CC BY
45
|ение
рас-
иста
отри-
цали
Ьтон-
опре-
салия
1осле
рово-
жид-
анов-
акоп-
обез-овым Ьме-а, что
елен-
аков.
330Н6
; при виде-типа про-:рии, зстью ртен-лове-й по-
выде-
циро-
тит
fillus
;teria
атели
>рош-
рные
, дико-щевая
ависи-в суш-• № 1.
!С слив Шля-серви-Киши-
;чения агоме-,И. -
фоби-
щевая
, Дж.
637.146.25:576.852.22
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
В.И. ГАНИНА, А.М. ШАЛЫГИНА, Т.А. ГОРИНА,
Н.А. КАЛИНИНА, В.В. СУХОДОЛЕН
Московский государственный университет прикладной биотехнологии
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
В современном производстве биологически полноценных и экологически безопасных кисломолочных продуктов питания используют закваски и бактериальные концентраты, в состав которых входят штаммы рода Lactococcus.
Известно, что важные технологические свойства молочнокислых бактерий детерминируются на плазмидах [1, 2]. В мировой практике для получения высокопродуктивных штаммов лактококков используют геноинженерные методы селекции, основанные на глубоком генетическом исследовании природных штаммов. В молочной промышленности успешно применяют в качестве стартовых культур фагорезистентные штаммы; штаммы-продуценты антибиотиков; штаммы, продуцирующие ароматические вещества, полученные путем применения геноинженерных методов [3, 4J.
Однако в отечественной практике возникают трудности, связанные с нестабильностью свойств культур, входящих в состав заквасок и бактериальных концентратов, что приводит к снижению качества выпускаемой продукции.
Мешает развитию производства и слабая изученность молочнокислых бактерий как генетического объекта и отсутствие техники переноса генов между штаммами лактококков.
В связи с этим представляются перспективными разработка и применение генетических методов селекции с целью получения культур, стабильно сохраняющих комплекс требуемых биотехнологических свойств.
Характерным признаком мезофильных лактококков является высокий уровень нестабильности генома. Большое количество плазмид в клетках микроорганизмов стимулирует перестройку генетического материала, при этом происходят существенные изменения производственных свойств штаммов. С целью установления взаимосвязи биотехнологических свойств с плазмидным профилем культур была поставлена задача: исследовать биотехнологические свойства и плазмидный состав периодически пассируемых мезофильных лактококков.
Использовали пять штаммов мезофильных ароматообразующих лактококков — 97, 153, 17р 219, 325 и пять штаммов Lactococcus lactis subsp. cremoris — 309, 11, H-98, H-61, 52. В качестве питательных сред использовали стерильное молоко, среды на основе гидролизованного молока, М 21 в виде бульона или с добавлением 1,5% агар-агара.
Плазмидную ДНК получали по методу, описанному в работе [5]. Анализ плазмидной ДНК проводили электрофорезом в агарозном геле по стандартной методике. Культуры пассировали в течение года на стерильном обезжиренном молоке с пери-
одичностью один раз в 24 дня. Биотехнологические свойства штаммов — активность сквашивания молока, предел и энергию кислотообразования, органолептические показатели, синерезис образуемых молочных сгустков, микроскопический препарат
— изучали с использованием стандартных методов. Способность к продуцированию ароматических веществ находили по креатиновой пробе. Отношение к бактериофагам определяли по индексу фагоустойчивости
/ Ф^у — ~7Г" 100 %,
О
где К — количество бактериофагов, к которым устойчив данный штамм;
К0 — общее количество коллекционных бактериофагов.
В качестве воздействия на штаммы использовали повышенную температуру 40±ГС; химические вещества, в частности бромистый этидий; комбинированный метод — с повышенной температурой и бромистым этидием.
Исследования проводили в три этапа: изучение биотехнологических свойств и плазмидного профиля исходных штаммов, после различных воздействий и после пассажей в течение года.
Результаты первого этапа показали, что все изучаемые штаммы мезофильных лактококков являются типичными представителями последних. Штаммы мезофильных ароматообразующих лактококков имели активность сквашивания молока (при внесении 5% закваски) от 6 до 9 ч; предел кислотообразования 86-110°Т; энергию кислотообразования 66-94Т; синерезис образуемых сгустков 3,2-4,0 см3; индекс фагоустойчивости 94-100%; способность к продуцированию ароматических веществ на уровне 5-8 мин. Штаммы образовывали в молоке ровный плотный сгусток, иногда со следами газообразования. Вкус сгустков был чистым кисломолочным, с выраженным ароматом. Консистенция — структурированная. При микро-скопировании мазков наблюдали кокки, диплококки и короткие цепочки из них.
Биотехнологические свойства Ьас1ососси$ 1асЫз виЬзр. стетопз несколько отличались от свойств ароматообразующих штаммов. Активность сквашивания молока (при внесении 5% закваски) составляла от 5 до 7 ч; предел кислотообразования 76-104Т; энергия кислотообразования 60-80°Т; синерезис образуемых сгустков 0,4-2,2 см3; индекс фагоустойчивости 98-100%; способность к ароматообразованию у изучаемых штаммов не проявлялась. Все штаммы образовывали в молоке ровный плотный сгусток без отделения сыворотки. Вкус был чистым кисломолочным, сливочным без посторонних привкусов и запахов. Консистенция
— гомогенная, в меру вязкая. При просмотре мазков наблюдали диплококки и цепочки из них разной длины.
