CC BY
31A NEW STRAIN OF FILAMENTOUS CYANOBACTERIA AS A PROMISING OBJECT OF
BIOTECHNOLOGY
Galperina A.
Candidate of Biological Sciences, assistant professor, Departmant of applied biology and microbiology, Astrakhan State Technical University
Soprunova O. Doctor of Biological Sciences, professor, Departmant of applied biology and microbiology, Astrakhan State Technical University
Eremeeva S.
Candidate of Biological Sciences, assistant professor, Departmant of applied biology and microbiology, Astrakhan State Technical University
НОВЫЙ ШТАММ НИТЧАТЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ОБЪЕКТ
БИОТЕХНОЛОГИЙ
Гальперина А.Р.
к.б.н., доцент кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет»
Сопрунова О.Б.
д.б.н., профессор кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет»
Еремеева С.В.
к.б.н., доцент кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет»
Abstract
This article presents data on the isolation, examination and identification of a new strain of filamentous cya-nobacteria. Morphological features of strain were considered, photosynthetic pigments and exopolysaccharides were quantified, the optimum conditions of cultivation were determined. Strain of cyanobacteria on the totality of morphological, physiological and phylogenetic characteristics identified as Leptolyngbya sp SK. Аннотация
В статье приводятся данные по выделению, изучению и идентификации нового штамма нитчатых ци-анобактерий. Рассмотрены морфологические особенности штамма, приведены результаты определения количественного содержания фотосинтетических пигментов и экзополисахаридов, установлены оптимальные условия культивирования. Штамм цианобактерий по совокупности морфологических, физиологических и филогенетических признаков идентифицирован как Leptolyngbya sp SK.
Keywords: cyanobacteria, algological pure culture, Leptolyngbya
Ключевые слова: цианобактерии, альгологически чистая культура, Leptolyngbya
Цианобактерии являются древнейшими организмами на планете, возраст которых определяется около 3,5 млрд. лет. Они широко распространены в почвах всех типов, морских и пресных экосистемах; успешно развиваются и растут на коре деревьев, на скалах в расщелинах камней; способны оказывать интенсивное влияние на кислородный режим почв и водоемов [1, с. 18].
Обладающие уникальным для прокариот окси-генным типом фотосинтеза, цианобактерии относятся к Х филе домена Bacteria. Особенным является и их таксономический статус, рассматриваемый как ботанический, так и бактериологический. Долгое время главенствовала альгологическая система, основанная на морфологических признаках непосредственно анализируемого или зафиксированного природного материала. Бактериологический подход использует живые культуры и учитывает морфологические, ультраструктурные, физио-лого-биохимические и молекулярно-
биологические признаки, а также культуральные свойства лабораторных штаммов [2, с. 25].
Вместе с тем, для определения видового состава цианобактерий, встречающихся в составе сообществ, недостаточно сведений о морфологических и культуральных признаках, поскольку они часто перекрываются и сильно варьируют. Точная таксономическая идентификация возможна только на основании анализа 16 S рРНК [3, с. 42].
Целью исследований являлось определение таксономического положения альгологически чистого штамма цианобактерий по морфологическим и филогенетическим признакам.
Материалы и методы исследований. Исследуемую альгологически чистую культуру получали из циано-бактериального сообщества, длительное время культивировавшегося в лабораторных условиях. Штамм нитчатых цианобактерий выделен и очищен пересевом на 1% агаризованную среду BG-11.
Для изучения морфологии клеток цианобакте-рий использовали микроскоп люминесцентный ЛЮМАМ РПО-11. Микрофотографии получали камерой Digital camera for Microscope DCM510 с по-
мощью программы ScopePhoto 3.0; измерение клеток проводили с использованием этой же программы.
Содержание фотосинтетических пигментов в клетках исследуемых цианобактерий определяли колориметрическим методом. Экстракцию хлорофилла а и каротиноидов проводили 70% этиловым спиртом. Для определения концентраций пигментов в вытяжке использовали формулы Вернона [4, с. 1148] и Виттштейна [5, с. 429].
Фикобилипротеиды - фикоцианин, аллофико-цианин и фикоэритрин экстрагировали фосфатным буфером с применением 6-ти кратного замораживания. Концентрацию фикобилипротеинов рассчитывали по формулам Сигелмана и Кайси [6, с. 74].
Выделение экзополисахаридов из культураль-ной среды проводили с помощью этанола. Концентрацию экзополисахаридов определяли фенол-сернокислым методом [7, с. 352].
