CC BY
36
2003 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 4 (№27)
ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 593.4
Ю. И. Мухина, О. И. Подгорная, С. М. Ефремова
ПЕРСПЕКТИВЫ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ КЛЕТОК ГУБОК
Введение. В настоящее время благодаря молекулярно-биологическим, цитологическим и эмбриологическим исследованиям можно считать доказанным, что губки являются истинными многоклеточными животными. Монофилия губок и других Metazoa прослеживается в организации и структуре генов [16, 23], в общности структурных белков и белков-ферментов [35], в модусах развития [1, 3, 4, 5, 18, 27], в строении эпителиальных пластов [13, 22]. В то же время в спонгиологической литературе не ослабевает дискуссия об участии личиночных клеток в построении дефинитивного организма. Начало ей было положено более 100 лет назад»[17, 36]. Тогда же возникло представление об инверсии зародышевых листков у губок, и им дано название Enantiozoa, т.е. организмы, «вывернутые наизнанку», у которых эктодермо- и энтодермо-подобные слои меняются местами в ходе метаморфоза [17, 32].
В последние годы появились противоречивые свидетельства о роли жгутиковых клеток личинки в метаморфозе губок класса Demospongiae, основанные на электронно-микроскопических и экспериментальных данных. Японские исследователи С. Амано и И. Хори [9] обнаружили в жгутиковых и в некоторых других клетках личинки Haliclona sp. одинаковые ультраструктурные включения, свидетельствующие, по их мнению, о том, что жгутиковые камеры формируются из уходящих внутрь поверхностных клеток личинки. К такому же выводу пришла Л.В.Иванова [25, 26], изучавшая ультраструк-гуру клеток личинок пресноводных спонгиллид, хотя именно у пресноводных губок были выявлены ранняя дифференциация хоаноцитов из внутренних клеток личинки и элиминация поверхностных жгутиковых клеток в ходе метаморфоза [14]. Провизорный характер клеток «кинобласта» личинки, утративших способность к пролиферации, был подтвержден также на пресноводных байкальских любомирскиидах с помощью тими-диновой авторадиографии [19].
Эксперименты, поставленные с целью выяснить судьбу личиночных клеток, дали противоречивые результаты. Р. Бороевич [12] диссоциировал паренхимулу морской губки Муса/е contarenii и наблюдал прикрепление и развитие конгломератов клеток. В ходе реорганизации большинство жгутиковых клеток было фагоцитировано амебоцитами, а из оставшихся, по наблюдениям автора, формировались хоаноцитные камеры.
У личинки Microciona proliféra с помощью радиоактивного мечения NaJ125 жгутиковых клеток удалось установить [34], что они фагоцитируются археоцитами и не
© Ю. И. Мухина, О. И. Подгорная, С. М. Ефремова, 2003
принимают участия в формировании хоаноцитных камер ювенильной губки. Эти данные подтверждаются также состоянием апоптоза у поверхностных клеток той же губки [28].
Прямо противоположные результаты получены С. Лейс и В. М. Дегнаном [31] на личинке губки Reniera sp. Флюоресцентное мечение жгутиковых клеток линейным маркером CMFDA показало, что они утрачивают жгутик, мигрируют внутрь и подвергаются трансдифференцировке, преобразуясь, в хоаноциты и другие клетки ювенильной губки. Авторы подчеркивают, что в данном случае речь идет не об инверсии зародышевых листков, а о дедифференциации и реорганизации уже дифференцированных клеток. Однако если рассматривать жгутиковый эпителий личинки как производное эктодер-мального слоя клеток, то здесь вопрос об инверсии решен положительно. Известно, что у бадяг и байкальских губок в личинке уже есть все категории клеток, взрослого организма, включая хоаноциты. Среди морских видов хоаноцитные камеры в личинках описаны только у трех видов: Haliclona (Acervochalina) limbata [33], Haliclona ecbasis [21] и Halichondria melanodocia [39]. Маркирование клеток этих губок позволило бы установить, участвуют ли в формировании хоаноцитных камер также и жгутиковые клетки личинки.