Таким образом, все изучаемые штаммы были типичными представителями мезофильных лактококков и обладали необходимым комплексом био-
технологических свойств, что позволяло бы их использовать для получения заквасок.
Плазмидные профили исходных штаммов: мезо-фильные ароматообразующие лактококки / — 17,;
2 — 21э; 3 — 153; 4 — 97; 5 — 325 (рис. 1) и Ьа^ососсиз 1аси& зиЬяр. сгетогьв 1 — 309; 2 — 11;
3 — Н-98; 4 — Н-61; 5 — 52 (рис. 2) отличаются количеством и размерами плазмид. У ароматообразующих лактококков присутствует дополнительно плазмида, детерминирующая свойство ароматооб-разования. Но даже штаммы, отнесенные к одному подвиду, отличаются составом плазмид. Так, штам-
мы
15,
219
17,
9
по
325 содержат от 3 Штаммы 17, и 97 имеют близкий плазмидный профиль. У штаммов сливочного лактококка в отличие от ароматообразующих было меньшее количество плазмид — от 3 до 4. Штаммы 11 и 30, содержали по три плазмиды, Н-98, Н-61, 52 четыре.
Установлено, что бактерии с близким составом плазмид имеют и близкие показатели активности сквашивания молока, индекса фагоустойчивости и продуцирования ароматических веществ.
В процессе пассажей штаммов довольно часто изменяются биотехнологические свойства, что может быть вызвано утратой определенных плазмид. С целью определения стабильности сохранения плазмид при действии дестабилизирующих факторов воздействовали на культуры повышенной температурой, бромистым этидием и комплексно — бромистым этидием и повышенной температурой. После этого вновь определяли плазмидный профиль и биотехнологические свойства. Результаты сравнительного анализа плазмидного профиля штаммов до и после воздействий подтвердили наши предположения, что не все культуры стабильно сохраняют состав плазмид: те из штаммов, которые изменили плазмидный профиль, изменили и биотехнологические свойства. Рассматривались три
группы культур: утратившие плазмиды при температурном воздействии — 325, 219 (1-я группа); утратившие плазмиды при комбинированном воздействии — 17,, 309, 11 (2-я группа); сохранившие плазмидный профиль — 153, 97, Н-98, Н-61, 52.
В течение года в процессе пассажей изучали биотехнологические свойства исходных штаммов
— представителей трех групп. Как показали исследования, изменились такие биотехнологические свойства культур, как синерезис, энергия и предел кислотообразования. Тем не менее, у штаммов, отнесенных к 3-й группе, колебания по этим показателям были наименьшими. По-разному изменились индекс фагоустойчивости и способность к ароматообразованию. У штаммов 325 и 21э утратилась способность к ароматообразованию и снизился индекс фагоустойчивости с 94 до 64% и с 98 до 72% соответственно. У штамма 17, уменьшились способность к ароматообразованию до 10 мин и индекс фагоустойчивости с 96 до 81 %, а у штаммов 30э и 11 последний снизился с 95 до 85% и с 98 до 93% соответственно. Штаммы 153, 97, Н-98, Н-61, 52 сохранили свойства на уровне исходных (показания отклонений находились в пределах допустимых погрешностей методов). По изменениям показателя фагоустойчивости ароматообразующих лактококков и Ьас{ососсиз 1ас11$ зиЫр. сгетош видно, что индекс фагоустойчивости снизился более резко (на 15-30%) у первых, чем у вторых (на 6-10%). Следовательно, штаммы, отнесенные к 3-й группе, стабильней сохраняли биотехнологические свойства в процессе пассажей в течение года.
Спустя год работы плазмидный профиль штаммов представлен на рис. 3 и 4. Анализируя плазмидный состав исходных штаммов после воздействий и года культивирования, можно сделать вывод, что штаммы 1-й и 2-й групп утратили часть плазмид: 219 и 325 — три, 309 — две, 11 и 17, — одну,
и темпе-группа); ром воз-шившие ■61, 52. ;изучали лтаммов али исс-•ические к предел
IT3MMOB,
им пока-измени-(НОСТЬ к ,утрати-снизил-I с 98 до ьшились [) мин и цтаммов [> и с 98 7, Н-98,
сходных пределах менени-)бразую-; subsp. :ти сни-с, чем у ямы, от-краняли ассажей
I штам-я плаз-здейст-вывод, ь плаз-- одну,
а штаммы 3-й группы сохранили плазмидный состав.
Следовательно, у штаммов, теряющих плазмиды при воздействии на них неблагоприятных факторов, это происходит при периодических пассажах в процессе культивирования. Штаммы, стабильно сохранившие состав плазмид при комбинированном воздействии, сохраняют их и в процессе пассажей.
