ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В СИСТЕМЕ ОЦЕНКИ И КОНТРОЛЯ БИОБЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Для корреспонденции

Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14 Телефон: (495) 698-53-83 E-mail: karlikanova@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-9071-0326

Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А.

Пeрспективные молекулярно-генетические методы секвенирования микроорганизмов в системе оценки и контроля биобезопасности пищевой продукции

Prospective molecular methods for sequencing microorganisms in the system of assessment and control of food safety

Efimochkina N.R., Sheveleva S.A.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Foоd Safety, 109240, Moscow, Russian Federation

Для реализации одной из наиболее важных задач гигиены питания - обеспечения биобезопасности пищевых продуктов - ведущее место отводится использованию методов секвенирования нуклеиновых кислот, позволяющих выявить и описать нуклеотидные последовательности геномов как у отдельных микроорганизмов, так и метагеномные характеристики микробных сообществ в объектах окружающей среды, в организме человека и животных. Цель обзора - анализ основных направлений применения методов секвенирования в пищевой микробиологии, биотехнологии и эпидемиологии. Материал и методы. Проведен сбор и анализ научно-информационных материалов, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, размещенных в реферативных базах данных Scopus, Web of Science, PubMed, РИНЦ, в официальных сборниках Всемирной организации здравоохранения, Европейского агентства по безопасности пищи и др.

Результаты. В работе представлены обобщенные характеристики наиболее известных форматов секвенирования, базирующихся на разных принципах считывания и обработки генетической информации: капиллярное секвенирование по Сэнгеру, пиросеквенирование, секвенирование лигированием, секвенирование синтезом ДНК, полупроводниковое высокопроизводительное секвенирование,

Финансирование. Работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания по теме № 0410-2022-0003 «Разработка комплексной системы оценки безопасности пищевых ингредиентов, биологически активных веществ и пищевой продукции нового вида, полученной из нетрадиционных и новых источников». Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Для цитирования: Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Перспективные молекулярно-генетические методы секвенирования микроорганизмов в системе оценки и контроля биобезопасности пищевой продукции // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 1. С. 37-52. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2022-91-1-37-52

Статья поступила в редакцию 28.10.2021. Принята в печать 11.01.2022.

Funding. The preparation of the manuscript was carried out at the expense of the subsidy for the implementation of the state task on the topic 04102022-0003 «Development of a comprehensive system for assessing the safety of food ingredients, biologically active substances and food products of a new type obtained from non-traditional and new sources». Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

For citation: Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Prospective molecular methods for sequencing microorganisms in the system of assessment and control of food safety. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (1): 37-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-1-37-52 (in Russian) Received 28.10.2021. Accepted 11.01.2022.

секвенирование отдельных молекул ДНК. Показано, что мультилокусный анализ (MLST, MLVA) повышает специфичность генотипирования и внутривидовой идентификации возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи, он применяется для оценки патогенного потенциала и изучения механизмов эволюционной изменчивости бактериальных патогенов, приводящей к полиморфизму клональныхлиний и появлению штаммоспецифическихразличий, для мониторинга разных генотипов возбудителей на производстве и других объектах пищевой цепи. Нанопоровое секвенирование является перспективным для изучения бактериальных плазмид и локализации генов устойчивости полирезистентных бактерий. Полногеномный анализ (WGS) позволяет выявлять детальные характеристики возбудителей инфекционных заболеваний, включая некультивируемые и ранее неизвестные микроорганизмы, а также изучать особенности геномов прокариотов и эукариотов, факторы патогенности и механизмы регуляции экспрессии генов. Показана роль WGS-методов для определения степени генетического родства возбудителей инфекций, выделенных из различных источников, при расследовании вспышек и спорадических пищевых отравлений и инфекций. Показаны возможности метагеномного секвенирования в изучении видового состава, генетического разнообразия и метаболического потенциала микробных сообществ. Основное преимущество метагеномики состоит в прямом сек-венировании геномов микроорганизмов, обитающих в организме человека, животных, в воде, почве и других объектах. Метагеномный анализ играет ведущую роль в обнаружении неизученных таксонов, некультивируемых и труднокуль-тивируемых форм широкого спектра микроорганизмов. Важнейшим направлением метагеномики является изучение микробиома человека или животных, анализ взаимосвязей между кишечной микробиотой и метаболизмом, а также формированием пищевого статуса человека. Рассмотрены теоретические и практические аспекты имплементации методов высокопроизводительного секвенирования в систему контроля биобезопасности пищевой продукции: оценка безопасности генетически модифицированных штаммов-продуцентов пищевых продуктов, разработка принципиально новых алгоритмов расследования вспышек инфекционных заболеваний, создание сетевых систем ранней диагностики и оповещения о пищевых инфекциях бактериальной и вирусной этиологии.

Заключение. Секвенирование должно стать стандартной методологией в сфере безопасности пищевых продуктов для идентификации и характеристики патогенов пищевого происхождения, в том числе обладающих резистентностью к антибиотикам и неблагоприятным технологическим воздействиям. Внедрение WGS в систему оценки и контроля безопасности пищевых продуктов позволит оценить их реальную контаминацию новыми и вновь возвращающимися возбудителями, создать электронные базы данных и научно обосновать максимально адекватные меры профилактики пищевых инфекций для обеспечения здоровья населения РФ.

Ключевые слова: секвенирование; патогенные микроорганизмы; идентификация; геном; безопасность пищи; пищевые токсикоинфекции

To solve one of the most important tasks of food hygiene - ensuring foodstuff biosafety, the leading place is given to the use of nucleic acid sequencing methods that allow to identify and describe the nucleotide sequences of genomes both in individual microorganisms and metagenomic characteristics of microbial communities in environmental objects, in humans and animals.

The purpose of the review was to analyze the main areas of sequencing application in food microbiology, biotechnology and epidemiology.

Material and methods. The collection and analysis of scientific and informational materials published in domestic and foreign publications from Scopus, Web of Science, PubMed, RSCI databases, official reports of the World Health Organization (WHO), the European Food Safety Agency (EFSA) and other published sources has been carried out.

Results. The review presents generalized characteristics of the most well-known sequencing formats based on different principles of reading and processing genetic information: capillary sequencing by Sanger, pyrosequencing, sequencing by ligation, sequencing by DNA synthesis, semiconductor high-performance sequencing, sequencing of individual DNA molecules. It is shown that multilocus analysis (MLST, MLVA) increases the specificity of genotyping and intraspecific identification of food-borne pathogens. It is used to assess the pathogenic potential and study the mechanisms of evolutionary variability of bacterial pathogens, leading to polymorphism of clonal lines and the appearance of strain-specific differences, to monitor the different genotypes of pathogens in production and other objects of the food chain. Nanopore sequencing is promising for studying bacterial plasmids and localization of resistance genes of MDR bacteria. Genome-wide analysis (WGS) makes it possible to identify detailed characteristics of pathogens of infectious diseases, including uncultivated and previously unknown microorganisms, as well as to study the features of the organization of individual pro- and eukaryotic genomes, gene regulation systems, pathogenicity factors and protein expression. The role of WGS methods for determining the degree of genetic kinship of infectious agents isolated from various sources in the investigation of outbreaks and sporadic food poisoning and infections is shown. The possibilities of metagenomic sequencing in the study of species composition, genetic diversity and metabolic potential of microbial communities are demonstrated. The main advantage of metagenomics is the possibility of direct sequencing of the genomes of microorganisms living in the human body, animals, water, soil and other objects. Metagenomic analysis plays a leading role in the detection of unexplored taxa, uncultivated and difficult-to-cultivate forms of a wide range of microorganisms. The most important direction of metagenomics is the study of the human or animal microbiome, the analysis of the relationship between the intestinal microbiota and metabolism, as well as the formation of the nutritional status of a person. Theoretical and practical aspects of the implementation of high-performance sequencing methods in the system of food biosafety assessment and control are reviewed: safety assessment of genetically modified strains of food producers, development of fundamentally new algorithms for investigating outbreaks of infectious diseases, creation of network systems for early diagnosis and notification of food infections of bacterial and viral etiology.

Conclusion. Sequencing should become a standard methodology in the field of food safety for the identification and characterization of food pathogens, including those with resistance to antibiotics and adverse technological effects. The introduction of WGS into the food safety assessment and control system will make it possible to assess real food contamination with new and newly returning pathogens, create electronic databases and scientifically substantiate the most adequate measures for the prevention of food infections and ensuring the health of the population.

Keywords: sequencing, pathogenic microorganisms, identification, genome, food safety, foodborne infections

С появлением принципиально новых молекулярно-генетических и биоинформационных технологий в различных сферах человеческой деятельности открылись новые возможности и перспективы углубленного изучения прокариотических и эукариотических организмов, позволяющие решать фундаментальные и практические задачи микробиологии, биотехнологии, генной инженерии и медицины. В этой сфере ведущее место отводится использованию методов секвенирова-ния нуклеиновых кислот, позволяющих изучать геномы отдельных микроорганизмов и метагеномные характеристики микробных сообществ с учетом их разнообразия и распространенности в различных биотопах.

Создание и использование методов секвенирования стало возможно вследствие развития компьютерных технологий, микропроцессоров, накопления и непрерывного расширения цифровых баз данных, включающих информацию о генетических структурах про-и эукариотов.

Методы анализа нуклеотидных последовательностей (определения порядка расположения нуклеотидов в молекулах или фрагментах ДНК), известные под общим названием «секвенирование», включают несколько платформ, базирующихся на разных принципах считывания и обработки генетической информации.

Разработанный Фредериком Сэнгером в 1975 г. метод секвенирования фрагментов ДНК, основанный на принципе терминации (обрыва) растущей цепи за счет добавления радиоактивно или флуоресцентно меченых дезоксинуклеотидов, используется до настоящего времени вследствие высокой точности при чтении отдельных фрагментов длиной до 500-1000 нуклеотидов [1]. Этот метод, известный также под названием «капиллярное секвенирование», применяется преимущественно для анализа мутаций и полиморфизмов генов [2, 3], идентификации широкого спектра организмов (вирусов, бактерий, грибов, растений) [4, 5], валидации данных, полученных другими методами секвенирования [6, 7], анализа микросателлитов (коротких тандемных некоди-руемых генов, повторяющихся в геноме) [8].

Дальнейшее развитие методов было направлено на повышение производительности выполнения анализов за счет одновременного прочтения множества цепочек ДНК. Массивное параллельное секвенирование, отнесенное к методам нового поколения - «next generation sequencing» (NGS), позволяет автоматически производить миллиарды считываний нуклеотидных последовательностей, выделенных из большого количества различных образцов [9].