Личинка губки Halisarca dujardini, поверхностные клетки которой несут по жгутику, подробно описана рядом авторов [7, 8, 10, 11, 20, 30], однако данные о внутренней структуре личинки противоречивы. Так, большинство авторов [10, 11, 15, 30] считают личинку губок рода Halisarca паренхимулой. По мнению других исследователей [Т, 30]., личинка Н. dujardini не имеет внутренних клеток, а состоит лишь из слоя жгутиковых клеток, которые впоследствии даДут весь спектр клеток дефинитивной губки. Такую личинку авторы называют бластулообразной. По данным А. В.Ересковского и - Е. Л. Гонобоблевой [20], личинке Н. dujardini свойствен полиморфизм. Помимо описанных ранее двух видов личинок — типичной паренхимулы [30] и бластулообразной личинки [7], имеющей в своем составе единичные амебоидные клетки, названной ими целобластулой, авторы выделяют еще и третий — дисферулу. Это личинки со сферической структурой из поверхностных жгутиковых клеток, оказавшихся внутри в результате частичной инвагинации внешнего жгутикового слоя в период пребывания личинки в материнском организме.
Учитывая неоднозначность результатов морфологических и экспериментальных работ, мы предприняли изучение возможности маркирования клеток личинок с помощью поликлональных антител к белкам разных клеточных категорий. Такой подход может не только облегчить решение вопроса о наличии или отсутствии инверсии, но и выявить степень дифференциации внутренних клеток личинок, их соответствие клеткам ювенильных губок или провизорный характер. „ ;
Материал и методы. Губок с зародышами, находящимися на стадии предличинки, собирали в районе Беломорской биологической станции СПбГУ (Чупинская губа Кандалакшского залива) в июле 1996, 1997 и 2001 гг. и помещали в аквариум с морской водой при температуре 14 °С. Вымет личинок из материнского организма начинался через несколько часов экспозиции на свету. '
Фиксацию для микроскопии проводили по схеме: префиксация 1%-ным раствором тетроксида осмия на 0,2 моль/л фосфатном буфере (Р-Н. 7,4) 10 мин, тщательное отмывание в трех порциях 0,2 моль/л фосфатного буфера в течение 10 мин, одночасовая обработка в растворе глютаральдегида 2,5% на фосфатном буфере и постфиксация 1%-ным раствором тетроксида осмия в течение 1-1,5 ч. В фиксирующие растворы добавляли сахарозу для создания осмотического давления 625 мОсм/моль. Полутонкие срезы получали на ультратоме NOVA и окрашивали трехцветным методом [24]. Для получения тотальных препаратов личинок фиксировали 4%-ным раствором формальдегида на фосфатном буфере (РН 7,3-7,5).
Для опытов по диссоциации клеток использовали только что взметанных личинок. Их помещали
в искусственную морскую воду без ионов Са++ и Mg++ (0,3 моль/л NaCl, 20 ммоль/л KCl, 15 ммоль/л EDTA). Через 3-5 мин личинки механически, встряхиванием или пипетированием, разделяли на отдельные клетки.
Фракционирование проводили в плотностном градиенте перколла (Percoll, Pharmacia). Раствор перколла смешивали с соответствующими объемами искусственной морской воды для получения растворов понижающейся концентрации (40, 35, 30, 25, 20, 10%). Аликвоты по 2 мл каждого раствора последовательно наносили в пластиковую центрифужную пробирку. Преформированный градиент с наслоенной на него клеточной суспензией центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин. Слои с клетками собирали пипеткой и дважды промывали в искусственной морской воде. Жизнеспособность, количественный и качественный состав, клеток каждой фракции оценивали при помощи фазово-кон-трастного микроскопа с водоиммерсионным объективом. Исследовано около 500 клеток каждой фракции. Предварительные опыты показали, что фракция с 10% перколла не содержит клеток. Однако из-за того, что в дальнейшем предполагалось культивирование разделенных в градиенте перколла клеток," ее сохранили как буферную, удаляющую бактерий, слизь и клеточные остатки, неизбежные при диссоциации личинок.
