CC BY
91
УДК 593. 421; 579 . 843
Е. А. Кутерницкая1, А. Э. Вишняков1, А. В. Ересковский1
изучение строения симбиотических бактерий беломорской губки HALISARCA DUJARDINI JoHNsTON (porifera, demospongiae, halisarcida) и их Возможного Влияния на формирование примморф*
1 Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра зоологии беспозвоночных
1 Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра эмбриологии
Введение. По определению де Бари, симбиоз — это взаимоотношения между двумя или более организмами, существующими совместно в течение долгого времени [22]. Представители типа Porifera могут вступать в симбиотические отношения с представителями большинства групп организмов: с животными разных таксонов, таких, как, Cnidaria, Turbellaria, Nemertinea, Sipunculida, Polychaeta, Mollusca, Crustacea, Pycnogonida, Echinodermata, Ascidiacea и Pisces [6], водорослями [28], грибами [11], прокариотами [22]. Симбиоз губок с прокариотами уникален тем, что все исследованные до настоящего времени виды губок имеют симбиотические ассоциации с одним или более видами бактериальных симбионтов [4, 10, 13, 18, 22]. Молекулярный анализ показал, что микробиота губок филогенетически сложна и высокоспецифична. Численно богаты и метаболически активны в губках представители восьми эубактериальных фил: Proteobacteria (Alpha-, Gamma-. Deltaproteobacteria), Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes и Nitrospira, представители недавно открытой филы «Poribacteria» [8] и обе архейные филы (Crenarchaeota и Euriarchaeota) [27] .
Взаимодействие между губками и микроорганизмами происходит по-разному. Бактерии могут быть пищей, патогенным началом или вступать в мутуалистические отношения с губками [22]. Они располагаются главным образом в матриксе мезохила и физически отделены от морской воды пинакодермой, хотя у некоторых видов губок отмечены внутриклеточные симбионты [5, 25]. Концентрация бактериальных симбионтов в губке может на 2-3 порядка превышать концентрацию бактерий в морской воде . При этом количество бактерий в некоторых видах губок может составлять до 40 % от общей биомассы животного [23]. Для многих случаев симбиоза показан вертикальный перенос бактерий от материнского организма к потомкам [7, 19, 21, 24] .
Клетки губок обладают некоторыми уникальными особенностями, такими, как способность к агрегации после диссоциации в присутствии Ca2+ и Mg2+ и способность распознавать «свое» и «не свое» . Эти особенности в значительной степени определяют полную перестройку всего организма после диссоциации клеток [9] Диссоциированные клетки многих видов губок ассоциируют и формируют округлые трехмерные структуры, называемые примморфами, или конгломератами [1, 5, 26] . Примморфы представляют
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 07-04-01097) . © Е . А. Кутерницкая, А. Э . Вишняков, А. В . Ересковский, 2008
собой промежуточную стадию между диаморфной многоклеточной агрегацией (характеризующейся непрерывной пинакодермой) и начальной ростовой стадией окончательного фильтрующего индивида [З] . Показано, что на образование примморф влияет наличие симбионтов, их количество, свойства скелета и другие факторы [26] .
Для Halisarca dujardini (кл . Demospongiae) также характерно образование примморф (конгломератов), которые в контексте биологии развития рассматриваются как пример соматического эмбриогенеза. Как и другие губки, H. dujardini имеет бактериальных симбионтов, популяция которых поддерживается вертикальным переносом [7] . Однако другие аспекты взаимодействия между клетками этих губок и их бактериальными симбионтами не изучены .
Цель настоящего исследования — изучение строения симбиотических бактерий губок Halisarca dujardini и их влияния на процессы соматического эмбриогенеза при формировании примморф
Материалы и методы исследования. Губки были собраны в сублиторали Чупинской губы Белого моря в районе о-ва средний в летние сезоны 2003-2007 гг. Для изучения тонкого строения бактерий кусочки губок размером около 2 мм3 фиксировали в 2,З%-ном глутаральдегиде, приготовленном на фосфатном буфере (pH 7,4, 760 мОсм) с последующей постфиксацией в 1%-ном OsO4 . Обезвоживание образцов производили в последовательности спиртов возрастающей концентрации . В качестве заливочной среды использовали эпоксисмолы Аралдит и спурр . Тонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB и контрастировали водными растворами уранилацетата и цитрата свинца. Для изготовления образцов для сЭМ использовали аналогичную фиксацию фрагментов губок с последующим их обезвоживанием и напылением золотом . строение бактериальных симбионтов H. dujardini исследовали с помощью микроскопов Zeiss-1000 и LEO 910 .
