CC BY
249ОБЗОРЫ
© А.Е.АЛЕКСЕЕВА, Н.Ф.БРУСНИГИНА, 2015
А.Е.Алексеева, Н.Ф.Бруснигина
МЕТАГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н.Блохиной
Принцип массового параллельного секвенирования, иначе называемый секвениро-ванием следующего поколения «next-generation sequencing (NGS)», появился в начале 2000-х годов и был воплощен в десятке платформ NGS. Высокая производительность и скорость секвенирования платформ NGS открыли перед учеными широкие горизонты в области геномных исследований, включая метагеномные, связанные, в первую очередь, с изучением структуры различных микробиоценозов. Появились десятки работ, посвященных изучению микробиома и вирома различных биотопов человека в норме и при патологии с использованием платформ NGS, формируя новые представления о патогенезе и эпидемиологии различных инфекционных заболеваний. Значительное снижение стоимости анализа способствует расширению сфер применения технологий NGS не только в области фундаментальных, но и прикладных микробиологических исследований, включая этиологическую диагностику инфекционных заболеваний. В связи с ростом числа случаев инфекционных заболеваний, не имеющих типичной клинической картины, использование метагеномного подхода имеет особое значение, позволяя проводить детекцию широкого спектра возбудителей бактериальных, вирусных и паразитарных инфекций. В обзоре представлены технологические особенности платформ массового параллельного секвенирования, основные методы метагеномных исследований и биоинформационные подходы, применяемые для анализа полученных результатов. Описаны исследования по изучению микробиома здорового человека и при патологиях, рассмотрены возможности и перспективы применения метагеномного подхода в диагностике и системе эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 81-89
Ключевые слова: технологии массового параллельного секвенирования, платформы NGS, метагеномные исследования, биоинформационный анализ, микробиом человека, диагностика инфекционных заболеваний, эпидемиологический надзор
A.E.Alekseeva, N.F.Brusnigina
METAGENOMIC STUDIES AND INFECTIOUS DISEASES DIAGNOSTICS
Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russia
Principles of mass parallel sequencing, otherwise called next generation sequencing (NGS), appeared at the beginning of2000s and were realized in dozens of NGS platforms. High performance and sequencing speed of NGS platforms opened wide horizons for scientists in the field of genomic studies, including metagenomic, first of all related to studies of structure of various microbiocenoses. Dozens of studies dedicated to studies of microbiome and virome of various biotopes of humans in normal state and pathology by using NGS platforms have appeared, forming novel conceptions on pathogenesis and epidemiology of various infectious diseases. Significant cost reduction of the analysis facilitates expansion of sphere of application for NGS technologies not only in the field of fundamental, but also applied microbiologic studies, including etiologic diagnostics of infectious diseases. Due to the increase of the number of cases of infectious di-
6. ЖМЭИ 2 № 12-2015
81
seases, that do not have a typical clinical presentation, use of metagenomic approach is of particular importance, allowing to carry out detection of a wide spectrum of causative agents of bacterial, viral and parasitic infections. Technologic features of mass parallel sequencing platform, main methods of metagenomic studies and bioinformatics approaches, used for the analysis of data obtained, are presented in the review. Studies on healthy human microbiome and in pathology are described; possibilities and perspectives of metagenomic approach application in diagnostics and system of epidemiologic control of infectious diseases are examined.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 2, P. 81-89
Key words: mass parallel sequencing technologies, NGS platforms, metagenomic studies, bioinformation analysis, human microbiome, infectious diseases diagnostics, epidemiologic control
Золотым стандартом секвенирования нуклеиновых кислот является метод Сэн-гера, в основе которого лежит терминирование растущей цепи ДНК дидезоксирибо-нуклеозидтрифосфатами [44]. В основе принципа массового параллельного секвенирования лежит метод «shotgun-sequencing» (метод «дробовика»), заключающийся в фрагментировании ДНК на короткие участки и последующем определении их ну-клеотидной последовательности. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей осуществляется с помощью компьютерных биоинформационных программ [29, 32, 40, 50]. Высокая производительность платформ NGS обеспечивается возможностью одновременного секвенирования десятков образцов ДНК. Основные этапы секвенирования представлены на рис. 1.