Белки гомогената клеток каждой фракции разделяли с помощью диск-электрофореза в полиакри-ламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по стандартной методике [29]. Электроперенос белков из ПААГ осуществляли полусухим способом [37]. Иммуноблот проводили по стандартной методике.
Для получения поликлональной сыворотки из геля вырезали кусочки, содержавшие мажорные белки клеток отдельных фракций, их гомогенизировали и использовали в качестве антигена, который вводили крысе и морским свинкам. Выбор доноров определялся количеством белка во фракции. Через 45 сут от животных была получена иммунная сыворотка с поликлональными антителами. Полученную поликлональную сыворотку использовали в качестве первых антител, в качестве вторых антител использовали антитела к иммуноглобулинам крысы и морской свинки, конъюгированные с флюорес-цеин-изотиоцианатом (FITC). Иммунофлюоресцентный анализ тотальных препаратов личинок губки проводили в центре Хромас БиНИИ СПбГУ на микроскопе фирмы «Leica», компьютерные изображения получали с помощью CCD-устройства и программы обработки изображений «Leica Q-FISH».
Результаты. Состав клеток и морфология плавающей личинки Halisarca dujardini. Микроскопическое исследование полутонких срезов плавающей личинки показало наг личие двух типов поверхностных жгутиковых клеток (переднелатеральной Поверхности и заднего полюса) и нескольких типов внутренних клеток личинки: ядрышковых амебоцитов I и II (ЯА I, ЯА II) , колленцитоподобных клеток (КК) и сферульных амебоцитов материнской природы (МСА) (рис.1).
ЯА I представляют собой неправильной формы клетки с большим ядром и круп-. ным ядрышком. В цитоплазме обнаруживается небольшое количество гранул желтка на разной стадии переваривания. КК располагаются одиночно под слоем поверхностных жгутиковых клеток. Эти клетки звездчатой формы на окрашенных срезах имеют голубоватую цитоплазму с большим количеством мелких гранул и лишены желточных включений. В центре личинки располагаются круцные ЯА И, сохранившие желточные включения. МСА к концу периода свободного плавания личинки концентрируются вблизи ее заднего полюса.
Качественный и количественный состав внутренних амебоидных клеток личинок, вышедших из одной материнской губки, неоднороден. На полутонких срезах наиболее крупные по размерам личинки имели значительное количество амебоидных клеток, среди которых, кроме бластомероподобных ЯА И, содержащих запасы желточных включений и занимающих в личинке центральное положение, присутствуют ЯА I и в незначительном количестве КК. Йолость вблизи заднего полюса у таких личинок небольшая или отсутствует. У других личинок внутренние клетки представлены небольшим числом ЯА II, сохранивших большое количество желточных включений, а множество ЯА I и КК концентрируются под слоем жгутиковых клеток. Центральную часть личинки занимает обширная полость.
Группы жгутиковых клеток, оказавшиеся внутри личинки в результате инвагина-
Рис. 1. Полутонкий срез поздней личинки Н. dujardini.
А — 1-е сутки после выхода из материнского организма. Б — 2-е сутки после вымета.
ЖГ — жгутиковые клетки передне-латеральной поверхности, ЖГЗ — жгутиковые клетки
заднего полюса, Я А I — ядрышковые амебоциты с мелкими желточными включениями,
Я А II — бластомероподобные ядрышковые амебоциты, К К — колленцитоподобные клетки,
МСА — материнские сферульные амебоциты, ПП — передний полюс, ЗП — задний полюс.
>
ции поверхностного жгутикового слоя, встречаются лишь у незначительного числа свободноплавающих личинок (около 8%).
