CC BY
31
удК 616.61-053.2-07:575
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИИ В ДЕТСКОЙ НЕФРОЛОГИИ
Н. Ф. Хисамова, Л. Р. Кальметьева, З. Р. Хаматдинова
Республиканская детская клиническая больница, г. Уфа
Статья посвящена обсуждению результатов исследования показателей системы иммунитета и дНК-цитометрии клеток периферической крови детей с хроническим гломерулонефритом, получающих комплексную иммуносупрессивную терапию. Анализ полученных данных позволил выявить особенности иммунологической реактивности, плоидности клеток и кинетики клеточного цикла, которые позволяют оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессивной терапии.
Ключевые слова: дНК-цитометрия периферической крови, хронический гломерулонефрит, дети, иммуносупрессивная терапия.
Введение
Известно, что основное биологическое предназначение иммунной системы заключается в поддержании постоянства молекулярного состава организма и гомеостати-ческой регуляции молекулярно-клеточных процессов в изменяющихся условиях внешней и внутренней среды (Полетаев А. Б., 2008). Исходя из современных представлений о биологической роли системы иммунитета, невозможно глубокое понимание этиопатогенетических механизмов развития заболевания без комплексного подхода к изучению процессов, протекающих в имму-нокомпетентных клетках. Наряду с определением показателей системы иммунитета необходимым является изучение физиологического состояния клеток, которое может быть охарактеризовано плоидностью клеток и показателями кинетики клеточного цикла. для объективной оценки этих параметров широкое распространение получает проточная цитофлуориметрия, разделом которой является дНК-цитометрия (Saha I. et al., 2000).
Актуальным является определение роли и места проточной дНК-цитометрии в диагностике и прогнозе различных патологических состояний. Особый интерес представляет изучение процессов пролиферации клеток у пациентов с хроническим гломерулонефритом (хГ). Известно, что при лечении таких больных патогенетически обоснованной является комплексная имму-носупрессивная терапия. Однако, несмотря на применение современных фармакологических препаратов, оценка эффективности проводимой терапии и прогнозирование результатов лечения представляет большие трудности. до сих пор остается высоким процент пациентов с неудовлетворительными клиническими исходами. Так, многие авторы отмечают, что гломерулонефрит является одной из основных причин развития хронической почечной недостаточности, инвалидизации в детском, юношеском и молодом возрасте (Игнатова М. С., Вель-тищев ю. Е., 1989; Коровина Н. А., 1990; Наумова В. И., Папаян А. В., 1991, 1997; Рус-нак Ф. И. и др., 1997; Панова л. д. и др., 2005).
В связи с этим актуальным является определение маркеров активности процесса и эффективности иммуносупрессивной терапии при ХГ. Для решения поставленных задач весьма перспективным может быть использование новейших технологий, в частности, такой, как ДНК-цитометрия клеток периферической крови.
Цель исследования — определить диагностическое и прогностическое значение дНК-цитометрии периферической крови в комплексной оценке иммунного статуса и функционального состояния клеток у детей с ХГ.
Материал и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на базе иммунологической лаборатории с отделением клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы г. Уфы.
Исследования проводились поэтапно. На первом этапе осуществлялось клинико-лабо-раторное обследование контрольной группы, которую составили 30 здоровых детей. На следующем этапе работы в исследование было включено 20 детей с различными формами ХГ (нефротическая и смешанная). Обследование пациентов проводили на фоне базисной терапии ХГ. Комплексная терапия включала прием гормонов (преднизолон) и цитостатиков (сандиммун, циклофосфан, азатиаприн), механизм иммуносупрессивно-го действия которых связан с влиянием на пролиферативную фазу иммунного ответа (Цыгин А. Н., Сергеева Т. В., 1998).
