CC BY
124
УДК 616.61-002.151:613.1./6:669:[575.191:576.8.095.52] © Г.М. Хасанова, Т.В. Викторова, 2009
Г.М. Хасанова1, Т.В. Викторова2 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У БОЛЬНЫХ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКОЙ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
1МУГородская клиническая инфекционная больница №4, г.Уфа 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа.
Представлены результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом.
Ключевые слова: ГЛПС, полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков.
G.M. Khasanova, T.V. Viktorova MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF GENE POLYMORPHISM OF XENOBIOTIC BIOTRANSFORMATION IN PATIENTS WITH HEMORRHAGIC FEVER WITH RENAL SYNDROME
The results of molecular-genetic analysis of gene polymorphism of xenobiotic biotransformation in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome are presented.
Key words: hemorrhagic fever with renal syndrome, gene polymorphism of xenobiotic biotransformation.
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является ведущей природно-очаговой инфекцией в краевой патологии Республики Башкортостан (РБ). Ежегодно в РБ заболевает ГЛПС 1,5-2,5 тысячи человек, что составляет 40-60% заболеваемости по Российской Федерации [3]. Значительное количество заболеваний ГЛПС в РБ отмечается в г. Уфе (до 50% всех случаев по РБ) [2].
В городе Уфе сосредоточены предприятия химии, нефтехимии, топливноэнергетического комплекса, машиностроения и металлообработки, являющиеся основными источниками загрязнения среды обитания.
Вредные факторы окружающей среды вносят существенный вклад в патогенез ряда заболеваний и нарушение этапов метаболизма токсических веществ в организме. Большинство ксенобиотиков, попадая в организм, не оказывают прямого биологического эффекта и вначале подвергаются различным превращениям, так называемой биотрансформациям. Согласно современному определению, под биотрансформацией понимают энзиматическое превращение жирорастворимых экзогенных и эндогенных соединений в полярные водорастворимые метаболиты, легко выводимые из организма [1]. У человека существует генетический контроль детоксикации ксенобиотиков, поэтому в зависимости от особенностей генома различные индивиды могут сохранять устойчивость либо, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к внешне средовым аспектам, что проявляется в увеличении заболеваемости и их осложнений [8].
Учитывая широкое распространение ГЛПС, нарушение функции почек при данном заболевании, а также экологическую обстановку крупного промышленного г. Уфы, мы поставили цель провести молекулярногенетический анализ полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом.
Материал и методы
Всего обследовано 97 больных с серологически подтверждённым методом РНИФ (МФА) диагнозом ГЛПС в возрасте от 18 до 60 лет, получивших стационарное лечение в городской клинической инфекционной больнице №4 г. Уфы. Контрольная группа была сформирована из 426 серонегативных по ГЛПС доноров, проживающих на территории РБ, соответствующих выборке больных по возрасту и полу.
Материалом для молекулярно-
генетического исследования служили образцы ДНК. Кровь набирали в пробирки со стандартным консервантом (1 мл глюгицира) в соотношении 4 мл крови на 1 мл консерванта. До выделения ДНК кровь хранилась при температуре +4°С не более 1 месяца. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [6].
Анализ полиморфных локусов генов 08ТМ1 и 08ТР1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонук-леотидных праймеров. Амплификация фраг-
Таблица 1
Распределение частоты делеции гена 08ТМ1 у больных ГЛПС и лиц контрольной группы
Генотипы ГЛПС N*=97 Контроль N*=426
Абс. % Абс. %
Норма 85 87,6 242 56,8
Делеция 12 12,4 184 43,2
OR
а
30,7
0,0005
5,39
2,8^10,7
^N-объём выборки.
2
X
р
мента гена GSTM1 была выполнена по Kerb (1999). При отсутствии делеции формировался фрагмент размером 400 пар нуклеотидов (пн), при наличии делеции данный фрагмент отсутствовал. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена CYP1A1. Гидролиз амплифицированного фрагмента ДНК гена GSTP1 [4] проводили в стандартных условиях: к 10 мкл амплификата добавляли 5 единиц фермента Alw261 и инкубировали при 37°С не менее 12 часов. При отсутствии полиморфного сайта рестрикции продукты амплификации имели размеры 176 пн, что соответствует «нормальному» аллелю 11е. При наличии полиморфного сайта рестрикции фрагмент размером 176 пн расщеплялся на фрагменты размером 91 и 85 пн, что соответствует полиморфному аллелю Val.
Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7% полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе .
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ: «Statistica for Windows 6.0», «Rows and Columns», программного обеспечения MS Excel (Microsoft). При попарном сравнении частот генотипов в группах больных и здоровых лиц использовался точный двухсторонний критерий Фишера, а также критерий X для таблиц сопряжённости 2x2 с поправкой Йетса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов Odds Ratio (OR).
Результаты и обсуждение
Учитывая то, что гены детоксикации ксенобиотиков контролируют биотрансформацию и выведение из организма эндогенных и экзогенных токсических соединений, а при ГЛПС страдает один из главных органов выведения - почки, представлялось важным изучить полиморфизм генов детоксикации ксенобиотиков у больных ГЛПС.
Гены детоксикации фазы II представлены в основном генами суперсемейства глута-тионтрансфераз и ариламин-N-
ацетилтрансфераз.
С помощью метода ПЦР-анализа нами изучена частота гомозиготных носителей делеции гена глутатион^-трансферазы M1 (GSTM1). Результаты, полученные при сравнительном анализе делеционного полиморфизма гена GSTM1 у больных ГЛПС и лиц контрольной группы представлены в таб. 1.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии достоверных различий по распределению частот генотипов гена 08ТМ1 между больными ГЛПС и лицами контрольной группы (%2=30,7; р=0,0005). Среди больных ГЛПС делеция гена 08ТМ1 встречалась реже, чем среди здоровых людей, составляя 12,4% против 43,2% в контрольной группе.
Глутатион-8-трансферазы катализируют взаимодействие глутамата с электрофильны-ми атомами С, К, 8, О широкого спектра соединений.
Ген глутатион-8-трансферазы класса мю (ц) 08ТМ1 локализован на 1-м участке 1р 13 и представлен пятью генными локусами 08ТМ1, 08ТМ2, 08ТМ3, 08ТМ4, 08ТМ5.
Локус 08ТМ1 имеет 3 аллельные формы:
- 2 аллеля 08ТМ1*Л и 08ТМ1*Б отличаются парой нуклеотидов в 7-м экзоне и кодируют белки, несколько различающиеся по своей энзиматической активности.
«Нулевой» аллель гена 08ТМ1
(08ТМ1*0) обусловлен делецией, которая возникла в результате неравного кроссинго-вера между двумя гомологичными последовательностями, фланкирующими ген 08ТМ1. При данной мутации вследствие протяжённой (около 10 тысяч пн) делеции РНК белковый продукт вообще не синтезируется.
Наличие у индивидуума той или иной аллельной формы локуса 08ТМ1 может определять значительные индивидуальные различия в метаболизме экзогенных соединений и рассматриваться в качестве факторов предрасположенности к некоторым заболеваниям [1].
Ген 08ТР1 находится на хромосоме 11 (11^13). Преимущественно экспрессируется в альвеолярных клетках, бронхиолах, селезёнке и плаценте. Его белковый продукт обнаружен также в мозге, особенно на границе гематоэн-цефалического барьера.
Генетический полиморфизм обусловлен заменой нуклеотидов в 313-м или 341-м положении 08ТР1, что приводит к появлению функционально различных форм фермента.
На сегодняшний день открыто 4 аллеля этого гена: 08ТР1*Л - аллель «дикого типа» и
изменённые аллели 08ТР1*Б, 08ТР1*С и 08ТР1*Д, полученные при сочетании двух однонуклеотидных полиморфизмов.
Транзиция аденина на гуанин в 313-м положении в 5-м экзоне гена приводит к замене изолейцина на валин в 105 положении. Она затрагивает последовательность ДНК, кодирующую сайт связывания фермента с определёнными субстратами.