" Фракционирование и иммуноцитохимическое маркирования клеток личинки Н. dujardini. Личинки, помещенные в искусственную морскую воду, свободную от ионов Са и Mg, продолжали поступательное движение передним полюсом вперед, одновременно вращаясь вокруг своей переднезадней оси. Через 3-5 мин клетки заднего полюса и амебоидные внутренние клетки отделялись от личинки. Слой жгутиковых клеток передне-боковой поверхности оставался целостным и образовывал открытые прозрачные пузырьки, которые вскоре опускались на дно и распадались на отдельные клетки.
При разделении суспензии клеток личинок на однородные"группы выявлены 6 фракций (таблица).
Первая фракция содержала бактерии и слизь, 2-я — мелкие клетки со жгутиками, 3-я — более крупные жгутиковые клетки заднего полюса личинки и небольшие ядрышковые амебоциты ЯА I, 4-я — только ядрышковые амебоциты ЯА I, 5-я — КК с очень мелкими гранулами, 6-я —крупные, бластомероподобные ЯА II и МСА. Все перечисленные категории клеток вели себя по-разному в диссоциированном состоянии: одни прикреплялись к субстрату и перемещались (ЯА I и ЯА II), другие (КК) прикреплялись к субстрату и распластывались, но не были способны к перемещению, жгутиковые клетки переднего полюса и латеральных поверхностей не прикреплялись к субстрату и не перемещались, а жгутиковые клетки заднего полюса прикреплялись и образовывали ламеллоподиальные выросты. При разделении клеток взрослой губки были выделены 7 фракций, но лишь одна, содержащая гранулярные амебоциты, оказалась однородной.
Результаты электрофоретического анализа белкового состава клеток каждой фрак-
Клеточный состав фракций после разделения клеток личинок в градиенте перколла
Фракция Перколл, % Клеточный состав
1-я 10 Бактерии, слизь
2-я 20 Жгутиковые клетки передне-боковой поверхности
3-я 25 Жгутиковые клетки заднего полюса Амебоциты I \
4-я 30 Амебоциты I
5-я 35 Колленцитоподобные клетки
6-я 40 Материнские сферульные амебоциты Амебоциты II
ции показали наличие в них нескольких мажорных белков: белки 68 кД фракции 2 (жгутиковые клетки личинки), 58 кД фракции 5 (колленцитоподобные клетки личинки) и 18 кД фракции 7 дефинитивной губки (сферульные клетки). Белок 68 кД фракции 2 был инъецирован крысе, белки 58 кД фракции 5 и 18 кД фракции 7 дефинитивной губки аналогично были инъецированы морским свинкам. Полученная от животных иммунная сыворотка содержала антитела ABL2, ABL5 и АВА7 соответственно.
Антитела ABL2 и ABL5 при иммуноблотинге электрофоретически разделенных белков целых личинок реагировали с белками 68.и 58 кД соответственно. АВА7 окрашивали несколько дискретных зон с основной зоной 70 кД. Связывания антител ABL2 (к белкам поверхностных жгутиковых клетой) с белками взрослой губки не происходило.
Иммуноцитохимический анализ препаратов диссоциированных клеток и целых личинок с использованием вторичных антител, конъюгированных с FITC, показал, что ABL2 взаимодействует с белками в апикальной области жгутиковых клеток личинки и не взаимодействует с белками жгутика. Кроме поверхностных жгутиковых клеток антитела ABL2 связываются с клетками внутренней жгутиковой сферы' (рис. 2, А, Б).
Антитела ABL5 взаимодействуют с белками гранул колленцитоподобных клеток и белками некоторых ЯА I (рис.2, В). Эти клетки локализуются под поверхностным слоем жгутиковых клеток и обнаруживаются во всех рассмотренных личинках.
Антитела АВА7, полученные к белкам сферульных клеток дефинитивной губки,' связываются с гранулами тех же клеток в составе личинки (рис. 2, Г). Таким образом, полученные антитела можно считать надежными маркерами клеток, принимающих участие в процессе метаморфоза личинок и последующем развитии губок.