Комплексное обследование больных включало сбор анамнеза, анализ клинических данных, проведение лабораторных исследований. Иммунологическое обследование проводилось с использованием комплекса стандартизированных тестов, включающих оценку:
— клеточного звена иммунитета на проточном цитофлуориметре «FACSCaHbur» с
программным обеспечением SimulSet c использованием моноклональных антител фирмы «Becton Dickinson» и определением относительного содержания основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+, CD25+, CD95+, HLA-DR+);
— плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови методом проточной ДНК-цитометрии, основанным на связывании дНК с флуоресцентным зондом — пропидиума йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 000 клеток) анализировали на проточном цитофлуори-метре, оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit. При этом учитывалось значение коэффициента вариации (CV%) пика G1/0, отражающего точность измерения;
— концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G (IgA, IgM, IgG), определяемых методом радиальной иммуно-диффузии в геле по Манчини;
— уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) осаждением полиэтилен-гликолем (мол. масса — 6000) (Имельбае-ва Э. А. и др., 2006).
Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде «Windows-XP» с использованием современных пакетов прикладных программ «Statistica 6.0». Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялись медиана и интеркартильный размах (25—75 перцентили). Достоверность различий оценивалась по критерию Манна-Уитни (Гланц С., 1999).
Результаты и их обсуждение
На начальном этапе исследования проводилась оценка ДНК-гистограмм крови 30 практически здоровых детей (контроль-
ная группа), отвечавших следующим требованиям:
1) отсутствие жалоб на состояние здоровья в момент осмотра;
2) перенесших вирусные заболевания в течение года не более 2 раз;
3) не имевших признаков аллергии и другой хронической патологии.
Как известно, лимфоциты периферической крови животных и человека в отсутствие митогенов и чужеродных антигенов представляют собой неделящуюся популяцию (Федорова Н. А., 1983), находятся в интерфазе (99,9%), что подтверждается и нашими исследованиями. Выход клетки из мито-тического цикла может быть необратимым (гранулоциты крови), поэтому даже под действием чужеродных антигенов грануло-циты находятся в G0/1-фазе клеточного цикла (Афанасьев Ю. И., Юрина Н. А., 1999).
ДНК-цитометрия периферической крови в контрольной группе характеризовалась следующими особенностями: показатели клеточного цикла отличались высокой стабильностью и варьировали в сравнительно узких пределах. В 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причем основная масса клеток (99,86%) находилась в G1-фазе клеточного цикла, доля клеток в стадии синтеза ДНК составляла 0,1%, в фазе G2-М — 0,02%. Коэффициент вариации составил 2,57%.
Нами проведено обследование 20 детей с нефротической и смешанной формами ХГ. Пациенты поступили в клинику в стадии обострения основного заболевания. Обследование больных детей проводилось на фоне комплексной иммуносупрессивной терапии.
для пациентов с нефротической формой ХГ были характерны протеинурия (до 5%о и более), гипопротеинемия (до 40 г/л) с преимущественным снижением альбуминовой фракции, гиперхолестеринемия (до 8 ммоль/л и более), гиперфибриногене-мия (до 6 г/л и более).
При смешанной форме ХГ у пациентов отмечались протеинурия (до 5%о и более), гематурия, непостоянная лимфоцитурия, ги-попротеинемия, гиперхолестеринемия, ги-перфибриногенемия, ускорение СОЭ.
Анализ гуморального звена (табл. 1) выявил достоверное снижение концентрации иммуноглобулинов класса G и тенденцию к повышению уровня иммуноглобулинов класса М.
Таблица 1
Характеристика иммунологических
показателей детей с хроническим гломерулонефритом
^ч Группы Показа-ч тели Контрольная группа (п=30), Ме Дети с ХГН (п=20), Ме
1бЛ, г/л 0,86 (0,75-1,09) 1,13 (0,86-1,55)
^М, г/л 0,91 (0,70-1,44) 1,34 (0,72-3,26)
ДО, г/л 10,00 (9,00-12,50) 7,00 (4,00-9,60) *
ЦИК, у. е. 31,00 (25,00-35,00) 37,50 (26,00-41,00)
CD3+, % 62,00 (58,00-67,00) 70,00 (63,00-78,00) *
CD4+, % 38,00 (33,00-39,00) 36,00 (31,00-41,00)
CD8+, % 37,00 (31,00-41,00) 40,00 (35,00-46,00)
CD19+, % 15,00 (12,00-17,00) 18,00 (7,00-22,00)
CD16+56+, % 22,00 (18,00-28,00) 16,00 (7,00-18,00) **
HLA-DR+, % 9,00 (7,00-12,00) 8,00 (6,00-19,00)
CD25+, % 17,00 (15,00-20,00) 25,00 (18,00-36,00) *
CD95+, % 32,50 (13,00-38,00) 27,00 (17,50-41,50)
CD4+/ CD8+ 1,00 (0,85-1,20) 0,87 (0,77-1,08)
Примечание. Различие статистически значимо: * - р<0,01; ** - р<0,001.