В настоящее время продолжается совершенствование платформ NGS c целью сокращения продолжительности и снижения стоимости анализов. К числу наиболее широко используемых технологий высокопроизводительного NGS-секвенирования относятся:

- платформа 454 Life Science (Roche Diagnostics), реализующая принцип пиросеквенирования (сек-венирования ДНК путем синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы и регистрации

выделяющихся молекул пирофосфата, количество которых эквимолярно числу присоединенных нуклеотидов). На базе 454 Life Science были созданы первые автоматические секвенаторы, которые могли использоваться в лабораториях различного уровня для проведения фундаментальных и прикладных генетических исследований. Технические характеристики пиросеквенаторов 454 GS FLX+ и 454 GS Junior обеспечивали наибольшую длину прочтений (в среднем 750 нуклеотидов), что являлось значительным конкурентным преимуществом перед другими NGS-платформами. К недостаткам платформ 454 Life Science относились проблемы с чтением го-мополимеров, связанные с нелинейностью люминесцентного сигнала при одновременном встраивании в цепь ДНК большого числа дезоксинуклеотидтри-фосфатов (дНТФ) одного типа [3, 9, 10]. Несмотря на статус общепризнанного высокопроизводительного оборудования, секвенаторы 454 GS FLX+ и 454 GS Junior сняты с производства с 2016 г. вследствие появления более эффективных платформ нового поколения;

- технология SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection, Life Technologies Thermo Fisher Scientific), основанная на эмульсионной полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) и секвенировании нуклеиновых кислот путем лигирования с использованием ДНК-лигазы - фермента, образующего ковалентную связь между 5'-фосфатом и З'-гидрок-силом в одноцепочечных молекулах после отжига двухцепочечной ДНК (ДНК-дуплекса); регистрация флуоресцентного сигнала при лигировании меченых олигонуклеотидов обеспечивает высокую достоверность прочтений для коротких фрагментов (до 75 нуклеотидов) при максимальном количестве образцов - свыше 1000; этот способ позволяет анализировать последовательность ДНК в любом направлении в отличие от других вариантов с применением ДНК-полимеразы; секвенирование на основе лигирования используется платформами ABI 5500/5500x1 SOLiD, SOLiD 4, ABI 5500W/5500Wxl SOLiD;

- платформа Illumina (Solexa) применяет клональную ПЦР на поверхности чипа («мостиковая» ПЦР) и сек-венирование синтезом ДНК, принцип метода заключается в регистрации присоединения нуклеотида по отщепляемой флуоресцентной метке; длина чтений может достигать 250 нуклеотидов, максимальное число одновременно протестированных образцов варьирует от 96 до 192 в зависимости от типа секве-натора при длительности секвенирования до 2 дней (Illumina MiSeq);

- полупроводниковое секвенирование Ion Torrent (Life Technologies) на платформах Ion GeneStudio S5, Ion GeneStudio S5 Plus, Ion GeneStudio S5 Prime - это метод определения последовательности ДНК, основанный на детекции изменения рН в результате высвобождения ионов водорода в ходе фермен-

тативного синтеза ДНК; Ion Torrent обеспечивает большую длину прочтений (до 400 нуклеотидов) с максимальным количеством тестируемых образцов - до 384 проб; время секвенирования сокращается до 2-4 ч, уровень достоверности составляет 99%.

Общими этапами выполнения анализа методами высокопроизводительного секвенирования являются:

- подготовка библиотеки, включающая фрагментацию геномной ДНК с использованием случайных праймеров, присоединение адаптеров (небольших участков ДНК известной последовательности, с которых начинается амплификация или секвениро-вание), баркодирование и прикрепление фрагментов ДНК к поверхности микросфер или к плоской поверхности, амплификация иммобилизованных цепочек;

- секвенирование и последующая обработка каждого цикла с помощью различных форматов считывания информации: измерения рН, регистрации флуоресценции, хемилюминесценции и другими методами.

Отдельным направлением NGS-технологий является секвенирование одиночных молекул ДНК (Single molecule real time sequencing, SMRT), которое не требует проведения клональной амплификации или синтеза цепи и позволяет избежать искажений, возникающих при копировании тестируемого материала. Наиболее перспективным в этом отношении следует считать технологию секвенирования с использованием нанопор. Принцип метода заключается в измерении силы тока при прохождении одноцепочечной ДНК через клеточные поры или искусственно созданные мембраны под действием электрического поля. Каждый тип азотистых оснований по-разному закупоривает поры и соответствующим образом влияет на характеристику сигнала, поэтому исходные нуклеотиды и их модификации можно выявить в одном цикле секвенирования в реальном времени [9, 11].

Нанопоровое секвенирование считается перспективным при подборе методологии изучения бактериальных плазмид и локализации генов резистентности (в плазмиде или геноме). Это дает возможность получения обоснованных эпидемиологических данных и новой информации об эволюции и механизмах появления полирезистентных бактерий. Особое значение на современном этапе приобретает оценка формирования устойчивости патогенов к антимикробным препаратам, которая требует применения новых, более достоверных методов детекции. Секвенирование плазмид, длина которых может достигать сотен тысяч пар оснований, с помощью традиционной технологии коротких прочтений затрудняется наличием большого количества повторов в ДНК. Применение нанопорового секвенирования плазмидной ДНК позволяет проводить анализ всей плазмиды в течение одного цикла без дополнительных процедур сборки [12, 13].

Секвенирование плазмидной ДНК для профилирования устойчивости к антибиотикам, проведенное

Шэньчжэньским научно-исследовательским институтом Китая, позволило воссоздать 20 полных плаз-мид при анализе 12 полирезистентных бактериальных штаммов Klebsiella pneumoniae за один 8-часовой цикл [14].

Одномолекулярное секвенирование длинных фрагментов ДНК находит применение в самых разнообразных областях. Это особенно важно при анализе транскриптомов клеток, поскольку позволяет выявить все возможные изоформы активных генов благодаря длине чтений, недоступных для других технологий NGS [15, 16]. Характерной особенностью таких нанопоровых секвенаторов (MinlON, GridION и др., Oxford Nanopore Technologies) является их компактность и совместимость с обычными компьютерами. Сравнительные характеристики NGS-платформ и методов секвенирования приведены в табл. 1.

В результате секвенирования на платформах NGS создается значительный массив данных, требующий автоматизации процессов обработки и оценки качества детекции на основе биоинформационного анализа. Новые цифровые технологии позволяют быстрее развивать методы секвенирования и использовать более сложные алгоритмы, включающие сразу несколько приложений и программ.

Использование современных NGS-методов секвенирования в микробиологии

Геномы живых организмов содержат достаточно информации как для их идентификации и классификации, так и для определения физиологических свойств или функциональных характеристик микроорганизмов, а также для оценки биоразнообразия различных экосистем. Высокая производительность и относительная доступность этих методов позволяют проводить ранее технически невыполнимые исследования. Методы сек-венирования нового поколения позволяют значительно повысить уровень микробиологических и эпидемиологических исследований, включая оценку биобезопасности новых видов пищевой продукции, мониторинг и типирование эпидемиологически значимых патогенов, изучение природы и механизмов передачи антимикробной резистентности бактерий, анализ структуры микро-биома человека и животных.

Ниже приведены основные направления использования NGS-секвенирования в пищевой микробиологии, эпидемиологии, биотехнологии и смежных с ними областях науки.

Мультилокусное секвенирование

Одним из главных подходов при генетическом типиро-вании микроорганизмов является анализ нуклеотидных последовательностей и определение функциональной роли конкретных элементов генома с целью поиска

Таблица 1. Основные параметры методов секвенирования (платформ next generation sequencing) Table 1. Main parameters of sequencing methods (next generation sequencing platforms)

Методы Пиросеквениро- Секвенирование Секвенирование Полупроводниковое Одномолекулярное

(платформы) Methods вание Pyrosequencing лигированием Sequencing синтезом Sequencing секвенирование Semiconductor секвенирование Single-molecule sequencing

(platforms) by ligation by synthesis sequencing SMRT-ячейки SMRT wells нанопоры nanopores

Модель секвенатора GS Р1_Х+ (454/ВосИе) SOLiD 5500W HiSeq2000, MiSeq Ion Torrent PacBio RS II MinlON

Длина прочтения, 400-1000 До 75 (2x50, для 2x100 HiSeq 35-400 До 20 000

пар нуклеотидов (в среднем 750) сопряженных пар) 2x250 MiSeq (в среднем 5000)

Время секвениро- 24 ч 7-12 сут 11 сут HiSeq 2 ч 30-120 мин 1-2 ч

вания 2 сут MiSeq

Преимущества Длинные про- Высокая точность, Часто используе- Невысокая стои- Не требуют амплификации,

чтения низкая стоимость мая платформа мость оборудования, минимальная длительность анализа, минимальное число ошибок, высокая скорость проведения анализа, длинные

низкие трудозатраты прочтения

Недостатки Высокая стои- Короткие чтения, Высокая стоимость Ошибки чтения Специфическая область

мость анализа, необходимость оборудования, гомополимеров применения

ошибки чтения сборки гибридов необходимость

гомополимеров сборки гибридов

Производитель- 106 4x108 6x109 HiSeq 1,2x107 3,5x104-7,5x104

ность, число прочте- 1,7x107 MiSeq

ний в 1 цикле

Достоверность, % 99,9 99,94 98 99 99,999

гомологичных участков и подобных фрагментов ДНК у исследуемых культур в сопоставлении с известными тест-штаммами.

В основе мультилокусного анализа лежит секвениро-вание нескольких консервативных генов жизнеобеспечения микробных клеток (MLST - Multi-locus sequence typing) или участков генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA - Multi-locus variable-number tandem repeat analysis). Целью MLST является обнаружение аллельных вариантов и построение аллельного профиля изучаемых штаммов. Этот подход позволяет характеризовать и оценивать влияние условий среды на разные микробные виды, используя ДНК-фрагменты нескольких «house keeping» генов. Сиквенс-типы (MLST-профили) патогенов хранятся в базах данных, которые доступны через PubMLST (www.pubmlst.org) или другие ресурсы, например BIGSdb software (https://bigsdb. pasteur.fr/) [17, 18].

Multi-locus sequence typing широко используется для выявления различий в нуклеотидных последовательностях между штаммами на внутривидовом уровне, поскольку позволяет определять гены-маркеры для конкретных возбудителей, устанавливая возможные эволюционные связи между циркулирующими штаммами и их персистирующие генотипы.

Впервые метод MLST был применен в 1998 г. для ти-пирования штаммов Neisseria meningitides [19] и далее получил распространение при изучении большого числа видов, в том числе пищевых бактериальных патогенов Campylobacter jejuni, E. coli, Salmonella spp., Vibrio chole-rae, Listeria monocytogenes и др. [20-22]. В современных эпидемиологических исследованиях MLST играет суще-

ственную роль, в частности для описания или баркоди-рования определенных клональных линий патогенов, присущих конкретным объектам [23].

Наряду с положительными аспектами этот метод не позволяет дифференцировать генетически мономорф-ные штаммы с узким спектром различий в консервативных участках ДНК. Поэтому для субтипирования таких штаммов используют метод MLVA, основанный на анализе коротких повторяющихся последовательностей (не более 20 нуклеотидов), который позволяет более четко выявлять полиморфизм генов близкородственных штаммов.

При сравнении MLST и MLVA отмечена более высокая информативность MLVA-тестирования при установлении филогенетических связей и происхождения штаммов. MLVA позволяет выявить субварианты среди изолятов, относящихся к одному MLST-типу [24].

Так, MLST-типирование E. coli проводят с набором консервативных участков, который содержит гены adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA и recA [25]. В то же время для тестирования Neisseria используют набор, состоящий из генов abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC и pgm [26]. Проблемы перекрестного совпадения тестируемых фрагментов «house keeping» генов снижают потенциал метода как универсального инструмента внутривидового баркодирования штаммов. Расширение спектра маркерных генов обеспечивает повышение чувствительности анализа за счет снижения числа повторов и выявления новых вариаций полиморфизма генов. Для увеличения числа диагностических наборов с большим числом генов используют методы высокопроизводительного секвенирования, например, вариант SRST с короткими

прочтениями, реализованный на платформе Illumina, который позволяет проводить автоматическое сопоставление прочтений с таргетными последовательностями сиквенсов из базы данных PubMLST [27].