В экспериментах по изучению влияния симбиотических бактерий на формирование примморф из отдельных клеток H. dujardini мацерацию тканей производили механическим протиранием фрагментов губок в чашки Петри через сито с ячеей 100 мкм. Образующиеся слизистые тяжи коллагена с прикрепленными к ним клетками удаляли, в результате чего на дне чашек Петри оставались отдельные осевшие клетки . Наблюдение за образованием клеточных агрегатов осуществляли несколько раз в сутки с помощью бинокулярного микроскопа МБс-9 . Для инактивации симбиотических бактерий использовали антибиотик пенициллиновой группы, ампициллин с рабочей концентрацией З и 10 мкг/мл . Раствор ампициллина, как и воду в чашках Петри с контролем, обновляли раз в сутки . Эксперименты по влиянию ампициллина на формирование агрегатов проводили, добавляя ампициллин через 30-60 мин после диссоциации тканей на клетки, либо протирали ткани губок сразу в морской воде с ампициллином . Для каждой концентрации ампициллина и контроля брали по З повторностей . Наблюдение продолжали в течение недели .
результаты исследования и их обсуждение. Электронно-микроскопическое изучение губок Halisarca dujardini показало, что в их зародышах и мезохиле взрослых губок присутствуют бактерии только одного морфотипа [7, настоящая публикация] (рис . 1 А, Б) . Бактерии имеют спиральную форму (2-2,З витка), длина клеток (по прямой от одного конца клетки до другого) около 0,7 мкм и толщина около 0,3 мкм . Оболочка бактерии имеет две мембраны, разделенные заметным периплазматическим пространством . Цитоплазма гетерогенна по своему составу: на периферии у нее средняя электронная плотность, ближе к центру она почти электронно-прозрачная . Центральная часть клетки содержит электронно-плотный широкий тяж нуклеоида . сочетание таких признаков, как грамотри-цательная клеточная оболочка и спиральная форма клеток, характерно для представителей ряда фил, таких, как Spirochaetes, Nitrospirae и Proteobacteria [3]. Дальнейшее уточнение систематического положения этих симбионтов требует использования цитологических (FISH с использованием группоспецифичных флуоресцентно меченых олигонуклеотидов) и молекулярных (например, по последовательности гена 16 S рРНК) методов .
Рис. 1. Изображения симбиотических бактерий На^агса dujardini (А — ТЭМ, Б — СЭМ)
С — симбиотические бактерии, Г — клетки губки .
В экспериментах по определению влияния описанных выше симбионтов на процессы соматического эмбриогенеза Н. dujardini из суспензии клеток губки в течение первых 20-30 мин начинали образовываться агрегаты неправильной формы. В течение суток из этих агрегатов формировались правильные сферические структуры — приммор-фы размером от 100 мкм до нескольких миллиметров (рис . 2) . Показано, что движение клеток диссоциированной губки не является случайным и обусловлено межклеточными взаимодействиями образуемых ими отростков [15].
На 2-3-и сутки в примморфах на просвет становятся видны закладывающиеся хоаноцитные камеры . В ранних исследованиях соматического эмбриогенеза Н. dujardini было показано, что эти камеры начинают функционировать только на 20-25-е сутки, когда формируется и открывается оскулюм [1]
Клетки губок, помещенные сразу после диссоциации в морскую воду с ампициллином, не проявляли тенденции к формированию как агрегатов неправильной формы, так и сферических примморф (рис . 3) . Этот эффект сохранялся в течение всего эксперимента (7 суток) . Если раствор ампициллина добавлялся в морскую воду через 20-30 мин после получения суспензии клеток, то формирование агрегатов в опыте не отличалось по внешним критериям от контроля
Очевидно, что начальный период после диссоциации определяет весь дальнейший процесс взаимодействия клеток губки и симбиотических бактерий между собой и формирование примморф . Не исключено, что во время, когда происходит выделение сигнальных
Рис. 2. Примморфы Halisarca dujardini, сформированные через сутки после диссоциации (морская вода без ампициллина)
Рис. 3. Неагрегированные клетки Halisarca dujardini, неспособные формировать примморфы в течение 7 дней, когда клетки диссоциировали в морскую воду с ампициллином
молекул и узнавание клетками друг друга [16], ампициллин может оказывать негативное влияние на эти процессы [12] и препятствовать формированию примморф либо замедлять этот процесс . Однако, будучи антибиотиком пенициллиновой группы, ампициллин подавляет процессы формирования клеточной стенки бактерий [2], что позволяет предположить его минимальное воздействие непосредственно на клетки губок . Вместе с другими антибиотиками, такими, как канамицин, гентамицин и стрептомицин, он использовался для подавления жизнедеятельности бактерий в клеточных культурах губок разных видов [17]. Таким образом, исходя из механизма действия ампициллина и результатов наших экспериментов, можно предполагать, что симбиотические бактерии, возможно, выполняют какую-то интегрирующую функцию при агрегации клеток и формировании примморф .