Установлена важная роль ферментов 08ТР1 в детоксикации пестицидов, а также в процессе канцерогенеза [5, 7]. Доказано, что при наличии мутантных форм активность фермента значительно снижена, что сопровождается нарушением процесса детоксикации ксенобиотиков. Данные, полученные при изучении генотипов гена 08ТР1 у больных ГЛПС и в контрольной группе, представлены в таб. 2. Сравнительный анализ распределения частот генотипов гена 08ТР1 выявил статистически значимые различия между общей выборкой больных и контрольной группой. Несмотря на то, что в обеих группах чаще встречается генотип АА, доля лиц с данным генотипом в контроле оказалась значительно выше - 58,5%, чем среди больных - 45,7%. Расчёт показателя отношения шансов указывает на его возможную прогностическую значимость (0Я=0,59; С1=0,37-0,9).
Таблица 2.
Распределение частот генотипов полиморфизма гена 08ТР1, у больных ГЛПС и лиц контрольной группы
Как следует из представленных в таблице результатов, гетерозиготный генотип AG в 1,3 раза чаще встречался у больных (51,1%) по сравнению с контрольной группой (39,3%). Статистический анализ подтверждает наличие достоверных различий по частоте гетерозиготного генотипа между группами и позволяет использовать его в качестве генетического маркера, ассоциированного с повышенным риском развития ГЛПС, при уровне отношения шансов OR=1,6 (С1=1,0^2,58).
Статистический анализ не выявил достоверных различий по частоте встречаемости гомозиготного по мутации генотипа GG у больных ГЛПС и лиц контрольной группы.
Это можно объяснить редкой частотой указанного маркера, который встречается лишь на 3 хромосомах из 188 у больных ГЛПС и в 9 случаях из 844 проанализированных хромосом у лиц контрольной группы. Выводы
1. Среди больных ГЛПС делеция гена GSTM1 встречалась реже, чем среди здоровых лиц (х2=30,7; р=0,0005).
2. Гомозиготный генотип АА гена GSTP1 чаще встречался у здоровых людей. Расчёт показателя отношения шансов указывает на его возможную прогностическую значимость (0R=0,59; CI=0,37-0,9).
3. Гетерозиготный генотип AG гена GSTP1 в 1,3 раза чаще встречался у больных ГЛПС (51,1%) по сравнению с лицами контрольной группы (39,3%), что позволяет использовать его в качестве генетического маркера, ассоциированного с повышенным риском развития ГЛПС, при уровне отношения шансов OR=1,6 (CI=1,0^2,58).
Контактная информация
Хасанова Гузель Миргасимовна,
Врач-инфекционис т высшей категории МУ городская клиническая инфекционная больница N«4,
МУ городская клиническая инфекционная больница №4. врач-инфекционист высшей категории;
450099, г. Уфа, ул. Б. Бикбая, д. 24, корпус 3, кв,8, тел.: (347) 230-99-36, е-mail: nаi1_ufa1964@mai1.ru Викторова Татьяна Викторовна
Д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии БГМУ, зав. лабораторией экологии человека института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
450000, Республика Башкортостан, ул. Ленина 3, тел. (347) 273-58-75 450054, г. Уфа, Пр. Октября 69, тел/факс (347) 235-61-00
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов В. С., Баранова Е. В., Иващенко Т. Э., Асеев М. В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину). - СПб: «Интермедика», 2000. - 272с.
2. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. Актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики. Под ред. Р. Ш. Магазова. - Уфа: «Гилем», 2006. - 238 с.
3. Такаев Р. М., Минин Г. Д., Коробов Л. И. и др. // Матер. Всероссийской научнопрактической конференции «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» - Уфа, 2006. - С. 29-33.
4. Harries L.W., Stubbins M.J., Forman D., Howard G.C., Wolf C.R. Identification of genetic poly-
Генотипы ГЛПС Конт роль X2 р OR а
Абс. % Абс. %
АА 43 45,7 247 58,5 4,6 0,032 0,59 0,37^0,9
АG 48 51,1 166 39,3 3,88 0,048 1,6 1,0^2,58
GG 3 3 9 2,13 0,056 0,81 1,5 0,3^6,24
morphisms at the glutathione S-transferase Pi locus and association with susceptibility to bladder, testicular and prostate cancer // Carcinogenesis. - 1997. - Vol. 18. - P. 641-644.