Патогенные микроорганизмы, относящиеся к одному определенному виду, могут обладать одинаковыми наборами факторов вирулентности, а также основными биохимическими и геномными характеристиками. Однако эволюция бактериальных патогенов одного и того же вида, попадающих в различные условия, приводит к полиморфизму клональных линий и появлению штам-моспецифических различий, имеющих наибольшую значимость для оценки патогенного потенциала возбудителя.

Исследование штаммов L. monocytogenes, выделенных из пищевых продуктов и от больных листериозом, с помощью мультилокусного секвенирования, включавшего 7 «house keeping» генов и 4 гена вирулентности, выявило наиболее распространенный среди депонированных в России генотип L. monocytogenes ST7, потенциально способный вызывать вспышки и спорадические случаи инвазивного листериоза [28].

Паспортизация патогенной микрофлоры, в том числе возбудителей эмерджентных пищевых инфекций, позволяет достоверно и быстро идентифицировать штамм микроорганизма, вызвавшего заболевание, а также принять наиболее действенные меры по локализации очагов инфекции.

Учитывая распространенность бактерий рода Сampylobacter в общей структуре агентов пищевых инфекций, следует отметить, что обнаружение этих патогенов связано с рядом методических трудностей, поскольку традиционные культурально-морфологиче-ские характеристики бывают недостаточны для идентификации возбудителя. Например, C. jejuni, выделенный впервые в 1962 г. при бактериемии у больных лейкемией детей, был идентифицирован как возбудитель диарей-ных инфекций в педиатрии только после применения селективных методов исследования. Между тем при изучении роли других видов кампилобактеров в этиологии бактериемий было показано [29], что они могут ингибироваться при использовании селективных сред для выделения C. jejuni, а потому оценка их эпидемиологической значимости требует применения современных высокоспецифических методов геномного и транс-криптомного анализа, позволяющих по-новому оценить место различных видов Campylobacter в рейтинге эмер-джентных кишечных патогенов. К ним относятся MLST-генотипирование, NGS-технологии секвенирования нового поколения и др.

Анализ генетической изменчивости бактерий рода Campylobacter, проводимый путем идентификации мозаичных аллелей и мультилокусных сиквенс-типов (MLST) разных видов кампилобактеров, указывает на особую значимость эволюционных процессов, обеспечивающих трансформацию слабопатогенных представителей таксона в эмерджентные патогены с высокой степенью агрессии. Например, комменсалы Campylobacter coli

в результате межвидовой гибридизации превращаются в патогенные формы, которые обладают таким вирулентным потенциалом, который может использоваться в качестве модели для изучения эффектов интрогрессии [30].

Методы мультилокусного секвенирования позволяют исследовать только конкретные элементы или часть генома. Для получения исчерпывающей информации о структуре всего генома и особенностях его организации необходимо применение более сложных алгоритмов, к которым в первую очередь можно отнести полногеномное секвенирование (whole genome sequencing, WGS).

Полногеномный анализ предназначен для секве-нирования цельных геномов широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, археи, дрожжи, грибы, а также всех ДНК/РНК вирусов. Используется как в научных, так и в прикладных целях, открывая новые возможности для развития пищевой микробиологии, биотехнологии, вирусологии и эпидемиологии. Полногеномный анализ, основанный на построении полной кольцевой молекулы ДНК, позволяет выявлять детальные характеристики возбудителей инфекционных заболеваний, включая некультивируемые и ранее неизвестные микроорганизмы, а также изучать особенности геномов прокариотов и эукариотов, факторы патогенности и механизмы регуляции экспрессии генов [31].

Современная биоинформатика делает процесс полногеномного секвенирования ДНК доступной процедурой, особенно в тех случаях, когда речь идет об организмах с уже известной последовательностью генома; их сборка не представляет значительных затруднений, поскольку уже имеется ранее секвенированный рефе-ренсный геном, что позволяет избежать ошибок при биоинформационной оценке полученных данных. При секвенировании неизвестного генома (de novo) возникает ряд более сложных задач, в ходе решения которых необходимо объединить множество фрагментов в единую последовательность, задействовать многочисленные математические алгоритмы и суперкомпьютерные ресурсы. Наиболее продолжительным и трудоемким этапом секвенирования de novo является его завершение с получением кольцевой молекулы ДНК.

Оценка генетического разнообразия штаммов патогенов имеет большое значение для решения диагностических задач, устанавливающих особенности циркуляции возбудителей инфекций в различных географических и климатических зонах, при расследовании этиологии вспышек и спорадических заболеваний.

Полногеномный анализ все чаще применяют в биотехнологии и генной инженерии при конструировании новых штаммов, в том числе методами синтетической биологии, когда задаются новые полезные свойства продуцентов, используемых в различных отраслях пищевой индустрии и в кормопроизводстве, при создании лекарственных препаратов, средств защиты растений и др. Для таксономической и штаммоспецифической идентификации, оценки потенциальных факторов па-тогенности и технологического потенциала биотехно-

логических культур проводят подбор и анализ разных наборов диагностических генных маркеров; в качестве наиболее пригодного подхода в биотехнологии признаны методы ДНК-баркодирования продуцентов. Растущая популярность генетического баркодирования для идентификации и оценки подлинности биотехнологических продуцентов определяется преимуществами NGS в сравнении с традиционными методами генетической идентификации, основанными преимущественно на детекции 16s рРНК регионов у производственных штаммов.

Первым проектом полногеномного секвенирования считают построение в 1995 г. генома патогенных Haemophilus influenza [32], в том же году был расшифрован наименьший из ранее известных геномов свободно живущих бактерий Mycoplasma genitalium [33]. В дальнейшем были получены полные сиквенсы свыше 5000 микробных геномов, среди которых основную часть составляли бактерии (85%), а также около 400 штаммов архей и эукариотов [15].

Полногеномный анализ бактерий рода Сampylobacter впервые был проведен в 2000 г. [34], когда был сек-венирован референсный штамм C. jejuni NCTC 11168, после чего геномные сиквенс-профили кампилобакте-ров начали широко исследоваться в различных странах. Наибольшее значение приобрело секвенирование вида C. jejuni (87 штаммов), а также других видов Сampylobacter spp. Эти данные широко применяются в различных исследованиях, включая изучение экологии и эволюционной изменчивости возбудителей кампилобактериоза [35, 36].

При проведении молекулярно-генетических исследований возбудителей инвазивного листериоза L. monocytogenes было показано, что для расследования спорадических заболеваний и эпидемических вспышек необходимо полногеномное секвенирование возбудителя с анализом корового генома и определением количества локусов, отличающих клинические и пищевые изоляты [28, 37, 38].

Изначально полногеномные исследования фокусировались лишь на секвенировании патогенных бактерий, тогда как в настоящее время более 50% работ имеют биотехнологическую направленность, а на долю возбудителей инфекций приходится около 40% проектов [15]. Менее 2% работ посвящено изучению редких и малоизвестных микроорганизмов (экстремофилов и др.).

В общей структуре методов NGS-секвенирования полногеномный анализ по сложности и информативности занимает одно из ключевых мест (рис. 1).

Метагеномные исследования проводятся с целью расшифровки видового состава, генетического разнообразия и метаболического потенциала микробных сообществ, для установления корреляционных зависимостей между генетическими структурами организмов и условиями их обитания. Такие исследования позволяют выявлять генные маркеры заболеваний и адаптации организмов к внешним воздействиям.

Основное преимущество метагеномики состоит в возможности прямого секвенирования геномов микробных

сообществ, обитающих в организме человека, животных, в воде, почве и других биотопах. При этом не требуются выделение, предварительное культивирование чистых культур и фенотипическое тестирование изолятов. В свете современных знаний о присутствии в разнообразных средах некультивируемых видов микроорганизмов метагеномный анализ играет ведущую роль в обнаружении неизученных таксонов и трудно-культивируемых форм широкого спектра бактерий, вирусов, бактериофагов, архей и микроэукариотов [39-42].

Проведение метагеномных исследований включает 2 основных направления: анализ маркерных консервативных генов, включая регион 16s рРНК, и секвенирова-ние метагеномной ДНК методом случайного фрагменти-рования (whole metagenome shotgun sequencing).

Анализ видового состава смешанных микробных сообществ проводится с использованием универсальных праймеров, специфичных для эволюционно стабильных регионов генома [43]. Наиболее часто для идентификации таксонов разных уровней используют нуклеотидные последовательности 16s рРНК или другие консервативные фрагменты геномной ДНК (vacA, cpn60, recA, radA, groEL и др.).

Применение метагеномного анализа для пищевых матриц дает возможность исследовать опожный гетерогенный состав микробных контаминантов без селективной изоляции отдельных штаммов, выявляя наряду с целевыми патогенами некультивируемые формы микробов [44]. В большинстве метагеномных исследований микробных сообществ применяют метатаксономический подход на основе анализа 16s рРНК, наиболее информативный для идентификации бактерий, филогенетических исследований и характеристики бактериальных сообществ в пищевых продуктах, воде и других средах [10]. Однако анализ 16s рРНК-региона обладает ограниченной разрешающей способностью и не может быть использован для обнаружения небактериальных таксонов, например в сообществе микромицетов. Метатак-сономическая идентификация редко выходит за рамки семейства или рода, и лишь отдельные патогены могут быть определены до вида. Так, метатаксономика может применяться для детекции сальмонелл, все представители которых являются патогенами, она также частично позволяет выявлять L. monocytogenes на фоне других листерий [22, 45]. Напротив, консервативные последовательности 16s рРНК не дифференцируют энтерогемор-рагические E. coli (ЕНЕС) от диарейных патотипов E. coli или комменсальных эшерихий; для прямого выявления и типирования энтеропатогенных E. coli необходимо расширение спектра маркерных генов.

Для филогенетического анализа и дифференциации микроорганизмов родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus достаточно часто используют дополнительные панели генов, кодирующие экспрессию белков теплового шока, факторы элонгации транскрипции и антибиотикорезистентность [3, 46-49].

Метагеномный shotgun-анализ дает более полное представление о микробном разнообразии образца

Рис. 1. Молекулярно-генетический анализ ДНК/РНК микроорганизмов на основе секвенирования нового поколения (next generation sequencing - NGS) (основные алгоритмы, технологии, область применения)

Fig. 1. Molecular genetic analysis of DNA/RNA of microorganisms based on next generation sequencing (algorithms, technologies, scope of application)

в отношении спектра выявляемых таксонов, он также позволяет анализировать наличие биомаркеров или семейств генов патогенности [50, 51]. Биоинформационный анализ данных позволяет различать геномы представителей одного вида, однако штаммоспецифи-ческие различия в таких исследованиях требуют выделения чистых культур и применения других форматов NGS.

В ретроспективном исследовании крупнейшей вспышки энтерогеморрагического эшерихиоза в Германии/ЕС в 2011 г., вызванной новым патогенным сероти-пом E. coli 0104:Н4, применение метагеномного shotgun-подхода и анализ набора 450 специфических маркерных генов (environmental gene tages, EGT) позволили реконструировать геном возбудителя и подтвердить его присутствие в пробах фекалий от больных [52].

Важным аспектом изучения метагеномики является микробиом человека или животных, представляющий собой сложнейший геномный резервуар (метаге-ном) с разнообразными формами взаимоотношений между микроорганизмами в многокомпонентной струк-

туре, активно взаимодействующей с организмом хозяина [15]. Ее состав определяется во многом теми субстратами, которые формируются макроорганизмом из потребляемой пищи, и присутствующими в ней микроорганизмами, что связывает в неразрывное целое состав и качество нутриентов, процессы пищеварения, мукозальный иммунитет и структуру кишечного микробиома. Поэтому задачи изучения микробиома метагеномными методами в том числе проецируются и на метагеном потребляемых рационов.