ДНК из накопительной культуры выделяли стандартным методом [8, с. 128] (Меркель Александр Юрьевич, ООО «БиоСпарк», Москва). Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе Mastercycler nexus (Eppendorf, Германия). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Праймеры разработаны с использованием программы OligoReport (K.E. Ashelford, неопубликовано) и базы данных RDP. Специфичность пар праймеров
была оценена с использованием программы OligoCheck (K.E. Ashelford, неопубликовано) и базы данных ARB-SILVA. ПЦР продукты были се-квенированы с использованием коммерческого кита Big Dye Terminator v.3.1 на автоматическом се-квенаторе ABI 3730 (Applied Boisystems, США), следуя инструкциям производителя. Анализ чистоты полученных последовательностей нуклеоти-дов и их первичное редактирование проводилось в программе Chromas Lite 2.01
(http://www.technelysium.com.au). Объединение последовательностей, полученных с помощью различных праймеров в контиги, проводилась в программе BioEdit 7.0.9.0.
Результаты и обсуждение. Выделенная культура поддерживается в лабораторных условиях при комнатной температуре и постоянном освещении с 2007 года. Контроль чистоты культуры проводят микроскопическими методами каждые 6 месяцев.
Исследуемая культура представлена нитчатыми цианобактериями (штамм SK). Штамм SK растет в жидкой среде в виде пленок, плотных кожистых тяжей ярко-зеленого цвета, способен образовывать дерновинки. При выращивании на твердых средах наблюдается стелющийся рост пучков трихомов. В тяже трихомы плотно склеены между собой и расположены упорядоченно, иногда образуя округлые завитки из пучков трихомов (рис. 1).
Рис. 1 Завиток, образованный пучком трихомов в тяже (световая микроскопия). Увеличение х1500
Трихомы от прямых до слабо волнистых. Клетки в трихоме цилиндрические, в длину больше чем в ширину, размер клеток 1,6-2,3 мкм в длину и 1,5-1,8 мкм в ширину, между ними имеются пере-
тяжки. Чехлы вокруг тонкие или отсутствуют. Конечная клетка трихома закругленная, без калиптры. Газовые вакуоли отсутствуют. Клеточная стенка грамотрицательного типа (рис.2)
Рис. 2 Морфология клеток штамма SK: а) световая микроскопия, окрашенного по способу Грама препарата клеток; б) световая микроскопия. Увеличение *1500
В последнее время большое внимание привлекает к себе пигментный комплекс цианобактерий. Соотношение содержания фотосинтетических пигментов, особенно в условиях стрессового воздействия, позволяет, прежде всего, получить информацию о физиологическом состоянии цианобактерий. Кроме этого, многие пигменты являются ценными продуктами, применяемыми в различных областях [9, с. 78; 10, с. 516].
Содержание хлорофилла а в исследуемом штамме цианобактерий составило 0,223 мг/г сырой биомассы, каротиноидов - 0,086 мг/г сырой биомассы. Количество фикобилипротеинов в изучаемой культуре цианобактерий составило: фикоциа-нина - 0,18 мг/г сырой биомассы; аллофикоцианина - 0,093 мг/г сырой биомассы; фикоэритрина - 0,04 мг/г сырой биомассы.
Свойством большинства видов цианобактерий является присутствие слизистых поверхностных структур, состоящих, в основном, из экзополисаха-ридов. Экзополисахаридам цианобактерий в последнее время уделяется повышенное внимание, в частности, в связи с возможностью их применения в экобиотехнологии [11, с. 20; 12, с. 453].
Удельное содержание полисахаридов, экскре-тируемых штаммом SK при плотности культуры 1 г/л сухой биомассы, составило 0,126 г глюкозных единиц в расчете на 1 г сухой биомассы.
На рост, развитие, физиолого-биохимические функции цианобактерий оказывает влияние целый ряд факторов [9, с. 79]
При изучении влияния абиотических факторов на исследуемый штамм цианобактерий в качестве факторов воздействия использовали: продолжительность освещения и продолжительность дополнительной аэрации. Содержание остальных компонентов ферментационной среды оставалось постоянным. Оценивали рост и развитие цианобактерий по культуральным, морфологическим и физиологическим признакам: накоплению биомассы, количественному содержанию фотосинтетических пигментов.
