CC BY
64
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues 2021;18(3):159-167
УДК 575.116.4:601.4]:579
DOI: https://doi.org/10.51523/2708-6011.2021-18-3-20
Опыт использования современных геномных технологий для изучения микроорганизмов
и их сообществ
Е. В. Воропаев, И. О. Стома, Д. В. Тапальский
Гомельский государственный медицинский университет, г. Гомель, Беларусь
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Целью данной работы явился обзор основных результатов геномных исследований микроорганизмов и их сообществ, выполненных на базе научно-исследовательской лаборатории Гомельского государственного медицинского университета.
Материалы и методы. Геномный, транскриптомный и метагеномный анализ микроорганизмов желудка и респираторного тракта.
Результаты. Проведен анализ возможностей современных платформ высокопроизводительного секвенирования ДНК, описаны собственные результаты использования геномного, транскриптомного и метагеномного анализа для изучения микробиоты у пациентов с различной патологией желудка и респираторного тракта.
Заключение. В ходе анализа полученных данных выявлены особенности структуры микробных сообществ желудка пациентов, инфицированных Н. pylori с различной патологией желудка: долевое участие Н. pylori в составе метагенома образцов, с различным формами рака желудка не превысило 25 %, гастрита — 6 %, язвы желудка — 1 %. При этом, минимальное количество Н. pylori во всех случаях могло достигать 0,1 %. Выявлена значительная степень вариабельности CagA и CagY локусов Н. pylori. В бактериальном микробиоме пациента с диагнозом «коронавирусная инфекция» установлено доминирование бактерий рода Streptoccocus (36 %), в вирусном — SARS-CoV-2 составляет 59 % от общего количества вирусов в данном материале. При анализе 13 штаммов Klebsiella pneumoniae с множественной и экстремальной устойчивостью к антибиотикам установлена принадлежность изученных штаммов к пяти MLST-типам, три из которых относятся к группам высокого эпидемического риска.
Ключевые слова: высокопроизводительное секвенирование ДНК, метагеномный анализ, микрогеном желудка, nelicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, респираторный микробиом, коронавирусная инфекция,, SARS-CoV-2.
Вклад авторов. Воропаев Е.В., Стома И.О., Тапальский Д.В.: проведение поисково-аналитической работы и подготовка статьи, редактирование, утверждение рукописи для публикации. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Источники финансирования. Работа выполнена в рамках НИР «Изучение молекулярно-генетических механизмов реализации инфекционного канцерогенного потенциала на модели заболеваний органов пищеварения, ассоциированных с Helicobacter pylori» № ГР 20190388 от 29.03.2019 г. ГПНИ «Трансляционная медицина» подпрограмма 4.2 «Фундаментальные аспекты медицинской науки». Для цитирования. Воропаев ЕВ, Стома ИО, Тапальский ДВ. Опыт использования современных мо-лекулярно-генетических технологий для изучения структуры ДНК микроорганизмов, вирусов и их сообществ. Проблемы здоровья и экологии. 2021;18(3):159-167. DOI: https://doi.org/10.51523/2708-6011.2021-18-3-20
Experience of using modern genomic technologies to study microorganisms and their communities
Evgenii V. Voropaev, Igor O. Stoma, Dmitry V. Tapalski
Gomel State Medical University, Gomel, Belarus
ABSTRACT
Objective. The aim of this work was to review the main results of genomic studies of microorganisms and their communities performed on the base of the Research Laboratory of Gomel State Medical University. Materials and methods. Genomic, transcriptomic and metagenomic analysis of the microorganisms of the stomach and respiratory tract.
2021;18(3):159-167 Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
Results. The capabilities of modern next-generation sequencing platforms have been analyzed, and the authors" own results of the use of genomic, transcriptomic and metagenomic analysis of the microbiota in patients with various gastric and respiratory pathologies have been described.
Conclusion. The analysis of the obtained data has revealed peculiarities of the structure of the microbial communities of the stomach of the patients infected with H. pylori with different gastric pathology: the proportion participation of H. pylori in the metagenome of the samples with different forms of gastric cancer did not exceed 25 %, of gastritis — 6 %, of peptic ulcer — 1 %. At the same time, the minimal amount of H. pylori in all the cases could reach 0.1 %. A significant degree of CagA and CagY loci variability of H. pylori was detected. Streptoccocus genus bacteria dominated (36 %) in the bacterial microbiome of a patient diagnosed with the coronavirus disease, and in the viral microbiome, SARS-CoV-2 constituted 59 % of the total number of viruses in the material. The analysis of 13 strains of Klebsiella pneumoniae with multiple and extreme resistance to antibiotics has found that the studied strains belong to five MLST-types, three of which are classified as high epidemic risk groups.
Keywords: next-generation DNA sequencing, metagenomic analysis, gastric microgenome, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, respiratory microbiome, coronavirus disease, SARS-CoV-2.
Author contributions. Voropaev E.V., Stoma I.O., Tapalski D.V.: search and analytical work and preparation of the article, editing and approval of the manuscript for publication. Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interest.