Обсуждение. Мы показали, что в состав личинки губки Halisarca dujardini входят 6 типов клеток: 1) жгутиковые клетки переднелатеральной поверхности, 2) жгутиковые клетки заднего плюса, 3) ядрышковые амебоциты I, 4) ядрышковые амебоциты II, 5) колленцитоподобные клетки, 6) гранулярцые амебоциты материнской природы. Это наблюдение соответствует данным К. Леви [30], полученным для губки Halisarca met-shnikovi, где также отмечено несколько типов амебоцитов во внутренней массе клеток.
В клетках центральной части дичинки Я. dujardini, по мнению Леви [30], никаких амебоидных клеток нет, а постларвальный морфогенез происходит за счет то-типотентных жгутиковых клеток. • Г. П. Короткова и Н. О. Ермолина [7] обнаружили лишь единичные внутренние клетки у личинки H. dujardini. А. В.Ересковский и Е. Л. Гонобоблева [20] справедливо отмечают, что такие противоречивые описания внутреннего строения личинок объясняются тем, что рутинная гистологическая обработка исследуемого материала не давала возможности получить высокое разрешение границ
Рис. 2. Тотальные препараты личинки Н. <1щаг(Ит, окрашенные антителами к жгутиковым клеткам {А, Б), к колленцитоподобным клеткам (В), к материнским сферульным амебоцитам (Г).
С — внутренняя сфера жгутиковых клеток, остальные обозначения, как на рис. 1. Стрелки указывают^на соответствующие клетки личинок.
между клетками, и лишь применение современных методов серийных полутонких срезов и электронной микроскопии позволило выяснить наличие отдельных клеток, а не гомогенной массы внутри личинки. По их мнению, личинкам Н. д,щаг<Ит, как и личинкам некоторых других губок, выходящим из одного материнского организма, свойствен полиморфизм.
По наблюдениям Л.В.Ивановой [25], полиморфизм личинок пресноводных губок связан со степенью1 дифференциации клеток внутри личинок к моменту начала свободной жизни. Так, наиболее продвинутые личинки имели хорошо развитую систему воротничковых камер, колленциты, лофоциты, спикулоциты. У личинок, покидающих губку на более ранней стадии развития, большое количество крупных бластомеропо-добных ядрышковых амебоцитов со значительным запасом желтка.
Два типа личинок обнаружены при спровоцированном выходе личинок губки СгатЬе сгатЪе в лабораторных условиях [38]. Некоторые мелкие личинки, полностью жгутиковые, отличались от более крупных, лишенных жгутиков на заднем полюсе, большим временем свободного плавания перед оседанием. Авторы предполагают, что мелкие личинки находятся на более ранней стадии развития.
По нашим наблюдениям, все личинки #. йщагйгт, несмотря на их некоторые морфологические различия, имеют в своем составе внутреннюю клеточную массу, представленную несколькими типами амебоидных клеток. Прослеживается зависимость между морфологией личинки и степенью дифференциации этих внутренних клеток. Личинки, в центральной части которых много бластомероподобных ЯА II, на микроскопических препаратах воспринимаются как паренхимулы, сходные с описанными К. Леви [30] паренхимулами Н. те1$1гткоу1. Личинки, имеющие в своем составе меньше ЯА II и больше ЯА I и КК, расположенных непосредственно под слоем жгутиковых клеток, выглядят
как «бластулообразные», с полостью в центре. И на св'етооптических препаратах, и на электронограммах различить под слоем жгутиковых клеток амебоидные трудно, так как все клетки маскируются входящими в них желточными включениями. Выявить их позволяет только метод иммуноцитохимического маркирования однородных клеточных групп.
В составе каждой личинки — дисферулы также обнаруживаются АЯI и КК. Учитывая тот факт, что наибольшее количество личинок — дисферул встречается на последних этапах развития личинок внутри материнского организма, а к периоду свободного плавания их число уменьшается вследствие дезинтеграции внутренней «сферы», ди-сферулу тоже можно считать паренхимулой.