Ойгчсщ!,;:^ Nti
i i
Cwpfmm ЛМ&МКГПНФ С&агин&ч Соадвние OtfrnLHSTiji/
Ll't nyi им JUflfiWt**
Фрнгчан-нромнин, (.'¡¡a me-rmuOtiu-re' ОН К!, (ЧКМЫЛ ДНК»
rqwcoww«»« Fip»PO«B*MWW
гш-' se-uDi" гныи для г п ери а адаптере» ViHUCLTSLnbh =Е1 ЦДД'ПК-ЛТН
M Р ЙНПвКИЮ и к •?) st Й * л) w й ч til
0 гшисыыи ПЦР С îtOMûtiM) Î114P Ç "□MD.I^U ПЦР
J
Cw.Kflwuiw (пуадчдаврмчч? оСрвдивд п 1
ЛиОДХфМкЬДО И [чжшл-нрсшынни зьфш.^и^-лал--|ык 4>Pdi wui-'chi Ш'К
1
ДйкштчдйДО' слилсяьашый ¿шмедшаябльимагаЛ йчдйоай й рйбвродаяяшя
X
" п 3 2 н лна 3 и m фрвтвнэд ДНК чйрю КбУОДВММВДНДО чук." Й О11-JViyi -пг.пгдрля-р,-ь.1пгл. гиаттпря С у^1Ипгрс.тш,|. JM Г -а>4грги ИММП!} АЛНПГНЛН-И^М ni rCIHEipX-IDL-l И VHKpDJHLilHUL И." H CrCiJIUMhill и 'IL1IU I- ¡ИгПЛНйЙ ï'-eftlU'
■ fyfUHJI ЛДИаи
пюгвооэвтьпьннги
№«№(№3 ДИК.
Нукяесэдддо« rrtcwvKwfr1*1 (tHftc^f №«№(№3 Д' IH eftjiwui Г«3
Рис. 1. Этапы секвенирования на платформах NGS.
Таблица 1. Основные методы метагеномных исследований и биоинформационные программы, используемые для анализа результатов секвенирования
Методы метагеномных Основная Основные базы данных нуклеотидных Используемые биоинформа- Преимущества Недостатки
исследований последовательностей граммы
Секвенирование фрагментов ДНК, кодирующих эволюцион-но консервативные гены
Секвенирование суммарной ДНК/ РНК сообщества путем ее случайного фраг-ментирования (wholemetagenome shotgun sequencing)
Метод основан на исследовании эволюционно консервативных генов — маркеров (^рРНК) с использованием универсальных праймеров [10, 22, 32, 35, 53, 56]
Метод основан на случайной фрагментации общей ДНК/РНК, находящейся в образце, и одновременном определении нуклеотидной последовательности всех полученных фрагментов [15, 22, 32, 50]
NCBI, Greengenes [16],
Ribosomal Database Project [14], SILVA [41]
NCBI, KEGG [24],
eggNOG [36],
COG [49], SEED [17]
QIIME
(quantitative insights into microbial ecology) [9], Mothur [36]
IMG/M [11], MG-RAST [20], CAMERA [47],
MEGAN [23]
Наиболее простой и недорогой метод идентификации, позволяющий охватить широкий круг бактерий [10, 32, 56]
Дает возможность выявить широкий спектр микроорганизмов (бактерии, вирусы, грибы и простейшие) и провести анализ метаболических и филогенетических взаимосвязей [15, 22, 32, 50]
Не всегда позволяет проводить видовую идентификацию. Наличие избирательности «bias» не дает достоверной информаии о структуре сообщества [10, 15, 32, 50, 56]. В качестве дополнения могут быть использованы гены rpo-B и cpn-60 [15, 32, 56]
Дорогостоящий, высокая степень контаминации ДНК человека, большой процент неидентифициро-ванных нуклеотид-ных последовательностей, сложный биоинформационный анализ [15, 22, 32, 50]
Все существующие платформы NGS основаны на секвенировании путем синтеза с использованием ДНК-полимеразы и секвенировании путем лигирования с помощью ДНК-лигазы [29, 40, 53].
Секвенирование путем синтеза применяется на платформах, выпускаемых фирмами Roche (Швейцария) (http://www.454.com/), Illumina (США) (http://www.illumina. com), IonTorrent/LifeTechnologies (США) (http://www.iontorrent.com/). Пиросеквена-торы 454 фирмы Roche основаны на детекции хемилюминесцентного сигнала, формирующегося в результате высвобождения пирофосфата при присоединении соответствующего дезоксирибонуклеозидтрифосфата (дНТФ) ДНК-полимеразой, для получения разобщенных фрагментов используется эмульсионная ПЦР (эПЦР) на микрошариках [29, 40, 53]. Секвенаторы, выпускаемые фирмой Illumina, основаны на регистрации флуоресцентного сигнала при присоединении ДНК-полимеразой одного из четырех дНТФ, помеченного определенным флуорофором, фрагменты ДНК фиксируются на поверхности стеклянного чипа проточной ячейки и амплифициру-ются методом «bridge amplification» (амплификация мостом) [29, 40, 53]. Принцип технологии, используемой полупроводниковыми секвенаторами IonTorrent производителя LifeTechnologies, основан на детекции изменения рН при выделении одного протона водорода в результате встраивания дНТФ ДНК-полимеразой в реальном времени, фрагменты ДНК присоединяются к поверхности микрошариков и ампли-фицируются с использованием эПЦР [29, 40].