Funding. The work was performed within the framework of the research project "Study of the molecular and genetic mechanisms of the implementation of infectious carcinogenic potential on the model of digestive diseases associated with Helicobacter pylori" State Registration No. 20190388 dated 29.03.2019 State Research Program "Translational Medicine", Subprogram 4.2 "Fundamental aspects of medical science". For citation: Voropaev EV, Stoma IO, Tapalsky DV. Experience of using modern genomic technologies to study microorganisms and their communities. Health and Ecology Issues. 2021;18(3):159-167. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.51523/2708-6011.2021-18-3-20
Введение
Высокопроизводительное секвениро-вание или секвенирование нового поколения (NGS, от англ. Next generation sequence) представляет собой группу технологий установления первичной структуры нуклеиновых кислот, основанных на множественном параллельном анализе молекул ДНК или РНК [18]. Благодаря значительной производительности данного подхода и огромному массиву получаемых данных, NGS-технологии нашли широкое применение для решения широкого спектра вопросов, связанных с изучением различных биологических объектов, в том числе и человека. Так, в современной медицинской науке среди рассматриваемых проблем можно отметить полный анализ геномов этиологических агентов различных инфекционных заболеваний, установление значимых особенностей патогенеза широкого спектра патологии инфекционного и неинфекционного генеза, включая и онкологические заболевания, разработку высокоэффективных таргентных препаратов и методов лечения болезней, оценку наследственной предрасположенности формирования патофизиологических состояний [18]. Одним из наиболее результативных аспектов активного внедрения технологий высокопроизводительного секвенирования являются исследования
в области клинической микробиологии: от расшифровки структурно-функциональных особенностей геномов отдельных патогенных микроорганизмов до оценки микробных сообществ различных биотопов человека [1, 4, 11, 17]. Так, биоинформатический анализ данных, получаемых в результате проведения высокопроизводительного секвениро-вания как чистых культур, так и сообществ микроорганизмов, позволяет установить таксономическую принадлежность входящих в них видов, идентифицировать генетические детерминанты, ассоциированные с протеканием патогенетических процессов, а также оценить их функциональную активность, в том числе и антибиотикорезистентность, а в случае патосистем — идентифицировать различные виды молекулярно-физиологических аберраций у организма-хозяина. Кроме того, применение NGS-технологий способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения патогенеза инфекционных и неинфекционных заболеваний, включая разработку молекулярно-генетических основ персонализированной медицины [18].
Разработанные к настоящему времени технологии высокопроизводительного секве-нирования отличаются между собой, как по используемым молекулярно-генетическим принципам их исполнения, так и по ряду ха-
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues 2021;18(3):159-167
мов Н. pylori, что демонстрирует наличие
рактеристик, отражающих их производительность, точность, информативность, стоимость за один анализ или в пересчете на единицу информации, что и обуславливает предпочтительность выбора того или иного подхода в зависимости от характера проводимых исследований и решаемых в их ходе задач [1].
Цель исследования
Обзор основных направлений исследований и результатов, полученных с использованием различных подходов для геномного анализа микроорганизмов, а также их сообществ на базе научно-исследовательской лаборатории Гомельского государственного медицинского университета.
Материалы и методы
Для проведения исследований использовали геномный, транскриптомный и метаге-номный анализ по методикам, описанным нами ранее [27, 28]. Аннотация последовательностей проводилась с помощью программного обеспечения PGAP NCBI [26].
Результаты исследований
Установление структурно-функциональной организации геномов бактерий и вирусов
В качестве объекта исследования был выбран изолят Ilelicobacter pylori HP42K, полученный из атрофического очага слизистой оболочки антрального отдела желудка пациентки (48 лет) с диагнозом «эритемато-зная гиперпластическая антральная гастро-патия». Проведенное секвенирование генома изолята Н. pylori HP42K показало, что его размер составляет 1645783 нуклеотидных оснований (н.о.) и представляет собой среднее значение данного параметра, характерного для различных штаммов вида — 1,49-1,91 млн н.о. [18].
По результатам аннотации генома изолята Н. pylori HP42K было идентифицировано 1590 генов, 1545 из которых имели открытую рамку считывания и кодировали различные типы полипептидов. Среди оставшихся генов 36 детерминировали тРНК, шесть — рРНК, один — транспортно-матричную РНК. Функция еще двух генов не была установлена.
Расположение белок-кодирующих генов в геноме изолята Н. pylori HP42K носило дисперсный характер и в целом соответствовало структурно функциональной организации, установленной для данного вида. В то же время локализация ряда локусов отличалась от таковой, установленной для других штам-
процессов транслокации в геноме бактерии. Полученные результаты подтверждают выводы, сделанные рядом авторов, о возможности использования признака внутриге-номного расположения локусов в качестве дополнительного диагностического критерия для генетической паспортизации и классификации изолятов бактерий.
Характер пространственного распределения генов тРНК носил кластерно-дисперс-ный характер: 25 локусов были сгруппированы в семь различающихся по размеру кластеров, а оставшиеся 11 были расположены по отдельности. Применительно к генам рРНК была выявлена выраженная внутривидовая консервативность — все гены (5S, 16S и 23S) были дуплицированы, единичные копии 23S РНК и 5S РНК группировались в два кластера, а единичные копии 16S располагались в геноме по отдельности. При этом расположение между кластерами 23S-5S относительно единичных копий 16S не являлось симметричным.