При иммунофенотипировании лимфоцитов установлены увеличение количества общих Т-лимфоцитов (CD3+ клеток) и высокий уровень маркера ранней активации (CD25+). Обращает на себя внимание подавление активности участников противовирусного иммунитета — снижение количества ЕКК ^16+56+ клеток).
В таблице 2 отражены показатели плоид-ности и распределения клеток периферической крови по фазам клеточного цикла в группе детей с ХГ. В 100% случаев клетки периферической крови, как и в контрольной группе, имели диплоидный набор хромосом. Достоверные различия касались лишь распределения клеток по фазам клеточного цикла.
Таблица 2
Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей с ХГН и в контрольной группе
Плоидность и кинетика клеточного цикла Контрольная группа (п=30), Ме Дети с ХГН (п=20), Ме
Диплоидные, % 100 100
G1, % 99,89 (99,83—99,90) 99,77 (99,32—99,83)**
G2, % 0,02 (0,00—0,04) 0,09 (0,04—0,16) **
S, % 0,10 (0,09—0,11) 0,15 (0,09—0,37) *
2,57 (2,29—2,83) 3,06 (2,38—3,84) **
Примечание. Различие с контролем статистически значимо: * — р<0,05; ** — р<0,01.
В группе детей с ХГ доля клеток в G2-фазе составила 0,09%, в S-фазе — 0,15% (в контрольной группе — соответственно 0,02% и 0,10%). Коэффициент вариации пика G1/0 в опытной группе не превышал 3,0%.
Выводы
Существует множество факторов, влияющих на плоидность и жизненный цикл клетки, и сведения об изменениях, происходящих в различных органах и системах, малочисленны и разрозненны. В связи с этим проточная ДНК-цитометрия становится ценным диагностическим методом и все чаще применяется при мониторинге заболеваний.
В нашей работе была сделана попытка изучения функционального состояния клеток периферической крови методом проточной цитофлуориметрии при таком распространенном и весьма далеком от решения проблемы в педиатрии заболевании, как ХГ.
Анализ результатов проведенных исследований позволил выявить особенности пло-идности клеток и кинетики клеточного цикла в группе детей с ХГ, получающих иммуно-супрессивную терапию. Как известно, одним из маркеров пролиферативной активности может служить уровень клеток в фазе синтеза дНК. По данным дНК-цитометрии, клетки периферической крови имели диплоидный набор хромосом, кинетика клеточного цикла характеризовалась достоверным увеличением клеток в фазах пролиферации.
К особенностям иммунологической реактивности можно отнести выявленную активацию клеточного звена системы иммунитета в виде повышения уровня общих Т-лим-фоцитов ^3+ клеток) и маркера ранней активации (CD25+) в сочетании с дисимму-ноглобулинемией, характеризующейся достоверным снижением концентрации иммуноглобулинов класса G и тенденцией к гипериммуноглобулинемии класса М.
Перечисленные особенности иммунологической реактивности и дНК-цитометрии клеток периферической крови отражают реакцию организма на базисную терапию. Комплексный подход, объединяющий клиническую картину заболевания, иммунологиче-
ские показатели, кинетику клеточного цикла, позволяет всесторонне оценить активность процесса и эффективность иммуносупрес-сивной терапии.
На основании анализа результатов проведенных исследований, включающих динамическое наблюдение в различные стадии заболевания, мы считаем возможным рекомендовать мониторинг показателей кинетики клеточного цикла в качестве маркера активности процесса и отчасти эффективности иммуносупрессивной терапии при ХГ.
Библиографический список
1. Афанасьев Ю. И. Гистология: учеб. посо-бие/Ю. И. Афанасьев, Н. А. Юрина.— М.: Медицина, 1999.— 80 с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика/С. Гланц.— М.: Практика, 1999.— 495 с.