5. Helzlsouer K. J., Huang H-Y., Strickland P. T. et al. Association between glutathione-S-transferase M1, P1 and T1 genetic polymorphisms and development of breast cancer // J. Natl. Cancer Inst. -1998. - Vol. 90, - P. 512-518.
6. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M. N. Y.; Haman press, 1984. - V.2. - P. 31-34.
7. Menegon A., Board P. G., Blackburn A. C. et al. Parkinson disease, pesticides and glutathione transferase polymorphisms // Lancet - 1998. - Oct. 24; 352 (9137): 1344-1346.
8. Nakachi K. Polymorphisms of the CYP1A1 and glutathione-S-transferase genes associated with susceptibility to lung cancer. In relation to cigarette dose in a Japanese population / K. Nakachi, K. Imai, S. Hayashi // Cancer Res. - 1993. - Vol. 53, - P. 2994-2999.
УДК 616-053.2-07:575
© Н.Ф. Xиcамова, Л.Р. Кальметьева, З.Р. Xаматдинова,2009
Н.Ф. Xиcамова, Л.Р. Кальметьева, З.Р. Xаматдинова ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИИ В ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
ГУЗ Республиканская детская клиническая больница, г. Уфа
Статья посвящена обсуждению результатов исследования показателей системы иммунитета и ДНК-цитометрии клеток периферической крови у детей с хроническим гломерулонефритом, получающих комплексную иммуносупрессивную терапию. Анализ полученных данных позволил выявить особенности иммунологической реактивности, плоидности клеток и кинетики клеточного цикла, которые позволяют оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессивной терапии.
Ключевые слова: ДНК-цитометрия периферической крови, хронический гломерулонефрит, дети, иммуносупрессивная терапия.
N.F. Khisamova, L.R. Kalmetieva, Z.R. Khamatdinova FIELDS OF USING OF DNA-CYTOMETRY IN PEDIATRICAL PRACTICE
This article is related to the discussion of the results of the studies of the index of immunal system and DNA-cytometry of blood cells of the children with chronical glomerulonephritis, which are under immunosuppression. Complex analysis of the data defind the peculiarities of immunologic reactivity, ploidy of cells and cellular cycle kinetics, which allow to give characteristics of the activity of process and efficacy of immunocuppressiv therapy.
Key words: DNA-cytometry of blood cells, chronical glomerulonephritis, children, immunocuppressiv therapy.
Хронический гломерулонефрит (ХГ) является важнейшей проблемой детской нефрологии, несмотря на небольшой удельный вес в общей структуре нефропатий [Н.А. Коровина и др., 1990; Л.Д. Панова и др., 2005]. Среди приобретённых заболеваний почек у детей ХГ является вторым по распространённости заболеванием после инфекции мочевыводящих путей, одной из основных причин развития хронической почечной недостаточности (ХПН), инвалидизации в детском, юношеском и молодом возрасте [В .И. Наумова, 1997; Ф.И. Руснак и др., 1997]. За последние 10-15 лет увеличилась частота латентных и хронических форм гломерулонефрита, протекающих с более ранним нарушением почечных функций, в том числе за счёт присоединения тубулоинтерстициального компонента [Сергеева К.М., 1999; Картамышева Н.Н. и др., 2005; Мотлох Л.Н. и др., 2006]. Известно, что при лечении больных ХГ патогенетически обоснованной является комплексная иммуно-
супрессивная терапия. Однако, несмотря на применение современных фармакологических препаратов, оценка эффективности проводимой терапии и прогнозирование результатов лечения представляют большие трудности.
В связи с этим перспективным является использование новейших технологий для изучения процессов, протекающих в иммуноком-петентных клетках. Физиологическое состояние клеток и способность к осуществлению присущих им функций характеризуется, в частности, уровнем ДНК (плоидностью) и показателями кинетики клеточного цикла. Для объективной оценки этих параметров широкое распространение получает проточная ци-тофлуориметрия, разделом которой является ДНК-цитометрия [Saha I. et al., 2000]. По прогнозам специалистов [Шмаров Д.А., Козинец Г.И., 2004], в самом ближайшем будущем можно ожидать внедрения проточной ДНК-цитометрии в практику работы клиникодиагностических лабораторий.