Функциональная принадлежность бе-лок-кодирующих генов была разнообразной: 59 были ассоциированы с процессами биосинтеза аминокислот, 83 — с биосинтезом кофакторов, простетических групп и молекул-переносчиков, 303 — участвовали в формирование клеточной оболочки, 123 — относились к клеточным процессам, 34 — детерминировали процессы промежуточного метаболизма, 135 — были задействованы в энергетических реакциях процессы, 89 — контролировали обмен жирных кислот и фосфолипидов, 34 — детерминировали ре-гуляторные белки, 124 — ассоциированы с процессами репликации ДНК, 14 и 295 — вовлечены в механизмы транскрипции и трансляции соответственно. Оставшиеся 353 локуса детерминировали различные структурно-функциональные полипептиды, а также участвовали в формировании факторов патогенности и вирулентности. Среди последних у изолята H. pylori HP42K клиническую значимость представляли гены цито-токсин-ассоциированного антигена (CagA) и вакуолизирующего цитотоксина (VacA). Ген CagA был расположен в островке патогенности CagPAI, а VacA находился отдельно в геноме. Кроме перечисленных генов, в геноме изолята H. pylori HP42K было идентифицировано более 20 кодирующих регионов, относящихся к процессам анаболизма ли-пополисахаридов, формирующих наружную мембрану клеточной стенки и вовлеченных
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
2021;18(3):159-167
в механизмы адгезии патогена к цитоплаз-матической мембране клеток слизистой желудка. Также среди идентифицированных факторов вирулентности были аннотированы гены системы утилизации железа (fecA, exbB, exbD, frnB и др.), регуляции, синтеза и сборки элементов жгутиков (flaA, flaB, flg, flh и др.) и др.
Кроме полноценных кодирующих последовательностей, в геноме изолята H. pylori HP42K было выявлено 108 псевдогенов, происхождение большей части которых было связано с делециями/инсерциями, приводящих к смещению рамки считывания, последующему перераспределению структуры триплетов и образованию стоп-кодонов. Для 24 локусов были идентифицированы одно-нуклеотидние полиморфизмы (SNP), определяющие формирование стоп-кодонов, а 14 и 12 локусов представляли собой результаты фрагментации или комплексных аббераций, соответственно.
Внехромосомные элементы были представлены двумя плазмидами [21] размером 10 013 н.о и 2 658 н.о. В плазмиде большего размера было идентифицировано 13 генов, имеющих открытые рамки считывания, в меньшей — два, оба из которых кодировали полипептиды. Функционально плазмидные полипепетиды представляли собой транспо-зазы, токсины, антитоксины, инициаторы репликации и др. При этом следует отметить, что некоторые элементы большей плазмиды были идентифицированы и в геномной ДНК, что указывает на возможность ее нахождения как в автономном, так и интегрированном состоянии.
Еще одним объектом исследований было изучение структурно-функциональной организации генома изолята 724 Gomel Belarus/2021 коронавируса SARS-CoV-2 [8, 10]. Проведенное секвенирование генома изолята вируса показало, что его размер составляет 29879 н.о. Не смотря на наличие полиморфизма в первичной структуре нуклеиновой кислоты (по отношению к изо-лятам, представленным в международных базах данных), определяемого как делетиро-ванными участками (9 и 15 п.о.) в ORF1ab и ORF7b соответственно, так и расположенными дисперсно по всему геному заменами, структурно-функциональная организация генома изолята 724 Gomel Belarus/2021 коронавируса SARS-CoV-2 была сходной с описанным референсным изолятом Wuhan-Hu-1. Геном SARS-CoV-2 представлял собой одноцепочечную (+)-цепь РНК, содержащую
12 функциональных открытых рамок считывания. Последовательное расположение генов (с установленной функцией) в рамке считывания являлось следующим: реплика-за, протеазы (1a - 1b) и основные белки S, E, M и N. Наибольший размер имела первая открытая рамка считывания ORFlab (21281 н.о.), кодирующая полипептид, состоящий из множества структурных и функциональных белков. Еще одной особенностью открытой рамки считывания ORF1ab, являлся тот факт, что она функционально (применительно к процессам трансляции) разделена на два фрагмента, непрерывная реализация генетической информации с которых возможна лишь в случае активизации механизма сдвига молекулы РНК на один нуклеотид в ходе трансляции на рибосоме. В ином случае биосинтез целостного полипептида не представляется возможным, что связано с наличием стоп-кодона во втором функциональном фрагменте ORF1ab. В данном случае будет образовываться только укороченный полипептид размером 4406 аминокислотных остатков (а.о.). Процессинг полноценного полипептида ab, осуществляемый кодируемыми вирусами протеиназами, позволяет получить 16 структурных и функциональных белков.
Выявление и изучение клинически значимых генов
Для описания особенностей клинически значимых генов патогенных микроорганизмов в качестве объектов исследования были выбраны ранее описанный изолят Н. pylori HP42K [18] и еще один секвенированный нами изолят Н. pylori HP45K [20]. Предметом исследований явились структурные особенности Cag-ассоцированных генов, расположенных в островке патогенности CagPAI. Размер CagPAI для обоих изолятов составил порядка 40 тыс н.о. и включал в своем составе тридцать четыре гена, в том числе cagA ген и ряд ассоциированных с ним ортологич-ных генов. Согласно литературным данным, CagPAI кодирует систему секреции Cag типа IV (CagT4SS), которая доставляет онкопроте-ин CagA и другие эффекторные молекулы в эпителиальные клетки желудка человека.