Таким образом, бластулообразные и дисферульные личинки губки Я. dujardini — этавариации личинки — паренхимулы и эквифинальность развития всех личинок несомненна.
Выделены и протестированы антитела, избирательно взаимодействующие с определенными типами клеток личинок. Антитела ABL5 и АВА7 окрашивают гранулы КК и МСА соответственно. Антитела ABL2 окрашивают апикальные части жгутиковых клеток и не окрашивает сам жгутик. Можно предположить, что обнаруженный белок 68 кД не относится к группе тубулинов. Более тонкую локализацию участков связывания антител можно будет выявить с помощью электронной микроскопии.
Антитела ABL2 и ABL5 при иммуноблотинге белков целых личинок реагировали с белками, против которых они и были получены, а именно 68 и 58 кД. Антитела ABL2 к белкам поверхностных жгутиковых клеток связываются и с внутренними жгутиковыми клетками личинок-дисферул Я. dujardini Это еще раз подтверждает данные авторов [2, 20], что внутренние сферы образовались при частичной инвагинации поверхностного слоя клеток личинки. Антитела АВА7 реагировали с несколькими дискретными зонами белков, что связано, по-видимому, с особенностями синтеза этого белка. Вероятно, белок 18 кД, содержащийся в сферульных клетках дефинитивной губки, синтезируется в виде высокомолекулярного предшественника, который в дальнейшем подвергается про-цессингу. Связывания антител ABL2 с препаратом белков дефинитивной губки могло не происходить по двум причинам: либо у жгутиковых клеток личинки и клеток дефинитивной губки нет соответствующего общего белка, либо в теле губки после вымета личинок отсутствуют жгутиковые камеры с хоаноцитами. По данным Г. П. Коротковой и JI. В. Апальковой [6], в период половой репродукции хоаноциты мигрируют в мезохилл и преобразуются в уплощенные клетки эмбриональной капсулы, которые впоследствии сливаясь с выстилкой выносящих каналов, составляют единую отводящую систему, по которой перемещаются личинки, а затем тело губки подвергается физиологической деструкции.
Иммуноцитохимическое маркирование клеток личинок позволит в дальнейшем определить их участие в метаморфозе и формировании ювенильной губки.
Статья рекомендована проф. А. В. Перевозчиковым. Summary
■Mukhina Y. I., Podgornaya О. I., Efremova S. M. The perspectives of immunocytochemical marking of sponge cells.
The polyclonal antibodies for the major proteins of the surface flagellated cells and the collencytes of Halisarca dujardini larvae as well as for the spherulous amoebocytes of adult sponge have been obtained. The cells were separated in percoll gradient beforehand. FITC-conjugated antibodies for corresponding cells marked the apical parts of flagellated cells and the inner cells of larvae including the maternal spherulous
amoebocytes. The method will allow to investigate the problem of choanocyte origin and the participation of larvae cells in the development of sponges after metamorphosis.