Образование примморф различных видов губок исследовали как с использованием антибиотиков, так и без них [5, 14, 20]. Использование только гентамицина или пенициллина и стрептомицина одновременно не препятствовало процессам агрегации . При этом в ряде экспериментов авторы предполагали, что симбиотические бактерии элиминировались в результате действия антибиотиков [20]. Возможно, что в нашем случае могла произойти задержка формирования примморф, и их образование требует более длительных сроков эксперимента
Для примморф 8иЬвг^ domuncula было показано, что симбиотические бактерии сохранялись внутри вакуолей клеток определенного типа [5]. Дополнительные защитные мембранные образования, помимо плазматической мембраны, могли препятствовать проникновению антибиотика в эти клеточные компартменты . Сохраняются ли симбионты
при формировании примморф H. dujardini в средах с ампициллином и без него и участвуют ли они в последующих морфогенетических процессах — дальнейшие эксперименты помогут разрешить этот вопрос .
Summary
Kuternitskaya E. A., Vishnyakov A. E., Ereskovsky A. V. Structure of symbiotic bacteria of Halisarca dujardini and their influence on primmorph formation.
The structure of symbiotic bacteria of Halisarca dujardini has features of Spirochaetes, Nitrospirae, and Proteobacteria . In experiments on ampicillin influence the primmorph formation did not occur during the experiment if the sponge fragments are dissociated in sea water with ampicillin . When antibiotic was added after the beginning of an aggregation process, cells formed primmorphs . A probable role of symbiotic bacteria in primmorph formation is discussed
Key words: sponge associated symbionts, primmorph, ampicillin .
Литература
I. Морфогенезы у губок // Труды биологического научно-исследовательского института ЛГУ / Под ред. Г П. Коротковой. № 33 . Л. , 1981.
2 . Краткая Медицинская Энциклопедия / Гл . ред. Б . В . Петровский. 2-е изд. М. , 1989 .
3 . Пиневич А. В. Микробиология . Биология прокариотов . Т 1. СПб . , 2006 .
4 . Althoff K., Schutt C., Steffen R., BatelR., Muller W. E. G. Evidence for a symbiosis between bacteria of the genus Rhodobacter and the marine sponge Halichondria panicea: harbor also for putatively toxic bacteria // Mar Biol . 1998 . Vol. 130 . P. 529-536 .
5. CustodioM. R., Prokic I., Steffen R., Koziol C., BorojevicR., BrummerF., NickelM., Muller W. E. G. Primmorphs generated from dissociated cells of the sponge Suberites domuncula: a model system for studies of cell proliferation and cell death // Mech . Ageing Dev. 1998 . Vol . 105 . P. 45-59 .
6. Duarte L., Nalesso R. C. The sponge Zygomycale parishii (Bowerbank) and its endobiotic fauna // Es-tuar. , Coast. and Shelf Sci. 1996. Vol. 4 . P. 139-151.
7. Ereskovsky A. V., Gonobobleva E., Vishnyakov A. Morphological evidence for vertical transmission of symbiotic bacteria in the viviparous sponge Halisarca dujardini Johnston (Porifera, Demospongiae, Halisar-cida) // Mar Biol . 2005 . Vol . 146 . P. 869-875 .
8. Fieseler L., Horn M., WagnerM., Hentschel U. Discovery of the novel candidate phylum «Poribac-teria» in marine sponges // Appl . Environ . Microbiol . 2004. Vol . 70 . P. 3724-3732 .
9. Gaino E., Bavestrello G., Magnino G. Self/non-self recognition in sponges // Ital . J. Zool . 1999 . Vol . 66 . P. 299-315 .
10. Hentschel U., Usher K. M., TaylorM. W. Marine sponges as microbial fermenters // FEMS Microbiol . Ecol . 2006 . Vol. 55 . P. 167-177.