В перечне аннотированных генов Cag-PAI были идентифицированы семь локусов, детерминирующих систему секреции IV типа, определяющую биосинтез и транспортировку цитотоксин-ассоциированного антигена: Cag1, Cag3, CagX, CagY, CagM, CagT. При этом, гены Cag3, CagT и CagM, CagX, CagY детерминируют полипептиды, формирующие
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
внешнюю и внутреннюю структуру транспортного канала системы секреции IV типа, ген Cag1 кодирует мембранный белок, определяющий цитотоксическую активность H. pylori по отношению к клеткам человека, а CagA представляет собой ген патогенности, отвечающий за выработку цитотоксин-ассо-циированного антигена.
Проведенный анализ локуса Cag1 показал, что генетические различия (3,74 %) между изолятами Н. pylori HP42K и Н. pylori HP45K обусловлены исключительно нуклео-тидными замещениями, без изменения размера гена — он составил в обоих случаях 348 н.о. Основной характер замещений был связан с транзициями A-^G и С-^T, на долю которых приходилось 84,6 % от всех изменений. Изучение транслируемых последовательностей (115 а.о.) выявило только четыре аминокислотные замены, что свидетельствовало о синонимичном характере большинства (69,2 %) нуклеотидных вариаций между изолятами по локусу Cag1. При этом, в трех из четырех случаев, несинонимичные замены были связаны с миссенс-мутациями, приводящими к замене аминокислотного остатка на остаток с другими физико-химическими свойствами. В то же время, наблюдающиеся изменения в полипептидной структуре не приводили к значительным изменениям третичной структуры белковой молекулы, что было установлено на основании построения пространственных моделей. Стоп-кодоны в гене Cag1 были сходны у изолятов и представлены триплетом TGA.
Уровень различий между нуклеотидны-ми последовательностями изолятов 42К и 45К по гену CagA был выше, чем для Cag 1, и составил 7,26 %. Выявляемый полиморфизм был связан как с нуклеотидными заменами, так и делециями/инсерциями. Размер CagA-локуса у изолята 45К составил 3552 н.о. и был больше на 9 н.о по сравнению с изо-лятом 42К. Следует отметить, что инсерции/ делеции были сгруппированы в начале ло-куса, представляя собой участки размером в один, пять и три нуклеотидов. Соотношение транзиций к трансверсиям было сходно с Cag1 и равнялось 1:2,96. Последовательность стоп-кодонов у изолятов была сходной и представлена триплетом TAA. Величина отличий транслируемых последовательностей составила 12,09 %, указывая что большая часть (>55 %) замен являлась несинонимичной. Несмотря на наличие инсерций/деле-ций нуклеотидов с размером, некратным
2021;18(3):159-167
трем, их суммарная протяженность равная 9 н.о. и кластерный характер расположения обусловил отсутствие сдвига рамки считывания в целом, и соответственно определил сходство аминокислотных последовательностей в значительной части полипептида. Вследствие сохранения консервативности структуры белка цитотоксин-ассоциирован-ного антигена, у обоих изолятов в его структурной организации были идентифицированы функциональные домены SMC_prok_B (суперсемейство TIGR02168) и CagA (суперсемейство pfam03507), определяющие токсикологические свойства полипептида.
Среди генов, детерминирующих структуру транспортного канала системы секреции, наименьшие различия между изолятами были выявлены для CagT — 1,54 %, а наибольшие — для CagY — 9,36 % (без учета делеций/инсер-ций) и 27,0 % (с учетом делеций/инсерций). Уровень несоответствия между изолятами для остальных локусов (Cag3, CagX, CagM) не превысил 3,5 %. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей также показал высокий уровень консерватизма для детерминирующих их локусов CagT, CagX, CagM, Cag3 — степень дифференциации составила 0,06, 1,53, 1,60 и 2,49 % соответственно. Также следует отметить, что выявленный полиморфизм данных генов был связан только с заменами азотистых оснований, не приводящими к изменению длины первичной последовательности нукле-отидной и кодируемой полипептидной цепи. В то же время различия в гене CagY между изолятами были также связаны и с делециями/инсерциями (5 фрагментов, длиной 552, 384, 114, 2 и 112 н.о.). Размер CagY-локуса у изолята 42К составил 5766 н.о. и превышал свой ортолог у изолята 42К (4602 н.о.). Данные различия в гене CagY также определили и различия в структуре белковой молекулы — 18,27 % (без учета делеций/инсерций) и 25,80 % (с учетом делеций/инсерций), и ее функциональных особенностей — число копий мотивов функционального домена CagY 1 Repeat у изолята 42К составило 3, у изолята 45К — 1, DC-EC Repeat — 3 и 2 соответ-свенно. Также у изолята 45К отсутствовали функциональные домены MSCRAMM (адгезивные свойства) и SbcCD (экзонуклеазная активность). В то же время у обоих изолятов в CagY были идентифицированы функциональные домены PTZ00121 и VIRB10.