Литература
X. Беклемишев В. H. Основы сравнительной анатомии беспозвоночных. Т. 1: Проморфология. М., 1964. 2. Гонобоблева Е. Л. Строение дисферульной личинки и особенности метаморфоза Halisarca du-jardini (Demospongiae, Halisarcida) из Белого моря // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2000. Вып. 2 (№11). С. 118-121. 3. Гуреева М. А. Эмбриональное развитие и зародышевые листки у губок'// Вопросы эволюционной морфологии и филогении животных. Труды JIOE. 1976. Т. 84. Вып. 1. С. 10- 25. ,4. Ересковский А. В. Проблема колониальное™, модулярности и индивидуальности губок и особенности их морфогенезов при росте и бесполом размножении // Биология моря. 2003. Т. 29, №1. С. 3-12. 5. Иванов А. В. Эмбриология губок (Porifera) и их место в системе животного царства // Журн. общ. биол. 1971. Т. 32, №5. С. 557-572. 6. Коротко&а Г. П., Апалькова Л. В. Ойгенез баренцевоморской губки Halisarca dujardini Johnston // Вопросы сравнительной и экспериментальной морфологии морских организмов. Аппатиты, 1975. .С. 9-26. 7. Короткова Г. П., Ермолина Н. О. Период развития личинки Halisarca dujardini Demospongiae // Зоол. журн. 1982. Т. 61, №10. С. 1472-1480. 8. Короткова Г. П., Ермолина Н. О. Участие специализированных амебоцитов в половом, эмбриогенезе беломорской губки Halisarca dujardini Johnston: Науч. докл. высш. школы // Биол. науки. 1986. №5. С. 48-53. 9. Атапо S., Hori I. Metamorphosis of a Demosponge . I. Cells and structure of swimming larvae // Invertebr. Reprod. Dev. 1994. Vol. 21. P. 81-90. 10. Bergquist P. The marine fauna of New Zealand: Porifera, Class Demospongiae. Pt. 5: Dendroceratida and Halisarcida // N. Z. Oceanogr. Inst. Mem. 1996. Vol.107. P. 1-53. 11. Bergquist P., Sinclair M., Green C., Silyn-Roberts H. Comparative morphology and behavior of larvae of Demospongiae // Biologie des Spongiaires / Ed. by С. Lévi, N. Boury-Esnault. Colloq. Int. CNRS. 1979 (1978). N291. P. 103-111. 12. Borojevic R. Etude experimental de la différenciation des cellules de l'éponge au cours de son développement // Dev. Biol. 1966. Vol. 14. P. 130-153. 13. Boury-Esnault N., De Vos L., Donadey C., Vacelet J. Comparative study of the choanosome of Porifera. 1. The Homoscleromorpha // J. Morphol. 1984. Vol. 180. P. 3-17. 14. Brien P., Meewis H. Contribution à l'étude de l'emryogenèse de Spongillidae // Arch. Biol. 1938. Vol.4, N2. P. 177*250. 15. Chen W.T. Reproduction and speciation in Halisarca // Aspects of sponge biology / Ed. by F. M. Harrison, R.R. Cowden. New York, 1976. P. 113-139. 16. Coutingo С. C., Vissers S., Van de Vyver G. Evidence of homeobox genes in the freshwater sponge Ephydatia fluviatilis // Sponges in Time and Space. Biology, Chemistry, Paleontology / Ed. by Van Soest, Van Kempen, Braekman. Proc. 4th Int. Porifera Congr. 1993. Amsterdam, 1994. P. 385- 388. 17. Delage Y Embryogenie des Eponges. Développement postlarvaire des Eponges siliceuses et fibreuses marines et d'eau douce // Arch. Zool. Exp. Gén. 1892. Ser.2. T. 10. P. 345-498. 18. Efremova S. M. Once more on the . position among Metazoa — Gastrulation and germinal layers of sponges // Modern problems of Poriferan biology / Ed. by A. V. Ereskovsky, H. Keupp, R. Kohring. Berliner geowiss. Abh. 1997. Reihe E. Bd 20. S. 7-15. 19. Efremova S. M., Ejremov V. I. Prolifération cellulaire chez la larve nagéante de l'éponge d'eau douce: Baikalospongia bacillifera (Dybowski) // Biologie des Spongiaires / Ed. by С. Lévi, N. Boury-Esnault. Colloq. int. CNRS. 1979(1978). N291. P. 59-65. 