Широкомасштабные исследования микробиома проводятся начиная с 2008 г. и в настоящее время крупнейшими консорциумами, в том числе Европейский MetaHit, Human Microbiome Project (США) и др. [53, 54]. В России создан открытый портал Metagenome.ru (Российский метагеномный проект) - консорциум ведущих медицинских, биологических и аналитических центров России, целью которого является исследование биологических сообществ, с которыми ассоциирован организм человека. Координация проводимых в мире иссле-

дований микробиома человека осуществляется главным международным объединением - International Human Microbiome Consortium [55]. В рамках проекта проведено секвенирование более 3000 микробных геномов, т.е. 60% от всех секвенированных бактериальных видов, связанных с человеком.

Количественная метагеномика позволяет определять профили гомологичных генов путем картирования коротких фрагментов и создания референс-каталогов, что обеспечивает возможность оценки генетической вариабельности метагенома. В отличие от полногеномного анализа de novo, данный подход используется для изучения биоразнообразия и метаболического потенциала различных микробиомов (рис. 2).

Актуальными направлениями научных исследований кишечного микробиома являются:

- изучение таксономии на уровне от филотипа до подвида;

- диагностика различных заболеваний с использованием параметров микробиома;

- изучение механизмов, способствующих восстановлению микрофлоры человека;

- возможность использования этих данных для персонализированной медицины.

Современные знания о составе микробиома кишечника человека показывают его ведущую роль в регуляции обменных процессов организма, усвоении всех типов пищевых веществ, эндогенном синтезе эссенци-альных для нормального пищеварения и жизнедеятельности ферментов, витаминов и биологически активных соединений, т.е. факторов, определяющих нутриом. В рамках разработки формулы оптимального питания это обусловливает необходимость обоснования состава кишечного микробиома здоровых людей и путей коррекции его нарушений для повышения адаптационного потенциала человека, а также для снижения распространенности алиментарно-зависимых заболеваний, в первую очередь ожирения [56].

Очевиден интерес к изучению связи между составом микробиоты, в первую очередь кишечной, и наиболее распространенными неинфекционными заболеваниями. В то же время важно учитывать взаимовлияние потребляемых макро- и микронутриентов как составляющих нутриома и кишечной микробиоты у человека, проводить анализ информации об исследовании таких аспектов, как «питание, метаболизм, микробиом», на здоровых людях, не имеющих алиментарно-зависимых патологий [57].

С 2018 г. в ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» проводятся исследования, включающие:

- анализ современных данных по изучению процесса формирования кишечной микробиоты в онтогенезе на всех этапах развития организма;

- анализ характера взаимодействия микробиоты с пищевыми веществами с учетом ее индивидуальной, популяционной и нозологической вариабельности, иммуногенной, метаболической и регуляторной функции;

Характеристики микробиома: ^ индекс биоразнообразия ^ состав таксонов ^ энтеротипы ^ сигнатуры ^ метаболические характеристики ^ генетическая вариабельность

Метагеномные профили

и количественные характеристики генов

Рис. 2. Схема количественного метагеномного анализа на основе референсного каталога генов

Fig. 2. Scheme of quantitative metagenomic analysis based on the reference catalog of genes

- изучение качественного и количественного состава кишечной микрофлоры у здоровых людей и пациентов с алиментарно-зависимыми заболеваниями (ожирение, пищевая аллергия, синдром раздраженного кишечника) культуральными и ПЦР-методами. Это дало понимание того, что характер питания способствует отбору микроорганизмов, обладающих генетической способностью к их метаболизации и выживанию в создающейся биохимической среде. При этом если механизмы качественного влияния компонентов рациона питания на представителей микробного сообщества в основном прояснены, то связи между оптимальными уровнями нутриентов, присутствием в пище микробных генов, ассоциированных с тучностью (принадлежащих филумам Proteobacteria, Firmicutes), и количественными показателями микрофлоры пока изучены недостаточно.

Поэтому в настоящее время проводятся метагеномные исследования, направленные на изучение взаимосвязей кишечного микробиома с питанием и формированием пищевого статуса человека. С 2020 г. для выполнения анализов используются NGS-методы в системе высокопроизводительного полупроводникового секвенирова-ния на платформе Ion Torrent.

Применение NGS-секвенирования в системе оценки безопасности пищевой продукции

Функционирование национальных и международных систем профилактики токсикоинфекций от пищи и минимизации рисков микробной природы, возникающих на тех или иных участках пищевой цепи, требует постоянной актуализации санитарно-эпидемиологических мер защиты населения, в том числе внедрения новых

Таблица 2. Примеры применения секвенирования нового поколения (next generation sequencing - NGS) для анализа пищевых патогенов при расследовании вспышек и проведении контрольных мероприятий

Table 2. Examples of next generation sequencing application for the analysis of foodborne pathogens in the investigation of outbreaks and under control measures

Виды патогенов (год и место вспышки) Pathogens (year and place of outbreak) Объекты секвенирования Sequencing objects NGS-nnan|io|jMa NGS platform Метод Method Литература References

E. coli серотипа O157:H7 (ЕНЕС) (Великобритания, 2013) 70 штаммов, выделенных в двух вспышках и нескольких спорадических случаях эшерихиоза HiSeq2500 (Illumina), 200PE* WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующим сопоставлением с эталонным геномом и анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [60]

E. coli серотипа O157:H7 (США, 20012012) 29 штаммов, в том числе 24 выделены при вспышке MiSeq (Illumina), 150PE WGS-секвенирование отдельных изолятов de novo и анализ SNP [61]

E. coli серотипа O157:H7 (Великобритания, 2007-2012) 105 штаммов: 10 изолятов от больных, выделенных при вспышке, 95 - при спорадических случаях Ion Torrent PGM (Life technologies) WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующим сопоставлением с эталонным геномом и анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [62]

Шигатоксин-проду-цирующие E. coli нескольких серотипов (Дания, 2012) 46 штаммов: 6 изолятов от больных, выделенных при вспышке, 40 - при спорадических случаях Ion Torrent PGM WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующим MLST- типированием), филогенетический анализ относительно 5029 бактериальных геномов [20]

E. coli серотипа 0104:H4 (Германия/ ЕС, 2011) 45 проб фекалий от больных MiSeq 151PE m HiSeq 2500 151PE Ретроспективное исследование с применением shotgun-метагеномного анализа; выделение ДНК in silico с последующей сборкой de novo; картографирование и филогенетический анализ для функционального аннотирования и реконструкции геномов штаммов, вызвавших вспышки [52]

L. monocytogenes (Австрия, 20112013) 18 изолятов, в том числе: 7 штаммов от людей, 10 пищевых изолятов, 1 референсный штамм MiSeq, 75PE, 150PEm 250PE WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующей сборкой de novo и расширенным MLST-анализом [63]

Salmonella Typhimurium (Австралия, 2006-2012) 57 штаммов из 5 вспышек MiSeq, 250PE WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующей сборкой de novo и анализом SNP [64]

Salmonella Enteritidis (США, 2001-2012) 55 изолятов: 28 штаммов из 7 вспышек, 27 выделены при спорадических заболеваниях MiSeq, 250PE WGS-секвенирование отдельных изолятов с последующим анализом SNP [65]

Listeria monocytogenes в смеси с другими видами микробных контаминантов (США, 2010-2015) Контаминированное мороженое MiSeq Секвенирование 16s рРНК ампликонов и shotgun-метагеномное секвенирование: таксономическая идентификация и субтипирование L. monocytogenes путем картирования в PYNAST на основе ссылок с геномами L. monocytogenes [66]

* - РЕ - длина прочтения, пар нуклеотидов (bp).

* - РЕ -read length, bp.

методов молекулярно-генетического анализа и инновационных цифровых технологий в контроль пищевой продукции и диагностику возбудителей пищевых инфекций.

Эти меры предусматривают верификацию идентифицированных сигналов, расследование инцидентов, в том числе вспышек инфекций и отравлений, и быстрое оповещение всех задействованных сторон и общественности на местном, региональном и, при необходимости, на межнациональном уровне. Вышеназванные системы не могут быть изолированными с учетом современных масштабов международной торговли, их необходимо включать в действующие инфраструктуры по надзору в сфере санитарно-эпидемиологического благополучия, ветеринарного и фитосанитарного контроля, а также национальных агропромышленных комплексов.

Следует отметить многоплановость научных и практических подходов к созданию сетевых систем мониторинга и быстрой диагностики причинных агентов пищевых токсикоинфекций бактериальной и вирусной этиологии [58, 59]. Появление нового типа высокоди-спергированных пищевых вспышек, обусловленных централизацией производств и транспортировкой готовой продукции на дальние расстояния в разные регионы, требует принципиально новых алгоритмов расследования таких вспышек и создания сетевых систем контроля, мониторинга и обмена информацией.

В табл. 2 приведены примеры расследования вспышек пищевых токсикоинфекций и спорадических заболеваний с применением методов WGS и М1_БТ-типирования, которые позволили эффективно определять этиологических агентов данных заболеваний у потребителей,

Таблица 3. Применение секвенирования нового поколения (next generation sequencing - NGS) в системе надзора за инфекционными заболева-Table 3. Application of next generation sequencing (NGS) methods in the surveillance system for infectious diseases

Основные преимущества Main advantages Потенциальные недостатки Potential drawbacks Возможные пути их преодоления Possible ways to overcome them

Максимально высокая производительность, специфичность и чувствительность NGS-анализ дает более точную информацию о пищевых патогенах, чем обычные методологии, предоставляя практически всю последовательность генома возбудителя. Регулирующие органы проводят расследования вспышек целенаправленно, ограничивая количество вовлеченных пищевых продуктов, а также масштабы вспышек и число пострадавших NGS-анализ генерирует большое количество первичных данных (в диапазоне тера- и петабайт), что требует дополнительных мощностей на их обработку; хранение данных на локальных серверах может быть дорогостоящим Для хранения данных требуется как физическое, так и виртуальное пространство. Одним из возможных решений является представление результатов в общедоступные (облачные) хранилища данных

Доступная стоимость NGS-анализ является менее дорогостоящим, чем большинство методов молекулярного типирования, предоставляет возможность одновременно устанавливать видовую принадлежность, серотип и факторы вирулентности патогена, а также определять профили антимикробной резистентности изолятов без дополнительных анализов Стоимость оборудования и расходных материалов для секвенирования остается непомерно высокой для региональных лабораторий, которые не выполняют генотипирование патогенов Централизация лабораторного звена. Стоимость NGS-секвенирования постепенно снижается и эта тенденция, вероятно, сохранится в дальнейшем

Универсальность тестирования Не требует аккредитации лабораторий по каждому методу, в отличие от традиционных способов идентификации и типирования конкретных видов патогенов Большие объемы данных, генерируемые секвенаторами, необходимо передавать через интернет. Ограниченная пропускная способность сетей затрудняет передачу анализируемых файлов Развитие национальной и межрегиональной инфраструктуры

Скорость выполнения анализов При оптимальном дизайне эксперимента результаты NGS могут быть получены в течение 2-7 дней, что обеспечивает установление конкретных связей между изолятами в режиме реального времени, препятствуя развитию вспышки на ранних этапах возникновения заболевания. Эти преимущества могут способствовать своевременному принятию экстренных мер защиты, а также сократить потери пищевой продукции (вследствие отзыва партий продуктов) и нанесенный экономический ущерб Большинство лабораторий не имеет специалистов-биоинформатиков и, следовательно, не может в полной мере использовать преимущества NGS при проведении анализа собственных данных Доступ к программному обеспечению через онлайн-платформы (через международные базы данных), кооперация со специализированными сервисными центрами, включая обучение специалистов и консультативную помощь в исследованиях

Простота обучения и использования Методы NGS-секвенирования считаются относительно простыми в освоении по сравнению с традиционными методами, генотипирования и серодиагностики Интерпретация данных, особенно в сочетании с эпидемиологической информацией, может быть непростой Обучение микробиологов, выполняющих секвенирование, а также конечных пользователей данных является важной частью внедрения NGS-технологий

Простота обмена данными и принятия решений NGS предоставляет базовый общий язык, которым можно легко обмениваться по всему миру. Соответствующие данные могут храниться, анализироваться и рассматриваться в любое время в формате удаленного доступа. Это является дополнительным преимуществом по сравнению с существующими системами глобального обмена эпидемиологическими данными Затруднительно для развивающихся стран с ограниченными ресурсами и возможностями -

проживающих на разных территориях, единые источники инфицирования продукции и локализовать их распространение.