Проведенный сравнительный анализ выявил высокую степень консервативности
2021;18(3):159-167 Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
локусов CagT, Cag3, CagX, CagM, что указывает на их ведущую роль в формировании патогенных свойств H. pylori и нахождение под действием стабилизирующего отбора. В то же время локусы CagA и CagY характеризуются значительной степенью вариабельности, что, по всей видимости, определяет вирулентность штаммов H. pylori, и делает их информативными молекулярными маркерами для оценки патогенетического потенциала бактерий.
Кроме изолятов H. pylori, объектами исследования по данному направлению выступали геномы 13 клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с множественной и экстремальной устойчивостью к антибиотикам, выделенным от госпитализированных пациентов. Предметом изучения являлись особенности первичной структуры генов, ассоциированных с патогенетическими характеристиками штаммов, а также локусов, детерминирующих резистентность к некоторым антибиотикам (и в частности, к колистину).
Исходя из результатов типирования генов «домашнего хозяйства» gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB, была установлена принадлежность изученных штаммов к пяти MLST-типам: ST23 (два штамма), ST512 (один штамм), ST11 (два штамма), ST147 (два штамма), ST395 (шесть штаммов), три последних из которых относились к группам высокого эпидемического риска.
Анализ генов вирулентности (rmpA, kfu, allS, iucA, magA и др.) показал, что ряд из них может иметь как «хромосомную» локализацию, так располагаться и в плазмидах (например, в pLVK).
По отношению к антибиотикам, среди изученных штаммов K. pneumoniae идентифицированы гены, определяющие устойчивость к препаратам различных групп, включая ß-лактамные, аминогликозиды, фторхиноло-ны, фосфомицин, хлорамфеникол, полимик-сины. При этом, устойчивость для ряда антибиотиков могла иметь полигенный характер. Так, например, среди детерминант карба-пенемаз, идентифицирован спектр генов — blaCTX-M, blaKPC-2, blaKPC-3, blaLEN7, blaOXA-9, blaOXA-48, blaTEM, blaSHV-182 и др. При этом, в каждом штамме могли выявляться одновременно от 4 до6 локусов. Кроме того, ряд наследственных детерминант, также могли иметь как «хромосомную», так и плазмидную локализацию.
Спектр диагностированных плазмид и изученных штаммов был широким и пред-
ставлен следующими типами: Col(IRGK), Col(pHAD28), Col440I, IncFIB(pQil), In-cFII(K), IncFII(pKP91), IncN, IncR, ColRNAI, ColpVC, IncFIB(K), IncFIB(pNDM-Mar), In-cHI1B(pNDM-MAR), IncX3, IncFII(K), IncL и др. При этом, у всех штаммов идентифицировано наличие более двух плазмид одновременно.
Анализ генов устойчивости к колистину показал, что наиболее частым механизмом формирования резистентности являлась ин-серционная инактивация или делеция генов белков-мишеней, вызванная действием мигрирующих генетических элементов (например, у изогенных штаммов применительно к гену mgrB). Среди циркулирующих штаммов K. pneumoniae также выявлено наличие генетического полиморфизма, вызывающего смещение рамки считывания, или формирование аминокислотных замен (D150Y, T157P и G207S в гене pmrB), определяющих пониженную восприимчивость к полимиксинам.
Анализ метагеномов
Проведенный анализ микробиома желудка пациентки со смешанной формой хронического гастрита и полипом антрального отдела желудка показал, что долевое участие Н.pylori в метагеноме желудка было менее 0,1 %. В то же время, среди идентифицированных бактерий, доминирующим являлся род Halo-monas (19,4 %). Долевое участие ниже 5 % было отмечено для Prevotella (3,6 %), Veillonel-la (3,3 %), Streptococcus (1,3 %), Bacillus (0,7 %), Neisseria (1,1 %), Leptotrichia (0,8 %), Fusobac-terium (0,6 %) и др.
На основании полученных данных был проведен дополнительный анализ образцов биоптатов слизистой желудка с различными заболеваниями желудка с использованием фрагментного анализа ДНК. Было установлено, что долевое участие Н. pylori в составе метагенома образцов, с различным формами рака желудка не превысило 25 %, гастрита — 6 %, язвы желудка — 1 %.
Также интересными оказались результаты сравнительной оценки долевого участия H. pylori в микробиомах биоптатов, взятых у одних и тех же пациентов из различных (с наличием и отсутствием признаков патологии) участков желудка. Установлено, что в случае рака желудка наблюдалось значительное (до 30 раз) снижение содержания H. pylori в микрофлоре патологических образцов. В то же время, в случае язвенной патологии существенного колебания удельного веса H. pylori в микробиоме патологических и нормальных образцов не наблюдалось.
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
2021;18(3):159-167
Диапазон вариаций частоты встречаемости при диагнозах «гастрит» и «эрозия желудка» был значительным — 3-40 раз, однако не имел выраженной направленности по отношению к нормальным и патологическим образцам.
В ходе анализа назальных образцов у пациента с диагнозом «коронавирусная инфекция», кроме представленного ранее генома SARS-CoV-2, также был изучен микробиом на основании анализа не баркодинговых маркеров, а экспрессирующихся белок-ко-дирующих последовательностей (транс-криптов). На основании результатов анализа метатранскриптома было установлено, что в доминирующем количестве был представлен генетический материал бактерий рода Streptoccocus — 36 %. В меньшем количестве были диагностированы представители рода ТпсЫпе11а (9 %), Acinetobacter (7 %), VeШonel-1а (5 %), Ргеио1еПа (5 %) и др. На долю SARS-CoV-2 приходилось менее 2 % от всей полученной генетической информации. В разрезе вирусной инфекции 59 % составлял SARS-
CoV-2, 9 % — Rhinolophus affinis Coronavirus, 6 % — Bat SARS Coronavirus HKU3, 3 % — Mitovirus sp. и др.
