sequences of five marine Synechococcus strains. J. Mol. Evol. 48(6): 723739.
Komárek J., Kastovsky J., Mares J., Johansen J. R. 2G14. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2G14, using a polyphasic approach. Preslia. 86: 295-335.
Komulaynen S. F., Chekryzheva T. A., Visljanskaja I. G. 2GG6. Algoflora ozer i rek Karelii. Taksonomickeskiy sostav i ekologiya [Algoflora of Karelian lakes and rivers. Taxonomy and ecology]. Petrozavodsk: 81 p. (In Russ.).
Li Z., Brand J. 2GG7. Leptolyngbya nodulosa sp. nov. (Oscillatoriaceae), a subtropical marine cyanobacterium that produces a unique multicellular structure. Pkycologia. 46(4): 396-4G1.
Lopes V. R., Ramos V., Martins A., Sousa M., Welker M., Antunes A., Vasconcelos V. M. 2G12. Phylogenetic, chemical and morphological diversity of cyanobacteria from Portuguese temperate estuaries. Mar. Environ. Res. 73: 7-16. doi: 1G.1G16/j. marenvres.2G11.1G.GG5
Patova E. N. 1995. Pockvennye azotfiksiruyuskckie vodorosli v fitotsenozakk Bolske-zemelskoy tundry. Avtoref. kand. diss. [The soil nitrogen-fixing algae in the phyto-cenoses of the Bolshezemelskaya tundra. Abstr. Cand. Diss.]. St. Petersburg: 21 p. (In Russ.).
Perkerson R. B. III, Johansen J. R., Kovácik L., Brand J., Kastovsky J., Casamatta D. A. 2G11. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data. J. Pkycol. 47(6): 1397-1412. doi: 1G.1111/j.1529-8817.2G11.G1G77.x
Samylina O. S., Sapozhnikov F. V., Gainanova O. Yu., Ryabova A. V., Nikitin M. A., So-rokin D. Yu. 2014. Algo-bacterial communities of the Kulunda steppe (Altai Region, Russia) Soda Lakes. Microbiol. B3(6): B49-B60. doi: 10.1134/S0026261714060162
Shargaeva O. V., Tsyrenova D. D., Barkhutova D. D. 2012. The diversity of the Bauntovsky group (Northern Transbaikal) hydrotherms cyanobacteria Aktualnye aspekty sovremennoy mikrobiologii: Sbornik tezisov VIIIMolodezhnoy shkoly-kon-ferentsii s mezhdunarodnym uchastiem. Мoscow: 96-9B. (In Russ.).
Siegesmund M. A., Johansen J. R., Karsten U., Friedl T. 200B. Coleofasciculus gen. nov. (Cyanobacteria): morphological and molecular criteria for revision of the genus Microcoleus Gomont. J. Phycol. 44: 1572-15B5. doi: 10.1111/j.1529-BB17.200B.00604.x
Silva C. S. P., Genuário D. B., Vaz M. G. M. V., Fiore M. F. 2014. Phylogeny of cultur-able cyanobacteria from Brazilian mangroves. Syst. Appl. Microbiol. 37: 100-112.
Strunecky O., Elster J., Komárek J. 2010. Phylogenetic relationships between geographically separate Phormidium cyanobacteria: is there a link between north and south polar regions? Polar Biol. 33: 1419-142B. doi: 10.1007/s00300-010-0B34-B
Taton A., Grubisic S., Ertz D., Hodgson D. A., Piccardi R., Biondi N., Tredici M. R., Mainini M., Losi D., Marinelli F., Wilmotte A. 2006. Polyphasic study of Antarctica cyanobacterial strains. J. Phycol. 42: 1257-1270. doi: 10.1111/j.1529-BB17.2006.0027B.x
Yarushina M. I., Tanaeva G. V., Eremkina T. V. 2004. Flora vodorosley vodoyemov Chelyabinskoy oblasti [Algal Flora of waterbodies of the Chelyabinsk Region]. Ekaterinburg: 30B p. (In Russ.).
Zhang R., Wu Q., Piceno Y. M., Desantis T. Z., Saunders F. M., Andersen G. L., Liu W. T. 2013. Diversity of bacterioplankton in contrasting Tibetan lakes revealed by high-density microarray and clone library analysis. FEMS Microbiol. Ecol. B6(2): 277-2B7. doi: 10.1111/1574-6941.12160
Таблица I. Рисунки и фотографии цианобактерии Nodosilinea epilithica
ACSSI 34.
a — формирование узелка (двухнедельная культура); b — формирование узелков (трехмесячная культура); c — переплетение трихомов; d — трихомы; e — морфология и деление трихомов, образование гормогониев; f — париетальное расположение тилакоидов и наличие гранул у поперечных перегородок. Масштабная
линейка: 10 мкм.
The pictures and photos of the cyanobacterium Nodosilinea epilithica ACSSI 34. a — nodule formation (2-week-old culture); b — nodule formation (3-month-old culture); c — trichome interlacement; d — trichomes; e — morphology and trichome division, hormogonia production; f — parietal thylakoid arrangement and appearance of granules at the cross walls. Scale bar: 10 ^m.