Полученные результаты исследований свидетельствуют также о том, что у мезофильных лактококков в большей степени зависят от состава плазмидного профиля биотехнологические свойства (индекс фагоустойчивости, способность к аро-матообразованию), чем такие свойства, как сине-резис, энергия и предел кислотообразования. Это подтвердилось и полученными коэффициентами корреляции, показывающими зависимость между составом плазмидного профиля и свойствами штаммов.
Для получения заквасок со стабильными биотехнологическими свойствами были отобраны штаммы, стабильно сохраняющие плазмидный профиль.
Таким образом, штаммы, включаемые в состав заквасок, необходимо предварительно исследовать
на устойчивость сохранения плазмидного профиля. Определив предварительно устойчивость плазмидного профиля, можно прогнозировать стабильность биотехнологических свойств в процессе культивирования штаммов и заквасок, полученных на их основе.
ЛИТЕРАТУРА
1. McKay L.L., Baldwin К. Application for biotechnology: present and future emprovements in lactic acid bacteria 7 / FEMS Microbiol. Resiews, 1990. 87, p. 3-14.
2. Horng J.S., Polzin K.M., McKay L.L. Replication and temperature-sensitive maintenance functions of lactose plasmid pSKUL from Lactococcus lactis subsp. cremoris / / Journal of Bacteriology, 1991, 173(23), h7573-7581.
3. Lucey М., Daly C., Fitzgerald G.E. Identification and sequence analysis of the replication region of the phage resistance plasmid p с 1528 from Lactococcus lactis subsp. cremoris US 503 / / FEMS Microbiol. Letters, 1993, 110(3), p. 249-256.
4. Broadbent J.R., Kondo J.K. Genetic construction of nisin producing strains of Lactococcus lactis subsp. cremoris / / Journal of Dairy Science, 1990, 73, p. 72.
5. Klacnhammer T.R., McKay L.L., Baldwin K.A. Improved lysis of group N Streptococci for isolation and rapid characterisation of plasmid deo xyribonucbic acid / / Appl. Environm. Microbiol., 1978, 35, p. 592-600.
Поступила 13.01.97
665.1.03:547.97
ТЕРМООКИСЛЕНИЕ р-КАРОТИНА В РАСТВОРЕ
В.М. БОЛОТОВ, О.Б. РУДАКОВ, Е.В. ШЕРШНЕВА
Воронежская государственная технологическая академия
В связи с разрабатываемыми нами способами [1] повышения гидрофильных свойств природных ка-ротиноидов за счет химической модификации молекул пигментов, с целью расширения эксплуатационных свойств каротиноидных пищевых красителей исследовали процесс термоокисления ^-каротина.
Влияние температуры и кислорода воздуха на свойства /?-каротина в растворе этилацетата изучали в присутствии растворенного в органическом растворителе кислорода воздуха и при барботиро-вании его через раствор каротина. Процесс проводили в двухгорлой круглодонной колбе с обратным холодильником двойного водяного охлаждения при термостатировании. Скорость подачи воздуха контролировали и регулировали поплавковым ротаметром РМ-АО.16.
Количественно и качественно скорость термоокисления контролировали по изменению концентрации исходного /?-каротина и образовавшихся фитоксантинов на спектрофотометрах СФ-26, СФ-46 и жидкостном хроматографе ”Милихром-4”.
На основании электронных спектров поглощения растворов /?-каротина различной концентрации определяли максимум поглощения для проведения количественных измерений. На спектрофотометре СФ-18 с автоматической регистрацией результатов измерений записывали спектры поглощения в видимой области, по которым наблюдали изменения ^-каротина в процессе термоокисления.
Для выполнения исследований использовали калибровочные графики зависимости оптической
плотности растворов /3-каротина от его концентрации при длинах волн 450 и 480 нм. Растворы /?-каротина в этилацетате готовили весовым методом в интервале концентраций 3,87-мас.д., %. Данные калибровочных зависимостей статистически обработаны по методу наименьших квадратов с помощью программы ”Р1ХУШ”. При проведении реакции с барботажем воздуха истинную концентрацию ,6-каротина рассчитывали с учетом изменения объема растворителя из-за его летучести. Измерения оптических плотностей на всех спектрофотометрах проводили не менее трех раз при каждой концентрации.
Электронные спектры поглощения записывали с помощью жварцевых кювет с толщиной оптического слоя 10 мм. Раствором сравнения служил этилацетат.
Хроматографический анализ исходного /?-каро-тина и продуктов его окисления проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ, для чего использовали подвижную фазу ПФ состава гексан—этилацетат—изопропанол в объемном соотношении 75:24:1. В качестве неподвижной фазы применяли сорбент ’’Сепарон БС-Х” с диаметром частиц 5 мкм, помещенный в колонку размером 2x64 мм. Анализ проводили при длине волны детектора 282 нм и расходе ПФ 200 мкл/мин. Объем вводимой пробы — 5 мкл. Концентрация растворов каротина составляла 0,01-0,3 мас.д., %.
Кинетику процесса термоокисления /3-каротина в растворе этилацетата исследовали в присутствии кислорода воздуха с продувкой его и без продувки в интервале температур Т 303-323 К.