Заключение
Проведенные молекулярно-генетические исследования показали, что значительная часть наследственной изменчивости микроорганизмов связана не с внутригенным полиморфизмом, а с особенностями структурной организации геномов, что может оказывать существенное влияние на вирулентные свойства патогенов, и должно учитываться в качестве дополнительного критерия при проведении диагностики инфекционных заболеваний. Описание свойств микробиомов и функциональной оценки метаболомов сообществ микроорганизмов должно осуществляться не только на основе типирования таксон-специфических маркеров, а с использованием дополнительных критериев — генов, детерминирующих факторы патоген-ности и вирулентности, являющихся молекулярным признаком патосистем.
Список литературы
1. Бородинов АГ, Манойлов ВВ, Заруцкий ИВ, Петров АИ, Курочкин ВЕ. Поколения методов секве-нирования ДНК (обзор). Научное приборостроение. 2020;30(4):3-20.
2. Воропаев ЕВ, Осипкина ОВ, Баранов ОЮ, Ру-занов ДЮ, Лызикова ЮА, Платошкин ЭН, Зятьков АА, Шафарост АС, Зайцева ВИ. Метод определения видового состава микробных сообществ c использованием Т-ПДРФ анализа рДНК-маркеров. Инструкция по применению. Рег. №: 120-1118. Дата утверждения: 30.11.2018.
3. Стома ИО. Микробиом в медицине: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020. 320 с.
4. Стома ИО, Ющук НД. Микробиом человека на стыке инфектологии и других разделов медицины: современное состояние проблемы и переоценка взглядов на патогенез заболеваний. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2019;8(3):78-84.
DOI: https://doi.org/10.24411/2305-3496-2019-13012
5. Воропаев ЕВ, Баранов ОЮ, Валентович ЛН, Осипкина ОВ, Зятьков АА, Бонда НА, Воропаева АВ, Платошкин ЭН, Мицура ВМ, Шафорост АС. Структурно-функциональная организация генома клинически значимого штамма Helicobacter pylori HP42k, изолированного от пациентки учреждения здравоохранения Республики Беларусь. Молекулярная медицина. 2020;18(2):39-43.
6. Allali I, Arnold JW, Roach J, et al. A comparison of sequencing platforms and bioinformatics pipelines for compositional analysis of the gut microbiome. BMC Microbiol. 2017;17(1):194.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-017-1101-8
7. Ardui S, Ameur A, Vermeesch JR, Hestand MS. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age:
applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic
Acids Res. 2018;46(5):2159-2168.
DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gky066
8. Stoma IO, Baranov OY, Voropaev EV, Osipkina OV, Ziatskov AA, Shaforost AS, Padutov VE, Panteleev SV, Kiryanov PS, Mozharovskaya LV. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate SARS-CoV-2/human/ BLR/Sars-Cov-2 isolate 724 Gomel Belarus/2021, complete genome. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: MW674675.1 [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/MW674675.1
9. Gomel State Medical University. Stomach metagenome[Electronicresource].NCBI.SRAPRJNA700813 1. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA700813
10. GISAID: hCoV-19/Belarus/Gomel/2021 Accession ID: EPI_ISL_1222766. [Electronic resource]. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https://www. gisaid.org
11. Gloor GB, Macklaim JM, Pawlowsky-Glahn V, Egozcue JJ. Microbiome Datasets Are Compositional: And This Is Not Optional. Front Microbiol. 2017 Nov;15(8):2224. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02224
12. Goodwin S, McPherson J, McCombie W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-351.
DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49
13. Hengyun Lu, Francesca Giordano, Zemin Ning, Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2016;14(5):265-279.
DOI: https://doi.org/10.1016/igpb.2016.05.004
14. TRAPID. Online tool for the fast, reliable and user-friendly analysis of de novo transcriptomes. [Electronic resource]. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: http://bioinformatics.psb.ugent.be/trapid 02/
2021;18(3):159-167 Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues
15. Воропаев ЕВ, Осипкина ОВ. Алгоритм функциональной аннотации транслируемых последовательностей в геноме клинически значимых для Беларуси штаммов Helicobacter pylori [Электронный ресурс]. Достижения медицинской науки Беларуси. [дата обращения 2021 Aug 12]. Режим доступа: http://med.by/dmn/ book.php?book=19-4 2
16. One Codex. A fast, easy-to-use platform for microbiome sequencing and analysis. [Electronic resource]. [date of access 2021 August 12]. Available from: https:// www.onecodex.com
17. Li J, Du P, Ye AY, Zhang Y, Song C, Zeng H, Chen C. GPA: A Microbial Genetic Polymorphisms Assignments Tool in Metagenomic Analysis by Bayesian Estimation. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 Feb;17(1):106-117.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.005
18. Ребриков ДВ, Коростин ДО, Шубина ЕС, Ильин-ски18. й ВВ. NGS: высокопроизводительное секвениро-вание: монография. 3-е изд. Москва: Лаборатория знаний, 2020. 235 с.