20. Ereskovsky A. V., Gonobobleva E.L. New data on embryonic development of Halisarca dujardini Johnston, 1842 (Demospongie, Halisarcida) // Zoosystema. 2000. Vol. 22, N2. P. 355-368. 21. Fell P. The involvement of nurse cells in oogenesis and embryonic development in the marine sponge, Haliclona ecbasis // J. Morph. 1969. Vol. 127. P. 133-150. 22. Garrone R. Phylogenesis and biosynthesis of sponge intercellular matrix // Frontiers of Matrix Biology / Ed. by L.Robert. Basel, 1978. 23. Garrone R., Exposito J.-Y. The collagen family of proteins: two distinct lines of evolution // Belg. J. Zool. 1992. Vol. 122, N 1. P. 17-22. 24. Humphreys C. D., Pittman F. E. A simple methylene blue — azure II —basic fuchsine stain for epoxy — embedded tissue section // Stain Technology. 1974. Vol.49, N1. P. 9-14. 25. Ivanova L. V. New data about morphology and metamorphosis of the spongillid larvae (Porifera, Spongillidae) // Modern problems of Poriferan Biology / Ed. by A. V. Ereskovsky, H. Keupp, R. Kohring. Berliner Geowiss. Abh. 1997. Reihe E. Bd 20. S. 73-71. 26. Ivanova L, V. Multiple variations of the fate of the flagellated cells during the metamorphosis of the parenchimella larvae in freshwater and marine demosponges // Bull. Mus. 1st. Biol. Univ. Genova. 2002. Vol. 66-67. P. 99. 27. Ivanova О. M. Analysis of the sponges ontogeny at sexual reproduction // Modern problems'of Poriferan biology / Ed. by A. V. Ereskovsky, H. Keupp, R. Kohring. Berliner geowiss. Abh. 1997. Reihe E. Bd 20. S. 35-43. 28. Kaltenbach J. C., Kuhns W. J., Simpson T. L., Burger M. 'M. Intense concanavalin A staining and apoptosis of periferal flagellated cells in larvae of the marine sponge Microcione proliféra: significance in relation to morphogenesis // Biol. Bull. 1999. Vol.197. P.271-273. 29. Laemmli U.K. Cleavage of structural.proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol.227. P.689-685. 30. Lévi С. Etude des Halisarca de Roscoff. Embriologie et systématique des Démosponges // Arch. Zool. Exp. Gén. 1956. T.93. P. 1-181. 31. Leys S., Degnan B. Sponge larvae: the blueprint of a Metazoan // Bull. Mus. 1st. Biol. Univ. Genova. 2002. Vol. 66-67.
P. 116. 32. Maas O. Die Embryonal-Entwicklung und metamorphose der Cornacuspongien // Zool. Jahrb. Abt. Anat. 1893. Bd 7. S. 307-315. 33. Meevns H. Contribution a l'étude de l'embryogenèse des Chalin-idae: Haliclona limbata // Annu. Soc. Roy. Zool. Belg. 1939. T. 71. P. 201-243. 34. Misevië G., Schlup V., Burger M. Larval metamorphosis of Microciona proliféra: evidence against the reversal of layers // New perspective in Sponge Biology / Ed. by K.Rutzler. Washington, 1990. P. 182-187. 35. Müller W.E.G., Müller I. MRinkevich B., Gamulin V. Molecular evolution: evidence for the monophyletic origin of multicellular animals // Naturwiss. 1995. Bd 82. S. 36-38. 36. Schulze F.E. Untersuchungen über den Bau und die Entwicklung der Spongien // Zeitschr. Wiss. Zool. 1878. Bd 31. S. 262-296. 37. Towbin H., Stachelin N., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulosesheets: procedure and some applications // Proc. Nat. Acad Sei. USA. 1979. Vol.76. P. 4350-4354. 38. Uriz V.J., Turon X., Becerro M. A. Morphology and ultrastructure of the swimming larvae of Crambe cram.be // Invertebr. Biol. 2001. Vol. 120, N4. P. 295-307. 39. Woollacott R. M. Structure and swimming behavior of the larva of Hali-chondria melanodocia (Porifera, Demospongiae) // J.Morphol. 1990. Vol. 205., P. 135-145.
Статья поступила.в редакцию 14 июня 2003 г.