Подробное описание ключевых аспектов внедрения методов высокопроизводительного секвенирования в системе оценки и контроля пищевой безопасности приведено в опубликованном Продовольственной и сельскохозяйственной Организацией Объединенных Наций/Всемирной организацией здравоохранения (ФАО/ВОЗ) Техническом отчете «Applications of Whole Genome Sequencing in food safety management» (2016). В документе указывается, что технологии WGS, позволяющие секвенировать любые виды патогенов, обеспе-

чивают более простые, быстрые и менее дорогостоящие лабораторные процедуры в сравнении с традиционным типированием кишечных патогенов, требующим специфичных для возбудителя реагентов, протоколов и методов. Такие технологии с юридической точки зрения обеспечивают полную доказательность эпидемиологической связи между источником и местом попадания инфекционных агентов в инкриминируемые продукты, факторами по ходу пищевой цепи, способствовавшими их росту до опасных величин, и заболеванием у пострадавших.

Основными критериями для эффективного применения ^в-секвенирования, сформулированными ФАО/

ВОЗ, в странах с налаженными национальными системами контроля безопасности пищевых продуктов являются регулярные инспекции и тестирование объектов надзора, многоуровневый мониторинг и наличие систем реагирования, внутри- и межотраслевой лабораторной инфраструктуры, включая возможности для сбора, хранения и транспортировки проб. Помимо этого, должна поддерживаться технико-информационная база, а именно:

- достаточная пропускная способность применяемых платформ NGS-секвенирования для обеспечения экономической эффективности стандартных операционных процедур (СОП);

- обеспечение высокого научно-методического уровня при тестировании патогенных микроорганизмов, выделяемых из биоматериалов, пищевых продуктов и объектов внешней среды; повышение квалификации персонала и лицензирование деятельности лабораторий;

- наличие инфраструктуры во всех аспектах биоинформатики, включая техническую поддержку и компьютерные мощности (мощные серверы);

- обеспечение возможности хранения, обработки и передачи больших массивов цифровых данных.

С учетом этих положений были проанализированы преимущества методов NGS-cеквенирования и проблемы, возникающие при их внедрении в практику надзора (табл. 3).

Внедрение NGS в систему управления безопасностью пищевых продуктов может принести значительную пользу странам, поддерживающим международные проекты реагирования, тогда как государства, которые не используют эти технологии, могут оказаться в невыгодном положении в отношении экспорта продовольствия и туризма. Поэтому необходима глобальная координация работ в направлении широкого применения этой иници-

ативы. В настоящее время развиваются различные международные, региональные и национальные программы по продвижению и выполнению координирующей роли NGS в области биобезопасности пищевых продуктов, такие как, например, FDA Food Emergency Response Network (FERN) GenomeTrakr (GT) (https://www.youtube. com/watch?v=EsrHu6ozsz8) [67-69].

Существующие в Российской Федерации системы контроля возбудителей пищевых инфекций пока в ограниченной степени используют возможности современных достижений в области молекулярной биологии и генодиагностики. Применение новейших протоколов амплификации и секвенирования геномов микроорганизмов пока является сферой деятельности научных лабораторий [70-74].

Заключение

NGS-секвенирование имеет перспективы стать стандартной методологией в области безопасности пищевых продуктов для идентификации и характеристики патогенов пищевого происхождения, в том числе обладающих резистентностью к антимикробным препаратам и другим неблагоприятным воздействиям.

Совершенствование существующих систем мониторинга, диагностики и быстрого оповещения на всех уровнях - от национальных до межгосударственных -позволит оценить пути циркуляции в среде обитания человека наиболее опасных возбудителей, создать электронные базы данных и актуализировать алгоритмы управления безопасностью и качеством пищевой продукции путем внедрения целенаправленных мероприятий по профилактике любых новых и вновь возникающих возбудителей пищевых токсикоинфекций для защиты здоровья населения РФ.

Сведения об авторах

Ефимочкина Наталья Рамазановна (Natalya R. Efimochkina) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: karlikanova@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-9071-0326

Шевелева Светлана Анатольевна (Svetlana A. Sheveleva) - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация)

E-mail: sheveleva@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-5647-9709

Литература

1. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. Vol. 74, N 12. P. 5463-5467. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

2. Goto K., Omura T., Hara Y., Sadaie Y. Application of the partial 16S rDNA as an index for rapid identification of species in the genus Bacillus // J. Gen. Appl. Microbiol. 2000. Vol. 46, N 1. P. 1-8. DOI: https:// doi.org/10.2323/jgam.46.1

3. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф. Возможности и перспективы применения методов массивного параллельного секвенирова-

ния в диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями // Журнал МедиАль. 2014. № 2. C. 6-28.

4. Hyeon J.-Y., Li S., Mann D.A., Zhang S., Li Z., Chen Y. et al. Qua-simetagenomics-based and real-time-sequencing-aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples // Appl. Environ. Microbiol. 2018. Vol. 84, N 4. P. e02340-17. DOI: https://doi. org/10.1128/AEM.02340-17

5. Shendure J., Ji H. Next-generation DNA sequencing // Nat. Biotechnol. 2008. Vol.26, № 10. P.1135—1145. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt1486

6. Crossley B.M., Bai J., Glaser A. et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring // J. Vet. Diagn. Invest. 2020. Vol. 32, N 6. P. 767-775. DOI: https://doi.org/10.1177/1040638720905833

7. Beck T.F., Mullikin J.C.; NISC Comparative Sequencing Program, 26. Biesecker L.G. Systematic evaluation of Sanger validation of next-generation sequencing variants // Clin. Chem. 2016. Vol. 62, N 4.

P. 647-654. DOI: https://doi.org/10.1373/clinchem.2015.249623 27.

8. Bruske E., Otto T.D., Frank M. Whole genome sequencing and microsatellite analysis of the Plasmodium falciparum E5 NF54 strain show that

the var, rifin and stevor gene families follow Mendelian inheritance // 28. Malar J. 2018. Vol. 17, N 1. P. 376. DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-018-2503-2

9. Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В. NGS: высокопроизводительное секвенирование. Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. 232 с. ISBN: 978-5-9963- 29. 1784-4.

10. Sekse C., Holst-Jensen A., Dobrindt U., Johannessen G.S., Li W., Spilsberg B., Shi J. High throughput sequencing for detection of food-borne pathogens // Front. Microbiol. 2017. Vol. 8. P. 2029. DOI: https:// doi.org/10.3389/fmicb.2017.02029 30.

11. Wick R.R., Judd L.M., Gorrie C.L., Holt K.E. Completing bacterial genome assemblies with multiplex MinION sequencing // Microb. Genom. 2017. Vol. 3, N 10. P. e000132. DOI: https://doi.org/10.1099/ 31. mgen.0.000132

12. Liu Q., Fang L., Yu G., Wang D., Xiao C.L., Wang K. Detection of DNA base modifications by deep recurrent neural network on Oxford Nanopore sequencing data // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, N 1. P. 2449. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-10168-2 32.

13. Heikema A.P., Horst-Kreft D., Boers S.A., Jansen R., Hiltemann S.D., de Koning W. Comparison of illumina versus nanopore 16S rRNA gene sequencing of the human nasal microbiota // Genes (Basel). 2020.

Vol. 11, N 9. P. 1105. DOI: https://doi.org/10.3390/genes11091105 33.

14. Lemon J.K., Khil P.P., Frank K.M., Dekker J.P. Rapid nanopore sequencing of plasmids and resistance gene detection in clinical isolates // J. Clin. Microbiol. 2017. Vol. 55, N 12. Р. 3530-3543. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.01069-17 34.

15. Ta§tan Bishop O. (eds). Bioinformatics and data analysis in microbiology / Rhodes University Bioinformatics, Department of Biochemistry, Microbiology and Biotechnology, Rhodes University, South Africa. NorfolK, UK : Caister Academic Press, 2014. 248 р. ISBN: 978-1- 35. 908230-39-3. DOI: https://doi.org/10.21775/9781910190494

16. Li R., Xie M., Dong N., Lin D., Yang X., Wong M.H.Y. et al. Efficient generation of complete sequences of MDR encoding plasmids by rapid assembly of MinION barcoding sequencing data // GigaScience. 2018. 36. Vol. 7, N 3. P. 1-9. DOI: https://doi.org/10.1093/gigascience/gix132. Erratum in: Gigascience. 2019. Vol. 8, N 3. PMID: 29325009; PMCID: PMC5848804. 37.

17. Cheng L., Connor T.R., Aanensen D.M., Spratt B.G., Corander J. Bayesian semi-supervised classification of bacterial samples using MLST databases // BMC Bioinformat. 2011. Vol. 12. P. 302. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2105-12-302 38.

18. Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications // Wellcome Open Res. 2018. Vol. 3. P. 124. DOI: https:// doi.org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1

19. Maiden M.C. Horizontal genetic exchange, evolution, and spread 39. of antibiotic resistance in bacteria // Clin. Infect. Dis. 1998. Vol. 27, Suppl. 1. S. 12-20. DOI: https://doi.org/10.1086/514917

20. Joensen K.G., Scheutz F., Lund O., Hasman H., Kaas R. S., Nielsen E.M.

et al. Real-time whole-genome sequencing for routine typing, sur- 40. veillance, and outbreak detection of verotoxigenic Escherichia coli // J. Clin. Microbiol. 2014. Vol. 52, N 5. P. 1501-1510. DOI: https://doi. org/10.1128/JCM.03617-13 41.

21. Schmitz-Esser S., Wagner M. Genome sequencing of Listeria monocy-togenes // Methods Mol. Biol. 2014. Vol. 1157. P. 223-232. DOI: https:// doi.org/10.1007/978-1-4939-0703-8_19

22. Jarvis K.G., White J.R., Grim C.J., Ewing L., Ottesen A. R., Beaub- 42. run J. J.-G. et al. Cilantro microbiome before and after nonselective pre-enrichment for Salmonella using 16S rRNA and metagenomic sequencing // BMC Microbiol. 2015. Vol. 15. P. 160. DOI: https://doi. org/10.1186/s12866-015-0497-2 43.

23. Arulandhu A.J., Staats M., Hagelaar R., Voorhuijzen M.M., Prins T.W., Scholtens I. et al. Development and validation of a multi-locus DNA metabarcoding method to identify endangered species in complex 44. samples // GigaScience. 2017. Vol. 6, N 10. Р. 1-18. DOI: https://doi. org/10.1093/gigascience/gix080

24. van Cuyck H., Pichon B., Leroy P., Grander-Farbos A., Underwood A., 45. Soullie B. et al. Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis of Streptococcus pneumoniae and comparison with multiple loci sequence typing // BMC Microbiol. 2012. Vol. 12, N 241. P. 1-9. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2180-12-241 46.