19. Voropaev EV, Osipkina OV, Baranov OU, Ziatskov AA, Voropaev AV, Platoshkin EN, Bonda NA. Valentovich LN. Helicobacter pylori complete genome in Belarus. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: NZ_CP034314.1 [date of access 2021 August 12]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/1535583272
20. Voropaev EV. New pathogenic Helicobacter pylori strain in Belarus. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: NZ_SZUB00000000.1.[date of access 2021 Aug 12]. Available from: https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1635704349
22. Shintani M, Sanchez ZK, Kimbara K. Genomics of
microbial plasmids: classification and identification based on replication and transfer systems and host taxonomy. (англ.). Frontiers In Microbiology. 2015;6:242-242. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00242
23. Stoma I, Littmann ER, Peled JU, Giralt S, van den Brink MRM, Pamer EG, Taur Y. Compositional flux within the intestinal microbiota and risk for bloodstream infection with gram-negative bacteria. Clin Infect Dis. 2020 Jan 24:ciaa068.
DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciaa068
24. Stoma I, Moduleva E; Gubanova T, Iskrou I, Karpov I, Krivenko S, Shturich I, Kalachyk O, Uss A., Rummo O. Gut microbiome dynamics over a course of kidney transplantation: preliminary results of a pilot study. Transplantation: 2020; 104(Is S3):S191 DOI:https://doi.org/10.1097/01.tp.0000699336.48313.1e
25. Sun J, Liao XP, D'Souza AW, et al. Environmental remodeling of human gut microbiota and antibiotic resistome in livestock farms. Nat Commun. 2020 Mar 18;11(1):1427.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-15222-y
26. Toyokawa M, Taniguchi M, Uesaka K, Nishimura K. Complete Genome Sequence of Multidrug-Resistant Strain Nocardia wallacei FMUON74, Isolated from a Sputum Culture. Microbiol Resour Announc. 2020 Nov 19;9(47):e01022-20.
DOI: https://doi.org/10.1128/MRA.01022-20
27. Tatusova T, DiCuccio M, Badretdin A, Chetvernin V, Nawrocki EP, Zaslavsky L, Lomsadze A, Pruitt KD, Borodovsky M, Ostell J. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Res. 2016; 44(14): 66146624.
DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkw569
References
1. Borodinov AG, Manoilov BB, Zarutsky IV, Petrov AI, Kurochkin VE. Generations of DNA sequencing methods (review). Scientific instrumentation. 2020;30(4):3-20. (in Rus.).
2. Voropaev EV, Osipkina OV, Baranov OY, Ruzanov DU, Lyzikova YuA, Platoshkin EN, Ziatskov AA, Shafarost AS, Zaitseva VI. A method for determining the species composition of microbial communities using T-PDRF analysis of rDNA markers. Instruction for use. In: 1201118. Date of approval: 30.11.2018. (in Rus.).
3. Stoma IO. Microbiome in medicine: a guide for doctors. Moscow: GEOTAR-Media, 2020. 320 с. (in Rus.).
4. Stoma IO, Yushchuk ND. Human microbiome at the interface of infectiology and other sections of medicine: the current state of the problem and reassessment of views on disease pathogenesis. Infectious diseases: news, opinions, and teaching. 2019;8(3):78-84. (in Rus.).
DOI: https://doi.org/10.24411/2305-3496-2019-13012
5. Voropaev EV, Baranov OY, Valentovich LN, Osipkina OV, Ziatskov AA, Bond NA, Voropaeva AV, Platoshkin EN, Mitsura VM, Shaforost AS. Structural and functional organization of the genome of a clinically relevant Helicobacter pylori HP42k strain isolated from a patient of a Belarusian healthcare institution. Molecular Medicine. 2020;18(2):39-43. (in Rus.).
6. Allali I, Arnold JW, Roach J, et al. A comparison of sequencing platforms and bioinformatics pipelines for compositional analysis of the gut microbiome. BMC Microbiol. 2017;17(1):194.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-017-1101-8
7. Ardui S, Ameur A, Vermeesch JR, Hestand MS. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic Acids Res. 2018;46(5):2159-2168.
DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gky066
8. Stoma IO, Baranov OY, Voropaev EV, Osipkina OV, Ziatskov AA, Shaforost AS, Padutov VE, Panteleev SV, Kiryanov PS, Mozharovskaya LV. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate SARS-CoV-2/human/BLR/ Sars-Cov-2 isolate 724 Gomel Belarus/2021, complete genome. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: MW674675.1 [cited 2021 Aug 12]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW674675.1
9. Gomel State Medical University. Stomach metagenome [Electronic resource]. NCBI. SRA PRJNA7008131. [date of access 2021 Aug 12]. Available from:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?