3. Игнатова М. С. Детская нефрология: рук-во для врачей/М. С. Игнатова, Ю. Е. Вельтищев,- Л., 1989.— 455 с.
4. Коровина Н. А. Гломерулонефрит у детей: монография/Н. А Коровина, Л. П. Гаврюшо-ва, М. Шашинка.— М.: Медицина, 1990.— 255 с.
5. Кравцова Г. И. Врожденные дисплазии почек/Г И. Кравцова, Н. Е. Савченко, С. О. Плисан— Минск: Беларусь, 1982.— 223 с.
6. Методические указания к занятиям по иммунологии и серологии: учебно-методическое пособие для специалистов по клинической лабораторной диагностике/ Э. А. Имельбаева, Р. М. Хайруллина, Ю. А. Медведев и др— Уфа, 2004.— 87 с.
7. Наумова В. И. Почечная недостаточность у детей/В. И. Наумова, А В. Папаян.— Л., 1991.— 286 с.
8. Наумова В. И. Разработка проблем нефрологии в институте педиатрии РАМН/
B. И. Наумова^//Педиатрия.— 1997.— № 2.— C. 43—45.
9. Полетаев А. Б. Иммунофизиология и иммунопатология (избранные главы)/
A. Б. Полетаев.— М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008.— 208 с.
10. Распространенность инвалидности вследствие заболеваний органов мочевой системы у детей Республики Башкортостан/Л. Д. Панова, Л. И. Вахитова, Д. Ф. Зиятдинова и др.//Нефрология и диализ.— 2005.— Т. 7.— № 1.— С. 92—93.
11. Руснак Ф. И. Влияние кальцитриола на иммунокомпетентные клетки у детей с хроническим гломерулонефритом в функционально-компенсированной ста-дии/Ф. И. Руснак//Педиатрия.— 1997.— № 3.— C. 37—39.
12. Сергеева К. М. Клинико-лабораторные критерии оценки характера течения гломерулонефрита у детей/К. М. Сергеева//Нефрология.— 1999.— Т. 3.— № 4.—
C. 66—76.
13. Федоров Н. А. Структура ДНК и трансформация клеток/Н. А. Федоров.— М.: Медицина, 1983.— 195 с.
14. Цыгин А Н. Лечение хронического гло-мерулонефрита у детей/А. Н. Цыгин, Т. В. Сергеева//Российский педиатрический журнал.— 1998.— № 2.— С. 55—57.
15. Шмаров Д. А. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови/Д. А. Шмаров, Г. И. Кози-нец.— M.: МИА, 2004.— 128 с.
16. Ormerod M. G. Consensus report of the task force on standardization of DNA flow cytometry in clinical pathology/M. G. Ormerod,
B. Tribukait, W. Giarretti. http://archive. uwcm.ac.uk/uwcm/hg/hoy/dna. html., 2001.
17. Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid//. Saha, P. Dey, H. Vhora, R. Nijhawan//Diagn. Cytopa-thol.— 2000.— Vol. 22.— № 2.— P. 81—85.
методы диагностики и технологии
N. F. Khisamova, L. R. Kalmetyeva, Z. R. Khamatdinova
PERSPECTIVES OF uSING DNA-CYTOMETRY IN INFANTILE NEPHROLOGY
The paper deals with discussion of the results of investigation of immunity indices and peripheral blood cell DNA-cytometry in children with chronic glomerulonephritis receiving complex immunosuppressive therapy. Analysis of the data obtained permitted to detect peculiarities of immunological reactivity, cell ploidy and cellular cycle kinetics which allow to
estimate the activity of process and efficiency of immunosuppressive therapy.
Keywords: peripheric blood cell DNA-cytometry, chronic glomerulonephritis, children, immunosuppressive therapy.
Контактная информация: Хисамова Назиля Фагилевна, врач-лаборант иммунологической лаборатории Республиканской детской клинической больницы, 450106, г. Уфа, ул. Ст. Кувыкина, 98, тел. 8 (347) 255-73-44
Материал поступил в редакцию 20.03.2009