25. Gonzalez-Gonzalez A., Sanchez-Reyes L.L., Sapien G.D., Eguiarte L.E., Souza V. Hierarchical clustering of genetic diversity associated to

different levels of mutation and recombination in Escherichia coli: a study based on Mexican isolates // Infect. Genet. Evol. 2013. Vol. 13. P. 187-197. DOI: https://doi.org/10.1016/j.meegid.2012.09.003 Urvin R., Maiden M.C.J. Multi-locus sequencing typing: a tool for global epidemiology // Trends Microbiol. 2003. Vol. 11, N 10. P. 479487. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tim.2003.08.006 Inouye M., Conway T.C., Zobel J., Holt K.E. Short read sequence typing (SRST): multi-locus sequence types from short reads // BMC Genomics. 2012. Vol. 13. P. 338. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-338 Воронина О.Л., Тартаковский И.С., Ющук Н.Д., Рыжова Н.Н., Аксенова Е.И., Кунда М.С. и др. Анализ спорадических случаев инвазивного листериоза в мегаполисе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. Т. 97, № 6. С. 546-555. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-6-5 Engberg J., On S.L.W., Harrington C.S., Gerner-Smidt P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. in human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for campylobacters // J. Clin. Microbiol. 2000. Vol. 38, N 1. P. 286-291. PMCID: PMC88711, PMID: 10618103

Ефимочкина Н.Р. Бактериальные пищевые патогены рода Campylobacter // Москва : АНО «Издательство РАМН», 2019. 215 с. ISBN 978-5-7901-0125-0.

Ellington M.J., Ekelund O., Aarestrup F.M., Canton R., Doumith M., Giske C. et al. The role of whole genome sequencing in antimicrobial susceptibility testing of bacteria: report from the EUCAST Subcommittee // Clin. Microbiol. Infect. 2017. Vol. 23. P. 2-22. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cmi.2016.11.012

Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R. et al. Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenza Rd // Science. 1995. Vol. 269, N 5223. P. 496-512. DOI: https://doi.org/10.1126/science.7542800 Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D. et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium // Science. 1995. Vol. 270, N 5235. P. 397-403. DOI: https:// doi.org/10.1126/science.270.5235.397

Parchill J., Wren B.W., Mungall K., Ketley J.M., Churcher C., Basham D. et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences // Nature. 2000. Vol. 403, N 6770. P. 665-668. DOI: https://doi.org/10.1038/35001088 Pearson B.M., Gaskin D.J., Segers R.P., Wells J.M., Nuijten P.J., van Vliet A.H.M. The complete genome sequence of Campylobacter jejuni strain 81116 (NCTC 11828) // J. Bacteriol. 2007. Vol. 189, N 22. Р. 8402-8403. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.01404-07 Golz J.C., Stingl K. Natural competence and horizontal gene transfer in Campylobacter // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2021. Vol. 431. P. 265-292. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-030-65481-8_10 Moura A., Criscuolo A., Pouseele H., Maury M.M., Leclercq A., Tarr C. et al. Whole genome-based population biology and epidemiological surveillance of Listeria monocytogenes // Nat. Microbiol. 2016. Vol. 2. P. 16185. DOI: https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.185 Fagerlund A., Langsrud S., M0retr0 T. In-depth longitudinal study of Listeria monocytogenes ST9 isolates from the meat processing industry: resolving diversity and transmission patterns using whole-genome sequencing // Appl. Environ. Microbiol. 2020. Vol. 86, N 14. Р. e00579-20. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.00579-20 Tyson G.W., Chapman J., Hugenholtz P., Allen E.E. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment // Nature. 2004. Vol. 428, N 6978. P. 37-43. DOI: https://doi.org/10.1038/nature02340

Qin J., Li R., Raes J., Arumugam M. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomics sequencing // Nature. 2010. Vol. 464, N 7285. P. 59-65. DOI: https://doi.org/10.1038/nature08821 Jia H., Cai X., Zhong H., Feng Q., Sunagawa S., Arumugam M. et al. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome // Nat. Biotechnol. 2014. Vol. 32, N 8. P. 834-841. DOI: https://doi. org/10.1038/nbt.2942

Sunagawa S., Mende D.R., Zeller G., Berger S.A., Kultima J.R., Coelho L.P. et al. Metagenomic species profiling using universal phylo-genetic marker genes // Nat. Methods. 2013. Vol. 10, N 12. P. 1196-1199. DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.2693

de la Cuesta-Zuluaga J., Escobar J.S. Considerations for optimizing microbiome analysis using a marker gene // Front. Nutr. 2016. Vol. 3. Р. 26. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2016.00026 Bergholz T.M., Switt A.I., Wiedmann M. Omics approaches in food safety: fulfilling the promise? // Trends Microbiol. 2014. Vol. 22. P. 275-281. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tim.2014.01.006 Zhang S.K., Yin Y.L., Jones M.B., Zhang Z.Z., Kaiser B.L.D., Din-smore B.A. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data // J. Clin. Microbiol. 2015. Vol. 53. P. 1685-1692. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.00323-15 Carola S., Rolf D. Metagenomic analysis: past and future trends // Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ. Microbiol. 2011. Vol. 77, N 4. P. 1153-1161. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.02345-10

47. Baffoni L., Stenico C.V., Strahsburger E. Gaggia F., Di Gioia D., Modesto M. et al. Identification of species belonging to the Bifidobacterium genus by PCR-RFLP analysis of a hsp60 gene fragment // BMC Microbiol. 2013. Vol. 13, N 149. P. 1-9. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2180-13-149

48. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Aponte M., Pepe J., Villani F. Lactobacillus strain diversity based on partial hsp60 gene sequences and design of PCR-restriction fragment length polymorphism assay for species identification and differentiation // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74, N 1. P. 208-215. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01711-07

49. Campedelli I., Mathur H., Salvetti E., Clarke S., Rea M.C., Torriani S. et al. Genus-Wide Assessment of Antibiotic Resistance in Lactobacillus spp. // Appl Environ Microbiol. 2018. Vol. 85, N 1. Р. e01738-18. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01738-18

50. Ferri E., Galimberti A., Casiraghi M., Airoldi C., Ciaramelli C., Pal-mioli A. et al. Towards a universal approach based on omics technologies for the quality control of food // BioMed Res. Int. 2015. Vol. 2015. Article ID 365794. 14 p. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2015/365794

51. Blagden T., Schneider W., Melcher U., Daniels J., Fletcher J. Adaptation and validation of e-probe diagnostic nucleic acid analysis for detection of Escherichia coli O157:H7 in metagenomic data from complex food matrices // J. Food Prot. 2016. Vol. 79. P. 574-581. DOI: https:// doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-15-440

52. Loman N. J., Constantinidou C., Christner M., Rohde H., Chan J.Z.M., Quick J. et al. A culture-independent sequence-based metagenomics approach to the investigation of an outbreak of Shiga-toxigenic Escherichia coli O104:H4. // JAMA. 2013. Vol. 309. P. 1502-1510. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2013.3231

53. Turnbaugh P.J., Ley R.E., Hamady M., Fraser-Liggett C.M., Knight R., Gordon J.I. The human microbiome project // Nature. 2007. Vol. 449, N 7164. Р. 804-810. DOI: https://doi.org/10.1038/nature06244

54. Nishij ima S., Suda W., Oshima K., Kim S.-W., Hirose Y., Morita H. et al. The gut microbiome of healthy Japanese and its microbial and functional uniqueness // DNA Res. 2016. Vol. 23, N 2. Р. 125-133. DOI: https://doi.org/10.1093/dnares/dsw002

55. Huttenhower C., Gevers D., Knight R., Abubucker S. The Human Microbiome Project (HMP) consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome // Nature. 2012. Vol. 486. P. 207-214. DOI: https://doi.org/10.1038/nature11234

56. Шевелева С.А., Куваева И.Б., Ефимочкина Н.Р., Маркова Ю.М., Просянников М.Ю. Микробиом кишечника: от эталона нормы к патологии // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 4. С. 35-51. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10040

57. Брагина Т.В., Елизарова Е.В., Шевелева С.А. Микробиота кишечника спортсменов // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 4. С. 36-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-36-52

58. Ефимочкина Н.Р., Багрянцева О.В., Дюпуи Э.К., Хотим-ченко С.А., Пермяков Е.В., Шевелева С.А. и др. Новые международные инициативы в создании систем эффективного прогнозирования рисков и обеспечения безопасности пищевых продуктов // Вопросы питания. 2016. Т. 85, № 2. С. 92-103. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2016-00027

59. Быкова И.Б., Булахов А.В. Анализ международных систем гигиенического мониторинга возбудителей пищевых токсикоинфекций // Вопросы питания. 2012. Т. 81, № 6. С. 12-18.

60. Jenkins C., Dallman T.J., Launders N., Willis C., Byrne L., Jorgensen F. et al. Public health investigation of two outbreaks of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157 associated with consumption of watercress // Appl. Environ. Microbiol. 2015. Vol. 81. P. 3946-3952. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.04188-14

61. Turabelidze G., Lawrence S.J., Gao H., Sodergren E., Weinstock G.M. Abubucker S. et al. Precise dissection of an Escherichia coli O157:H7 outbreak by single nucleotide polymorphism analysis // J. Clin. Micro-biol. 2013. Vol. 51. P. 3950-3954. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.01930-13

62. Holmes A., Allison L., Ward M., Dallman T.J., Clark R., Fawkes A. et al. Utility of whole-genome sequencing of Escherichia coli O157 for outbreak detection and epidemiological surveillance // J. Clin. Microbiol. 2015. Vol. 53. P. 3565-3573. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.01066-15

63. Schmid D., Allerberger F., Huhulescu S., Pietzka A., Amar C., Kleta S. et al. Whole genome sequencing as a tool to investigate a cluster of seven cases of listeriosis in Austria and Germany, 2011—2013 // Clin. Microbi-ol. Infect. 2014. Vol. 20. P. 431-436. DOI: https://doi.org/10.1111/1469-0691.12638

64. Octavia S., Wang Q., Tanaka M.M., Kaur S., Sintchenko V., Lan R. Delineating community outbreaks of Salmonella enterica serovar Typhimurium by use of whole-genome sequencing: insights into genomic variability within an outbreak // J. Clin. Microbiol. 2015. Vol. 53. P. 1063-1071. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.03235-14

65. Taylor A.J., Lappi V., Wolfgang W.J., Lapierre P., Palumbo M.J., Medus C. et al. Characterization of foodborne outbreaks of Salmonella enterica serovar Enteritidis with whole-genome sequencing single nucleotide polymorphism-based analysis for surveillance and outbreak detection // J. Clin. Microbiol. 2015. Vol. 53. P. 3334-3340. DOI: https://doi. org/10.1128/JCM.01280-15

66. Ottesen A., Ramachandran P., Reed E., White J.R., Hasan N., Sub-ramanian P. et al. Enrichment dynamics of Listeria monocytogenes and the associated microbiome from naturally contaminated ice cream linked to a listeriosis outbreak // BMC Microbiol. 2016. Vol. 16. P. 275. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-016-0894-1

67. Whitehouse C.A., Young S., Li C., Hsu C.H., Martin G., Zhao S. Use of whole-genome sequencing for Campylobacter surveillance from NARMS retail poultry in the United States in 2015 // Food Microbiol. 2018. Vol. 73. P. 122-128. DOI: https://doi.org/10.1016/j. fm.2018.01.018

68. Pornsukarom S., van Vliet A.H.M., Thakur S. Whole genome sequencing analysis of multiple Salmonella serovars provides insights into phylogenetic relatedness, antimicrobial resistance, and virulence markers across humans, food animals and agriculture environmental sources // BMC Genomics. 2018. Vol. 19, N 1. P. 801. DOI: https://doi. org/10.1186/s12864-018-5137-4

69. Allard M.W., Strain E., Melka D., Bunning K., Musser S.M., Brown E.W. et al. Practical value of food pathogen traceability through building a whole-genome sequencing network and database // J. Clin. Microbiol. 2016. Vol. 54, N 8. P. 1975-1983. DOI: https://doi. org/10.1128/JCM.00081-16

70. Кулешов К.В., Павлова А.С., Гоптарь И.А., Уткина А.В., Гусева А.Н., Рожнова С.Ш. и др. Стандартизация получения и анализа данных полногеномного секвенирования при субтипировании изолятов Salmonella enteritidis // Молекулярная диагностика 2018 : сборник трудов Международной научно-практической конференции. Минск, 2018. С. 296-297. ISBN 978-985-7091-99-7.