term 4Ш JNA7GraATO: hCoV-19/Belarus/Gomel/2021 Accession ID: EPI_ISL_1222766. [Electronic resource]. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https://www. gisaid.org
11. GISAID: hCoV-19/Belarus/Gomel/2021 Accession ID: EPI_ISL_1222766. [Electronic resource]. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https://www. gisaid.org
12. Gloor GB, Macklaim JM, Pawlowsky-Glahn V, Egozcue JJ. Microbiome Datasets Are Compositional: And This Is Not Optional. Front Microbiol. 2017 Nov;15(8):2224.DOI:https://doi.org/1Q.3389/fmicb.2Q17.Q2224
13. Goodwin S, McPherson J, McCombie W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-351.
DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49
14. Hengyun Lu, Francesca Giordano, Zemin Ning, Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2016;14(5):265-279.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.gpb.2016.05.004
Проблемы здоровья и экологии/Health and Ecology Issues 2021;18(3):159-167
15. TRAPID. Online tool for the fast, reliable and user-friendly analysis of de novo transcriptomes. [Electronic resource]. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: http://bioinformatics.psb.ugent.be/trapid 02/
16. Voropaev EV, Osipkina OV. Algorithm of functional annotation of translated sequences in the genome of Helicobacter pylori strains clinically significant for Belarus [Electronic resource]. [date of access 2021 August 12]. Available from: http://med.by/dmn/book. php?book=19-4 2 (in Rus.).
17. One Codex. A fast, easy-to-use platform for microbiome sequencing and analysis. [Electronic resource]. [date of access 2021 August 12]. Available from: https://www.onecodex.com
18. Li J, Du P, Ye AY, Zhang Y, Song C, Zeng H, Chen C. GPA: A Microbial Genetic Polymorphisms Assignments Tool in Metagenomic Analysis by Bayesian Estimation. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2019 Feb;17(1):106-117.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.005
19. Rebrikov DV, Korostin DO, Shubina ES, Ilyinsky BB. NGS: high-throughput sequencing: a monograph. Moscow: Laboratory of Knowledge, 2020. 235 c. (in Rus.).
20. Voropaev EV, Osipkina OV, Baranov OU, Ziatskov AA, Voropaev AV, Platoshkin EN, Bonda NA. Valentovich LN. Helicobacter pylori complete genome in Belarus. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: NZ_ CP034314.1 [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1535583272
21. Voropaev EV. New pathogenic Helicobacter pylori strain in Belarus. [Electronic resource]. NCBI Nucleotide. GenBank NCBI: NZ_SZUB00000000.1. [date of access 2021 Aug 12]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/1635704349
22. Shintani M, Sanchez ZK, Kimbara K. Genomics of microbial plasmids: classification and identification based on replication and transfer systems and host taxonomy. (англ.). Frontiers In Microbiology. 2015;6:242-242.
DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00242
23. Stoma I, Littmann ER, Peled JU, Giralt S, van den Brink M RM, Pamer EG, Taur Y. Compositional flux within the intestinal microbiota and risk for bloodstream infection with gram-negative bacteria. Clin Infect Dis. 2020 Jan 24:ciaa068.
DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciaa068
24. Stoma I, Moduleva E; Gubanova T, Iskrou I, Karpov I, Krivenko S, Shturich I, Kalachyk O, Uss A., Rummo O. Gut microbiome dynamics over a course of kidney transplantation: preliminary results of a pilot study. Transplantation: 2020; 104(Is S3):S191
DOI: https://doi.org/10.1097/01.tp.0000699336.48313.1e
25. Sun J, Liao XP, D'Souza AW, et al. Environmental remodeling of human gut microbiota and antibiotic resistome in livestock farms. Nat Commun. 2020 Mar 18;11(1):1427.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-15222-y
26. Toyokawa M, Taniguchi M, Uesaka K, Nishimura K. Complete Genome Sequence of Multidrug-Resistant Strain Nocardia wallacei FMUON74, Isolated from a Sputum Culture. Microbiol Resour Announc. 2020 Nov 19;9(47):e01022-20.
DOI: https://doi.org/10.1128/MRA.01022-20
27. Tatusova T, DiCuccio M, Badretdin A, Chetvernin V, Nawrocki EP, Zaslavsky L, Lomsadze A, Pruitt KD, Borodovsky M, Ostell J. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Res. 2016;44(14):6614-6624.
DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkw569
Информация об авторах / Information about the authors
Воропаев Евгений Викторович, к.м.н., доцент, проректор по научной работе УО «Гомельский государственный медицинский университет»;
0RCID:https://orcid.org/0000-0002-9435-6109 e-mail:voropaev.evgenii@gmail.com Стома Игорь Олегович, д.м.н., доцент, ректор УО «Гомельский государственный медицинский университет»;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0483-7329 e-mail: rektor@gsmu.by
Тапальский Дмитрий Викторович, д.м.н., доцент, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии УО «Гомельский государственный медицинский университет»;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9484-7848 e-mail: tapalskiy@yandex.by
Evgenii V. Voropaev, PhD (Med), Associate Professor, Vice-Rector in charge of scientific work of Gomel State Medical University;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9435-6109 e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com Igor O. Stoma, DMedSc, Associate Professor, Rector of Gomel State Medical University;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0483-7329 e-mail: rektor@gsmu.by
Dzmitry V. Tapalski, DMedSc, Associate Professor, Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, Gomel State Medical University;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9484-7848 e-mail: tapalskiy@yandex.by
Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
Воропаев Евгений Викторович Evgenii V. Voropaev
e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com
Received / Поступила в редакцию 14.07.2021 Revised / Поступила после рецензирования 23.08.2021 Accepted / Принята к публикации 20.09.2021