Отличительной особенностью секвенирования нуклеиновых кислот путем лигирования является использование ДНК-лигазы — фермента, образующего ковалент-ную связь между 5'-фосфатом и 3'-гидроксилом в одноцепочечном разрыве ДНК-дуплекса. Данная технология используется платформами SOLiD производителя Applied Biosystem (http://www.appliedbiosystems.com). В процессе лигирования к цепи
ДНК присоединяется соответствующий динуклеотид, входящий в состав олигону-клеотидного зонда и несущий определенную флуоресцентную метку. Разделение и амплификация фрагментов ДНК проводится с использованием эПЦР на микрошариках [29, 40, 53].
Метагеномика — это один из разделов геномики, посвященный изучению суммарного генетического материала (метагенома) с целью определения видового состава и метаболических взаимосвязей между представителями микробиоценоза исследуемого образца [2, 15, 35]. Важнейшей особенностью метагеномных исследований является отсутствие необходимости выделения и культивирования микроорганизмов и возможность индикации и идентификации широкого спектра бактерий, вирусов, грибов и простейших [15, 35]. Основные методы метагеномных исследований, базы данных нуклеотидных последовательностей и биоинформационные программы, используемые для анализа результатов, представлены в табл. 1.
Одним из важнейших объектов изучения метагеномики является симбиотический микробиом человека. Высокая производительность платформ NGS позволила проводить изучение как отдельных биотопов (респираторного тракта, толстого кишечника, ротовой полости, кожи, вагины), так и крупномасштабные комплексные исследования микробиома здоровых людей, а также вирома человека. Примеры таких исследований представлены в табл. 2.
Поскольку ферментативная и биохимическая активность микробиоты прямо или косвенно связана с патогенезом множества заболеваний, то немалый интерес вызывает изучение динамического изменения структуры микробиоценозов биотопов тела человека при различных соматических и инфекционных заболеваниях (табл. 3).
В настоящее время все большее значение в лабораторной диагностике придается молекулярно-генетическим методам исследования [22, 32, 53]. Методы, основанные
Таблица 2. Изучение микробиома и вирома здорового человека с использованием платформ NGS
Объект исследования, число обследованных
Метод метагеномного исследования, платформа NGS
Автор, год, страна
Образцы 15—18 различных биотопов тела человека, 242 здоровых взрослых человека
Образцы 15—18 различных биотопов тела человека, 200 здоровых взрослых человек
Вагинальный микробиом, 396 здоровых женщин, относящихся к различным этническим группам: белые, черные, латиноамериканки, азиатки Респираторный тракт (носоглотка и ротоглотка), 29 курящих и 33 некурящих взрослых человека
Респираторный тракт (носоглотка), 96 здоровых детей (возраст 18 месяцев) Ротовая полость (зубной налет), 8 человек с различным уровнем состояния здоровья ротовой полости Толстый кишечник (кал), 96 здоровых взрослых человек из различных регионов России
Виром толстого кишечника (кал), 5 здоровых взрослых человек
Виром толстого кишечника (кал), 6 здоровых человек
Секвенирование гена 16S рРНК, 454 GS FLX titanium (Roche) и метагеном-ной ДНК, GAIIx (Illumina) Секвенирование гена 16S рРНК, 454 GS FLX titanium (Roche)
Секвенирование региона V1-V2 гена 16S рРНК на платформе 454 GS FLX (Roche)
Секвенирование региона V1-V2 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche)
Секвенирование региона V5-V6 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche) Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche)
Секвенирование метагеномной ДНК, SOLiD4, Ion Torrent PGM (Life Technologies), GS FLX+(Roche), HiSeq 2000 (Illumina)
Секвенирование метагеномной вии-русной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche)
Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche)
HMP Consortium., 2012 (США, Канада) [49] Бельгия)
Li К. et al., 2012 (США) [27]
Ravel J. et al., 2011 (США) [43]
Charlson E.S. et al., 2010 (США) [11]