71. Кулешов К.В., Павлова А.С., Гоптарь И.А., Уткина А.В., Гусева А.Н., Подколзин А.Т. и др. Опыт применения полногеномного секвенирования как инструмента характеристики изолятов Sh. sonnei, выделенных при вспышках на территории РФ // Молекулярная диагностика 2018 : сборник трудов Международной научно-практической конференции. Минск, 2018. С. 297-298. ISBN 978985-7091-99-7.

72. Павлова А.С., Кулешов К.В., Гоптарь И.А., Уткина А.В., Гусева А.Н., Рожнова С.Ш. и др. Первичные данные об изучении популяционной структуры доминантного PFGE-типа S. enteritidis JEGX01.0001 — JEGA26.0001 и возможности применения полногеномного секвенирования для определения связи между различными очагами заболеваемости // Молекулярная диагностика 2018 : сборник трудов Международной научно-практической конференции. Минск, 2018. С. 298-299. ISBN 978985-7091-99-7.

73. Воронина О.Л., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Кутузова А.В., Аксенова Е.И., Карпова Т.И. и др. Роль генотипирования в эпидемическом расследовании случаев инвазивного листериоза // Молекулярная диагностика : сборник трудов X Юбилейной Международной научно-практической конференции. Москва, 2021. Т. 2. С. 119-120. ISBN 978-5-98407-041-6.

74. Егорова С.А., Кафтырева Л.А. Хромосомные механизмы устойчивости к хинолонам штаммов Salmonella различных сероваров // Молекулярная диагностика : сборник трудов X Юбилейной международной научно-практической конференции. Москва. 2021. Т. 2. С. 60-61. ISBN 978-5-98407-041-6.

References

Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74 (12): 5463-7. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

Goto K., Omura T., Hara Y., Sadaie Y. Application of the partial 16S rDNA as an index for rapid identification of species in the genus bacillus. J Gen Appl Microbiol. 2000; 46 (1): 1-8. DOI: https://doi.org/10.2323/ jgam.46.1

Alekseeva A.E., Brusnigina N.F. Possibilities and prospects of using methods of massive parallel sequencing in the diagnosis and epidemiological surveillance of infectious diseases. Medial Journal. 2014; (2): 6—28. (in Russian)

Hyeon J.-Y., Li S., Mann D.A., Zhang S., Li Z., Chen Y., et al. Quasimetagenomics-based and real-time-sequencing-aideddetection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Appl Environ

2.

4

Microbiol. 2018; 84 (4): e02340-17. DOI: https://doi.org/10.1128/ AEM.02340-17

5. Shendure J., Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 25. 2008; 26 (10): 1135-45. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt1486

6. Crossley B.M., Bai J., Glaser A., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. J Vet Diagn Invest. 2020; 32 (6): 767-75. DOI: https://doi.org/10.1177/1040638720905833

7. Beck T.F., Mullikin J.C.; NISC Comparative Sequencing Program, 26. Biesecker L.G. Systematic evaluation of Sanger validation of next-generation sequencing variants. Clin Chem. 2016; 62 (4): 647-54. DOI: https://doi.org/10.1373/clinchem.2015.249623 27.

8. Bruske E., Otto T.D., Frank M. Whole genome sequencing and microsatellite analysis of the Plasmodium falciparum E5 NF54 strain show

that the var, rifin and stevor gene families follow Mendelian inheritance. 28. Malar J. 2018; 17 (1): 376. DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-018-2503-2

9. Rebrikov D.V., Korostin D.O., Shubina E.S., Ilyinsky V.V. NGS: high-performance sequencing. Moscow: Publishing house "BINOM. Laboratory of Knowledge". 2015: 232 p. ISBN 978-5-9963-1784-4.

(in Russian) 29.

10. Sekse C., Holst-Jensen A., Dobrindt U., Johannessen G.S., Li W., Spilsberg B., et al. High throughput sequencing for detection of food-borne pathogens. Front Microbiol. 2017; 8: 2029. DOI: https://doi. org/10.3389/fmicb.2017.02029

11. Wick R.R., Judd L.M., Gorrie C.L., Holt K.E. Completing bacte- 30. rial genome assemblies with multiplex MinION sequencing. bioRxiv. Microb Genom. 2017; 3 (10): e000132. DOI: https://doi.org/10.1099/ mgen.0.000132 31.

12. Liu Q., Fang L., Yu G., Wang D., Xiao C.L., Wang K. Detection of DNA base modifications by deep recurrent neural network on Oxford Nanopore sequencing data. Nat Commun. 2019; 10 (1): 2449. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-10168-2

13. Heikema A.P., Horst-Kreft D., Boers S.A., Jansen R., Hiltemann S.D., 32. de Koning W. Comparison of illumina versus nanopore 16S rRNA gene sequencing of the human nasal microbiota. Genes (Basel). 2020; 11 (9): 1105. DOI: https://doi.org/10.3390/genes11091105

14. Lemon J.K., Khil P.P., Frank K.M., Dekker J.P. Rapid nanopore 33. sequencing of plasmids and resistance gene detection in clinical isolates.

J Clin Microbiol. 2017; 55 (12): 3530-43. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.01069-17

15. Bioinformatics and data analysis in microbiology. Edited by Ö. Ta§tan 34. Bishop. Rhodes University Bioinformatics, Department of Biochemistry, Microbiology and Biotechnology, Rhodes University, South Africa; Caister Academic Press. 2014. 248 p. ISBN: 978-1-908230-39-3. DOI: https://doi.org/10.21775/9781910190494 35.

16. Li R., Xie M., Dong N., Lin D., Yang X., Wong M.H.Y., et al. Efficient generation of complete sequences of MDR encoding plasmids by rapid assembly of MinION barcoding sequencing data. GigaScience. 2018;

7 (3): 1-9. DOI: https://doi.org/10.1093/gigascience/gix132. Erra- 36. tum in: Gigascience. 2019; 8 (3). PMID: 29325009; PMCID: PMC 5848804.

17. Cheng L., Connor T.R., Aanensen D.M., Spratt B.G., Corander J. 37. Bayesian semi-supervised classification of bacterial samples using MLST databases. BMC Bioinformat. 2011; 12: 302. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2105-12-302

18. Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial popula- 38. tion genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 2018; 3: 124. DOI: https://doi. org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1

19. Maiden M.C. Horizontal genetic exchange, evolution, and spread of antibiotic resistance in bacteria. Clin Infect Dis. 1998; 27 (1): 12-20. 39. DOI: https://doi.org/10.1086/514917

20. Joensen K.G., Scheutz F., Lund O., Hasman H., Kaas R.S., Nielsen E.M., et al. Real-time whole-genome sequencing for routine typing, surveillance, and outbreak detection of verotoxigenic Escherichia coli. J 40. Clin Microbiol. 2014; 52 (5): 1501-10. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.03617-13

21. Schmitz-Esser S., Wagner M. Genome sequencing of Listeria mono- 41. cytogenes. Methods Mol Biol. 2014; 1157: 223-232. DOI: https://doi. org/10.1007/978-1-4939-0703-8_19

22. Jarvis K.G., White J.R., Grim C.J., Ewing L., Ottesen A.R., Beaub-

run J.J.-G., et al. Cilantro microbiome before and after nonselec- 42. tive pre-enrichment for Salmonella using 16S rRNA and metage-nomic sequencing. BMC Microbiol. 2015; 15: 160. DOI: https://doi. org/10.1186/s12866-015-0497-2

23. Arulandhu A.J., Staats M., Hagelaar R., Voorhuijzen M.M., Prins T.W., 43. Scholtens I., et al. Development and validation of a multi-locus DNA metabarcoding method to identify endangered species in complex samples. GigaScience. 2017; 6 (10): 1-18. DOI: https://doi.org/10.1093/ 44. gigascience/gix080

24. van Cuyck H., Pichon B., Leroy P., Grander-Farbos A., Underwood A., Soullie B., Koeck J.-L. Multiple-locus variable-number tandem-repeat 45. analysis of .Streptococcuspneumoniae and comparison with multiple loci

sequence typing. BMC Microbiol. 2012; 12 (241): 1-9. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2180-12-241

Gonzalez-GonzalezA., Sanchez-Reyes L.L., Sapien G.D., Eguiarte L.E., Souza V. Hierarchical clustering of genetic diversity associated to different levels of mutation and recombination in Escherichia coli: a study based on Mexican isolates. Infect Genet Evol. 2013; 13: 187-97. DOI: https://doi.org/10.1016/j.meegid.2012.09.003

Urvin R., Maiden M.C.J. Multi-locus sequencing typing: a tool for global epidemiology. Trends Microbiol. 2003; 11 (10): 479-87. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tim.2003.08.006

Inouye M., Conway T.C., Zobel J., Holt K.E. Short read sequence typing (SRST): multi-locus sequence types from short reads. BMC Genomics. 2012; 13: 338. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-338 Voronina O.L., Tartakovsky I.S., Yushchuk N.D., Ryzhova N.N., Aksenova E.I., Kunda M.S., et al. Analysis of sporadic cases of invasive listeriosis in metropolis. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immu-nobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiol-ogy]. 2020; 97 (6): 546-55. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-6-5

Engberg J., On S.L.W., Harrington C.S., Gerner-Smidt P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. in human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for campylobacters. J Clin Microbiol. 2000; 38 (1): 286-91. PMCID: PMC88711, PMID: 10618103.

Efimochkina N.R. Bacterial food-borne pathogens of the genus Campy-lobacter. Moscow: Izdatel'stvo RAMN, 2019: 215 p. ISBN 978-5-79010125-0. (in Russian)

Ellington M.J., Ekelund O., Aarestrup F.M., Canton R., Doumith M., Giske C., et al. The role of whole genome sequencing in antimicrobial susceptibility testing of bacteria: report from the EUCAST Subcommittee. Clin Microbiol Infect. 2017; 23: 2-22. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cmi.2016.11.012

Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R., et al. Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenza Rd. Science. 1995; 269 (5223): 496-512. DOI: https://doi.org/10.1126/science.7542800

Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D., et al. The minimal gene complement of Myco-plasma genitalium. Science. 1995; 270 (5235): 397-403. DOI: https://doi. org/10.1126/science.270.5235.397

Parchill J., Wren B.W., Mungall K., Ketley J.M., Churcher C., Basham D., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 2000; 403 (6770): 665-8. DOI: https://doi.org/10.1038/35001088

Pearson B.M., Gaskin D.J., Segers R.P., Wells J.M., Nuijten P. J., van Vliet A.H.M. The complete genome sequence of Campylobacter jejuni strain 81116 (NCTC 11828). J Bacteriol. 2007; 189 (22): 8402-3. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.01404-07

Golz J.C., Stingl K. Natural competence and horizontal gene transfer

in Campylobacter. Curr Top Microbiol Immunol. 2021; 431: 265-92.

DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-030-65481-8_10

Moura A., Criscuolo A., Pouseele H., Maury M.M., Leclercq A., Tarr C.,

et al. Whole genome-based population biology and epidemiological

surveillance of Listeria monocytogenes. Nat Microbiol. 2016; 2: 16185.

DOL: https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.185

Fagerlund A., Langsrud S., Moretro T. In-depth longitudinal study of

Listeria monocytogenes ST9 isolates from the meat processing industry:

resolving diversity and transmission patterns using whole-genome

sequencing. Appl Environ Microbiol. 2020; 86 (14): e00579-20. DOI:

https://doi.org/10.1128/AEM.00579-20

Tyson G.W., Chapman J., Hugenholtz P., Allen E.E. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 2004; 428 (6978): 37-43. DOI: https://doi. org/10.1038/nature02340

Qin J., Li R., Raes J., Arumugam R. A human gut microbial gene

catalogue established by metagenomics sequencing. Nature. 2010; 464

(7285): 59-65. DOI: https://doi.org/10.1038/nature08821

Jia H., Cai X., Zhong H., Feng Q., Sunagawa S., Arumugam M., et al.

An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome.

Nat Biotechnol. 2014; 32 (8): 834-41. DOI: https://doi.org/10.1038/

nbt.2942

Sunagawa S., Mende D.R., Zeller G., Berger S.A., Kultima J.R., Coelho L.P., et al. Metagenomic species profiling using universal phylo-genetic marker genes. Nat Methods. 2013; 10 (12): 1196-9. DOI: https:// doi.org/10.1038/nmeth.2693

de la Cuesta-Zuluaga J., Escobar J.S. Considerations for optimizing microbiome analysis using a marker gene. Front Nutr. 2016; 3: 26. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2016.00026

Bergholz T.M., Switt A.I., Wiedmann M. Omics approaches in food safety: fulfilling the promise? Trends Microbiol. 2014; 22: 275-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tim.2014.01.006

Zhang S.K., Yin Y.L., Jones M.B., Zhang Z.Z., Kaiser B.L.D., Din-smore B.A., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-

throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 2015; 53: 1685-92. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.00323-15

46. Carola S., Rolf D. Metagenomic analysis: past and future trends. Appl Environ Microbiol. 2011; 77 (4): 1153-61. DOI: https://doi.org/10.1128/ AEM.02345-10

47. Baffoni L., Stenico C.V., Strahsburger E. Gaggia F., Di Gioia D., Modesto M., et al. Identification of species belonging to the Bifidobacterium genus by PCR-RFLP analysis of a hsp60 gene fragment. BMC Microbiol. 2013; 13 (149): 1-9. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2180-13-149

48. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Aponte M., Pepe J., Villani F. Lac-tobacillus strain diversity based on partial hsp60 gene sequences and design of PCR-restriction fragment length polymorphism assay for species identification and differentiation. Appl Environ Microbiol. 2008; 74 (1): 208-15. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01711-07

49. Campedelli I., Mathur H., Salvetti E., Clarke S., Rea M.C., Torriani S., et al. Genus-wide assessment of antibiotic resistance in Lactobacillus spp. Appl Environ Microbiol. 2018; 85 (1): e01738-18. DOI: https://doi. org/10.1128/AEM.01738-18

50. Ferri E., Galimberti A., Casiraghi M., Airoldi C., Ciaramelli C., Pal-mioli A., et al. Towards a universal approach based on omics technologies for the quality control of food. BioMed Res Int. 2015; Article ID 365794: 14 p. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2015/365794

51. Blagden T., Schneider W., Melcher U., Daniels J., Fletcher J. Adaptation and validation of e-probe diagnostic nucleic acid analysis for detection of Escherichia coli O157:H7 in metagenomic data from complex food matrices. J Food Prot. 2016; 79: 574-81. DOI: https://doi. org/10.4315/0362-028X. JFP-15-440

52. Loman N.J., Constantinidou C., Christner M., Rohde H., Chan J.Z.M., Quick J., et al. A culture-independent sequence-based metagenomics approach to the investigation of an outbreak of Shiga-toxigenic Esch-erichia coli O104:H4. JAMA. 2013; 309: 1502-10. DOI: https://doi. org/10.1001/jama.2013.3231

53. Turnbaugh P.J., Ley R.E., Hamady M., Fraser-Liggett C.M., Knight R., Gordon J.I. The human microbiome project. Nature. 2007; 449 (7164): 804-10. DOI: https://doi.org/10.1038/nature06244

54. Nishij ima S., Suda W., Oshima K., Kim S.-W., Hirose Y., Morita H., et al. The gut microbiome of healthy Japanese and its microbial and functional uniqueness. DNA Res. 2016; 23 (2): 125-33. DOI: https:// doi.org/10.1093/dnares/dsw002

55. Huttenhower C., Gevers D., Knight R., Abubucker S. The Human Microbiome Project (HMP) consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 2012; 486: 207-14. DOI: https://doi.org/10.1038/nature11234

56. Sheveleva S.A., Kuvaeva I.B., Efimochkina N.R., Markova Yu.M., Prosyannikov M.Yu. Intestinal microbiome: from the standard norm to pathology. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (4): 35-51. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10040 (in Russian)

57. Bragina T.V., Elizarova E.V., Sheveleva S.A. Gut microbiota of athletes. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (4): 36-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-36-52 (in Russian)

58. Efimochkina N.R., Bagryantseva O.V., Dupeyi E.K., Hotimchenko S.A., Permyakov E.V., Sheveleva S.A., et al. New international initiatives in creating systems for effective forecasting of food safety risks. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (2): 92-103. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2016-00027 (in Russian)

59. Bikova I.B., Bulakhov A.V. Analysis of international systems of hygienic monitoring of pathogens of food toxicoinfections. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2012; 81 (6): 12-8. (in Russian)

60. Jenkins C., Dallman T.J., Launders N., Willis C., Byrne L., Jorgensen F., et al. Public health investigation of two outbreaks of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157 associated with consumption of watercress. Appl Environ Microbiol. 2015; 81: 3946-52. DOI: https://doi. org/10.1128/AEM.04188-14

61. Turabelidze G., Lawrence S. J., Gao H., Sodergren E., Weinstock, G. M. Abubucker S., et al. Precise dissection of an Escherichia coli O157:H7 outbreak by single nucleotide polymorphism analysis. J Clin Microbiol. 2013; 51: 3950-4. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.01930-13

62. Holmes A., Allison L., Ward M., Dallman T.J., Clark R., Fawkes A., et al. Utility of whole-genome sequencing of Escherichia coli O157 for outbreak detection and epidemiological surveillance. J Clin Microbiol. 2015; 53: 3565-73. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.01066-15

63. Schmid D., Allerberger F., Huhulescu S., Pietzka A., Amar C., Kleta S., et al. Whole genome sequencing as a tool to investigate a cluster of seven cases of listeriosis in Austria and Germany, 2011-2013. Clin Microbiol Infect. 2014; 20: 431-6. DOI: https://doi.org/10.1111/1469-0691.12638

64. Octavia S., Wang Q., Tanaka M.M., Kaur S., Sintchenko V., Lan R. Delineating community outbreaks of Salmonella enterica serovar Typhimurium by use of whole-genome sequencing: insights into genomic variability within an outbreak. J Clin Microbiol. 2015; 53: 1063-71. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.03235-14

65. Taylor A.J., Lappi V., Wolfgang W.J., Lapierre P., Palumbo M.J., Medus C., et al. Characterization of foodborne outbreaks of Salmonella enterica serovar Enteritidis with whole-genome sequencing single nucleotide polymorphism-based analysis for surveillance and outbreak detection. J Clin Microbiol. 2015; 53: 3334-40. DOI: https://doi.org/10.1128/ JCM.01280-15

66. Ottesen A., Ramachandran P., Reed E., White J.R., Hasan N., Sub-ramanian P., et al. Enrichment dynamics of Listeria monocytogenes and the associated microbiome from naturally contaminated ice cream linked to a listeriosis outbreak. BMC Microbiol. 2016; 16: 275. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-016-0894-1

67. Whitehouse C.A., Young S., Li C., Hsu C.H., Martin G., Zhao S. Use of whole-genome sequencing for Campylobacter surveillance from NARMS retail poultry in the United States in 2015. Food Microbiol. 2018; 73: 122-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fm.2018.01.018

68. Pornsukarom S., van Vliet A.H.M., Thakur S. Whole genome sequencing analysis of multiple Salmonella serovars provides insights into phy-logenetic relatedness, antimicrobial resistance, and virulence markers across humans, food animals and agriculture environmental sources. BMC Genomics. 2018; 19 (1): 801. DOI: https://doi.org/10.1186/ s12864-018-5137-4

69. Allard M.W., Strain E., Melka D., Bunning K., Musser S.M., Brown E.W., et al. Practical value of food pathogen traceability through building a whole-genome sequencing network and database. J Clin Microbiol. 2016; 54 (8): 1975-83. DOI: https://doi.org/10.1128/JCM.00081-16

70. Kuleshov K.V., Pavlova A.S., Goptar I.A., Utkina A.V., Guseva A.N., Rozhnova S.Sh., et al. Standardization of obtaining and analyzing WGS-sequencing data for subtyping Salmonella enteritidis isolates. In: Molecular Diagnostics 2018. Proceedings of the International Scientific and Practical Conference. 2018: 296-7. ISBN 978-985-7091-99-7 (in Russian)

71. Kuleshov K.V., Pavlova A.S., Goptar I.A., Utkina A.V., Guseva A.N., Podkolzin A.T., et al. The experience of using genome-wide sequencing as a tool for characterizing Sh.sonnei strains isolated during outbreaks in the territory of the Russian Federation. In Molecular Diagnostics 2018. Proceedings of the International Scientific and Practical Conference. 2018: 297-8. ISBN 978-985-7091-99-7 (in Russian)

72. Pavlova A.S., Kuleshov K.V., Goptar I.A., Utkina A.V., Guseva A.N., Rozhnova S.S., et al. Primary data on the study of the population structure of the dominant PFGE-type S. enteritidis JEGX01.0001 -JEGA26.0001 and the possibility of using genome-wide sequencing to determine the relationship between different foci of morbidity. In: Molecular Diagnostics 2018. Proceedings of the International Scientific and Practical Conference. 2018: 298-9. ISBN 978-985-7091-99-7 (in Russian)

73. Voronina O.L., Kunda M.S., Ryzhova N.N., Kutuzova A.V., Aksenova E.I., Karpova T.I., et al. The role of genotyping in the epidemic investigation of cases of invasive listeriosis. In: Molecular diagnostics. Proceedings of the X Anniversary International Scientific and Practical Conference. Moscow. 2021; 2: 119-20. ISBN 978-5-98407-041-6 (in Russian)

74. Egorova S.A., Kaftyreva L.A. Chromosomal mechanisms of resistance to quinolones of Salmonella strains of various serovars. In: Molecular diagnostics. Proceedings of the X Anniversary International Scientific and Practical Conference. Moscow. 2021; 2: 60-1. ISBN 978-5-98407041-6 (in Russian)