II. Holler U., Wright A. D., Matthee G. F., Konig G. M., Draeger S., Aust H.-J., Schulz B. Fungi from marine sponges: diversity, biological activity and secondary metabolites // Mycol. Res . 2000 . Vol. 104 . P. 1354-1365 .
12. Kuhlmann I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture // Cytotechnology. 1996. Vol . 19 . P. 95-105 .
13. Lopez J. V., McCarthy P. J., Janda K. E., Willoughby R., Pomponi S. A. Molecular techniques reveal wide phyletic diversity of heterotrophic microbes associated with Discodermia spp (Porifera: Demospon-giae) // Mem . Qld . Mus . 1999 . Vol . 44 . P. 329-341.
14. Muller W. E. G., Bohm M., Batel R., De Rosa S., Tommonaro G., Muller I. M., Schroder H. C. Application of cell culture for the production of bioactive compounds from sponges: synthesis of avarol by prim-morphs from Dysidea avara // J Nat Prod 2000 Vol 63 P 1077-1081
15. Noble P. B., Peterson S. C. A two-dimensional random walk analysis of aggregating sponge cells prior to cell contact // Exp . Cell Res . 1972. Vol . 75 . P. 288-290 .
16. Pahler S., Blumbach B., Muller I. M., Muller W. E. G. A putative multiadhesive basal lamina protein from the marine sponge Geodia cydonium: cloning of the cDNA encoding a fibronectin-, an SRCR- as well as a complement control protein module // J. Exp . Zool. 1998 . Vol . 282 . P. 332-343 .
17. Pomponi S. A., Willoughby R. Sponge cell culture for production of bioactive metabolites // Sponges in Time and Space / Ed . by R . van Soest, A . A . Balkema . Brookfield; Rotterdam, 1994 . P. 395-400 .
18. Sara M., Bavestrello G., Cattaneo-Vietti R., Cerrano C. Endosymbiosis in sponges: relevance for epigenesis and evolution // Symbiosis . 1998 . Vol . 25 . P. 57-70 .
19. Schmitt S., Weisz J., Lindquist N., Hentschel U.. Vertical transmission of a phylogenetically complex microbial consortium in the viviparous sponge Ircinia felix // Appl . Environ . Microbiol . 2007. Vol . 73 . P. 2067-2078.
20. SipkemaR., van Wielink C., van Lammeren A. A. M., Tramper J., OsingaR., WijffelsR. H. Primmorphs from seven manine sponges: formation and structure // J. Biotechnol. 2003 . Vol. 100 . P. 127-139 .
21. Sharp K. H., Eam B.,. Faulkner D. J, Haygood M. G. Vertical transmission of diverse microbes in the tropical sponge Corticium sp // Appl Environ Microbiol 2007 Vol 73 P 622-629
22. TaylorM. W., RadaxR., StegerD., WagnerM. Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology and biotechnological potencial // Microbiol Mol Biol Rev 2007 Vol 71 N 2 P 295-347
23. Thakur N. L., Hentschel U., Krasko A., Pabel C. T., Anil A. C., Muller W. E. G. Antibacterial activity of the sponge Suberites domuncula and its primmorphs: potential basis for epibacterial chemical defense // Aquat. Microb Ecol 2003 Vol 31 P 77-83
24. Usher K. M., Kuo J., Fromont J., Sutton D. C. Vertical transmissio of cyanobacterial symbionts in the marine sponge Chondrilla australiensis (Demospongiae) // Hydrobiologia. 2001. Vol . 461. P. 15-23 .
25. Vacelet J., Donadey C. Electron microscope study of the association between some sponges and bacteria // J. Exp . Mar. Biol . Ecol. 1977. Vol. 30 . P. 301-314 .
26. Valisano L., Bavestrello G., Giovine M., Cerrano C. Primmorphs formation dynamics: a screening among Mediterranean sponges // Mar Biol 2006 Vol 149 P 1037-1046
27. Webster N. S., Watts J. E., Hill R. T. Detection and phylogenetic analysis of novel crenarchaeote and euryarchaeote 16S ribosomal RNA gene sequences from a Great Barrier Reef sponge // Mar. Biotechnol . 2001 Vol 3 P 600-608
28. Webster N. S., Negri A. P., Munro M. M., Battershill C. N. Diverse microbial communities inhabit Antarctic sponges // Environ . Microbiol . 2004. Vol . 6 . P. 288-300 .