Установлено, что культивирование в условиях периодического освещения (12 ч в сутки), а также
темновые условия приводит к значительному угнетению роста цианобактерий. Тяжи приобретают коричневую, желтую или светло-зеленую окраску. Наблюдается снижение количества биомассы и фотосинтетических пигментов. Принудительная аэрация в условиях постоянной освещенности угнетает синтез хлорофилла а на 29%; а в темновых условиях - способствует некоторому увеличению хлорофилла а, по сравнению с культивированием без аэрации. При культивировании в условиях круглосуточной освещенности с применением аэрации наблюдается образование пленок, а так же скоплений биомассы. Нити цианобактерий расположены в скоплениях беспорядочно, в некоторых областях наблюдается разобщенность трихом. Культивирование в условиях постоянного освещения без аэрации способствует максимальному приросту биомассы (на 1,45 г/100мл), а также максимальному синтезу хлорофилла а и других фотосинтетических пигментов. Таким образом, установлено, что культивирование в стационарных условиях при постоянном освещении является оптимальным для роста и развития исследуемого штамма цианобактерий.
Для идентификации штамма SK проведено частичное секвенирование последовательности гена 16S рРНК. В результате филогенетического анализа полученной последовательности выявлено, что штамм относится к роду Leptolyngbya порядка Oscillatoriales класса Oscillatoriophycideae филума Cyanobacteria домена Bacteria.
Последовательность штамма Leptolyngbya sp SK имела высокий процент гомологии (99%) с последовательностями штаммов Leptolyngbya sp. LEGE 06070 и Leptolyngbya sp. LEGE 07319, выделенных из эстуарий рек Дуэро (Leptolyngbya sp. LEGE 06070) и Вога (Leptolyngbya sp. LEGE 07319), Португалия [13, с. 15].
Таким образом, из состава циано-бактериаль-ного сообщества длительное время культивировавшегося в лабораторных условиях выделена альго-логически чистая культура. Исследуемая культура по совокупности морфологических, физиологических и филогенетических признаков идентифицирована как Leptolyngbya sp. SK.
Изучены некоторые морфологические и физиологические особенности культуры и выявлен ряд перспективных с точки зрения экобиотехноло-гии свойств.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Кондратьева Е.Н., Максимова И.В., Самуилов В.Д. Фототрофные микроорганизмы. Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1989. 376 с.
2.Пиневич А.В. Парадоксы биоразнообразия, филогении и систематики цианобактерий // Вестник Московского Университета. Серия 16. Биология. - 2008. - №1. - С. 23-27.
3. Hoffman L., Komarek J., Kastovsky J. System of Cyanoprokaryotes (Cyanobacteria) - state in 2004 // Abstr. 16th Symposium of the International Association for Cyanophyte Research. Luxemburg. 2004. P. 42.
4. Vernon, L.P. Spectrophotometry determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts // Anal. Chemystry.- 1960/ - Vol.32. - p. 1144-1150.
5. Wettstein P. von Chlorofyll - letal und sub-miscipische Form wechsel der Plastiden // Exp. Cell Res. - 1957/ - V. 12, No4. - P.427 - 431.
6. Siegelman H.W., Kycia J.H Algal biliproteins // Handbook of phycologycal methods, physiological and biochemical methods / Ed. By Hellebust J.A.,Craigie J.S. - Cambridge: Cambridge University Press, 1978. -P. 72-78.
7.Dubois M., Gilles K.A, Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Calorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. 28: 350- 356.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., Мир, 1984, 480 с.
9. Фокина А.И., Огородникова С.Ю., Домра-чева Л.И., Лялина Е.И., Горностаева Е.А., Аших-мина Т.Я., Кондакова Л.В. Цианобактерии как тест-организмы и биосорбенты // Почвоведение. 2017. № 1. С. 77-85. DOI: 10.7868/S0032180X16110034
10. Bekasova O.D., Brekhovskikh A.A., Mos-kvina M.I. (2002). Participation of extracellular polysaccharides in detoxication of cadmium ions by cyanobacteria Nostoc muscorum // Biophysics. Vol.47. №3. P. 515-523 (in Russian).
11. Бреховских А.А. Защитные механизмы ав-тотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия. Aвтореф. дис......канд. биол. наук. Москва, 2006. 26 с.
12. Pereira S., Micheletti E., Zille A., Moradas-Ferreira A.S.P, Tamagnini P., De Philippis R. (2011). Using extracellular polymeric substances (EPS) - producing cyanobacteria for the bioremediation of heavy metals: do cations compete for the EPS functional groups and also accumulate inside the cell // Microbiology. Vol. 157. P. 451-458 DOI 10.1099/mic.0.041038-0)
13. Viviana R. Lopes, Vitor Ramos, António Martins, Marcos Sousa, Martin Welker, Agostinho An-tunes, Vítor M. Vasconcelos Phylogenetic, chemical and morphological diversity of cyanobacteria from Portuguese temperate estuaries // Marine Environmental Research. - 2012. - Volume 73. - Pages 7-16