Bogaert D. et al, 2011 (Нидерланды) [7] Alcaraz L.D. et al., 2012 (Испания) [5]
Tyakht A.V. et al., 2013 (Россия) [52]
Kim M. et al., 2011 (Южная Корея) [25]
Minot S. et al., 2011 (США) [33]
Таблица 3. Изучение микробиома человека при различных патологиях с использованием платформ NGS
Объект исследования, число обследуемых
Метод метагеномного исследования, платформа
Авторы, год, страна
Респираторный тракт больных туберкулезом (мокрота), 22 больных и 14 здоровых
Респираторный тракт 5 больных муко-висцидозом (мокрота) и 5 человек не больных муковисцидозом Респираторный тракт у людей с различными инфекционными заболеваниями нижних дыхательных путей (аспираты), 210 человек (70% дети до 7 лет и 30% 8—92 лет)
Толстый кишечник больных гепатитом В (кал), 120 больных и 120 здоровых Кожа при псориазе (биопсия), 10 больных и 12 здоровых
Толстый кишечник (кал), ротовая полость (смывы с десен) и атеросклеро-тические бляшки (эндартерэктомия участка) при атеросклерозе, 15 больных и 15 здоровых
Толстый кишечник (кал), 31 пара однояйцевых близнецов, 23 пары разнояйцевых близнецов, их матери (46). Структура микробиома кишечника при ожирении
Ротовая полость при заболеваниях па-родонта (зубной налет), 2 больных и 3 здоровых
Секвенирование y4acTKaV1—V2 гена 16S рРНК,454 GS FLX-Titanium (Roche)
Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX (Roche)
Секвенирование метагеномной ДНК и РНК(кДНК), 454 GS 20 и 454 GS FLX (Roche)
Cheung M. K. et al., 2013 (Китай) [13]
Willner D. et al., 2009 (США) [55]
Lysholm F. et al., 2012 (Швеция) [31]
Секвенирование метагеномной ДНК, Wei X. et al., 2013 (Китай)
Genome Analyzer IIx (Illumina) Секвенирование региона V3—V4 гена 16S рРНК, 454- GS FLX (Roche) Секвенирование участка V1—V2 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche)
Секвенирование всего гена 16S рРНК на платформе ABI 3730xl (Applied Biosistems); регионов V2, V6 гена 16S рРНК и метагеномной ДНК на платформе 454 GS FLX (Roche) Секвенирование гена 16S рРНК на платформе 454 GS FLX (Roche) и метагеномное секвенирование на платформе GAII (Illumina)
[54]
Fahlen A. et al., 2012 (Швеция, Англия) [18] Koren O. et al., 2011, (США) [26]
Turnbaugh P.J. et al., 2009 (США, Франция) [51]
Liu B. et al., 2012 (США) [28]
на секвенировании нуклеиновых кислот, позволяют выявлять генетическую структуру как новых, так уже известных инфекционных агентов, осуществлять мониторинг их генетической вариабельности и распространенности.
В последние годы в связи с усилением миграции населения, ослаблением санитарного контроля, возникновением атипичных штаммов бактерий и новых вариантов вирусов происходит рост числа случаев инфекционных заболеваний, не имеющих типичной клинической картины [1]. При этиологической диагностике подобных инфекций использование метагеномного подхода приобретает особую актуальность [15, 22, 32, 53]. Метагеномика, по мнению Жебруна А.Б., дает уникальный шанс освоить один универсальный подход взамен многих разнородных методов индикации, идентификации и генотипирования патогенов [3].
Алгоритм детекции патогенов с использованием метагеномного подхода включает многоступенчатый процесс подготовки библиотеки ДНК/РНК, собственно секве-нирование и биоинформационный анализ результатов (рис. 2).
В работах зарубежных исследователей описаны примеры выявления ранее неизвестных инфекционных агентов с использованием метагеномного секвенирования на платформах NGS, например, новых штаммов аренавируса, возбудителей лихорадки [8] и менингита [39]; штамма астровируса — возбудителя энцефалита [42]; нового боньявируса, вызвавшего вспышку лихорадки, сопровождающейся тромбоцитопе-нией и лейкопенией [57]; вируса Sosuga семейства Рагашухоушёае — возбудителя острой геморрагической лихорадки [4] и др.
Возможность метагеномного секвенирования получать почти полные нуклеотид-ные последовательности геномов используется для обнаружения новых геновариан-тов высоко дивергентных вирусов, таких как вирус гриппа [21], вирус папилломы человека [34], ортореовирус [46].
Минни ими*
□Сриац
ПЩвПШ» JHVPHV [тй ноилу дли
ГН[Н|НЛ|Н.КННМ
IB I.' □ KtXJIiNCX
Ш1ИЛ.13
С "ПЧЗШЫ] ''-,= lUlli
SVWfe-:
1. (|.н^1-,и V* □ Г
» у<![Л^™ Hiiiimau»
Т. рцдштчя ГЕЛТЧ;
* ясчр»*«- тыиы
т чяитнфтпчнт пцчнгнншпй- тнггтчг-
1. ^т^ш пнет! 'nci-ь-й * -
ч-нн^и
>ИПН Мк-
J. 1цаг[пс1Кй CvOnH3~DKii.
^й Р-< Г[мщ10.£л-А.1н fcpWttW: ■ пйрпйоп^ j;-iBJcrt
* тррчвджтхч
П:цу|Ш1к«я ДЧС;
I IWMIH Ц|■ I
* jtfbbutfnim d^idiiiiij Linrt
- тнтл,нфистин
1- flHf
»■ ЕЛГГЧЯ" »Й4М4* Л
мы йкгвриА >Ыв
J. (Jfl sC^H-ttMrfH 0t tHHt- ИШАйНтИ ~>а:лцдэитшш'0ст1ай ■ сэ-гнг*
HitW SO ГОТП 2
*
» MlPtuw fltmM»
Рис. 2. Алгоритм детекции патогенов с использованием метагеномного подхода.
FastQC — Fast Quality Control; PRINSEQ — Preprocessing and Information of Sequences tool; BMTagger — Best Match Tagger; RefSeq — Reference Sequence Database; IMG — Integrated Microbial Genomic; MetaVelvet — программное обеспечение Velvet для метагеномных данных; SOAP de novo — Shot Oligonucleotide Analysis Package; BLAST — Basic Local Alignment Search Tool.
В ряде зарубежных работ метагеномный подход был использован для индикации бактериальных инфекционных агентов. Так, в исследовании Nakamura S. et al. [37] метагеномное секвенирование позволило обнаружить Campylobacter jejuni в образцах кала у больных диареей. Loman N.J. et al. [30] при ретроспективном исследовании образцов фекалий от больных диареей во время вспышки эшерихиоза в 2011 году в Германии получили нуклеотидные последовательности генома нового штамма Escherichia coli O104:H4, позволившие провести генотипирование. Кроме того, в некоторых образцах были обнаружены нуклеотидные последовательности других возбудителей: Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter concisus, Salmonella enterica, наличие которых было подтверждено культуральным методом. Полученные результаты свидетельствуют, что метагеномное секвенирование наряду с традиционными методами культивирования и генотипирования патогенов может применяться при эпидемиологических расследованиях вспышек инфекционных заболеваний.
Метагеномные исследования с использованием платформ NGS позволяют установить случаи ко-инфицирования патогенами, для выявления которых отсутствуют коммерческие ПЦР тест-системы. Например, Yang J. еt al. [58] при анализе образцов смывов со слизистой носоглотки у детей с инфекцией нижних дыхательных путей обнаружили в одном образце наличие ассоциации энтеровируса с риновирусом. Nakamura S. еt al. [38] в образцах аспиратов из носоглотки и образцах кала, собранных у детей во время сезонной вспышки гриппа и норовирусной инфекции, обнаружили
кроме вируса гриппа наличие полиомавируса WU (Washington University) и корона-вируса человека HCoV-HKU1 в двух образцах аспиратов, а в одном образце кала — эндогенный ретровирус HCML-ARV
Таким образом, метагеномные исследования с использованием технологий массового параллельного секвенирования позволяют решать широкий спектр задач диагностики и эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями, связанных с открытием новых вирусов и бактерий, выявлением известных инфекционных агентов с измененной генетической структурой, изучением динамических изменений микробиоты и определением роли присутствующих в ассоциациях патогенов в развитии актуальных инфекций. Кроме того, результаты метагеномного сек-венирования могут быть использованы как для создания новых, так и для совершенствования существующих диагностических ПЦР тест-систем.
Л ИТЕРАТУРА
1. Дедков В.Г., Бекова М.В., Девяткин А.А. Различные стратегии использования секвенирования нового поколения для расшифровки случаев инфекционных заболеваний неясной этиологии. В: Молекулярная диагностика 2014. М., 2014, 2: 283-285.
2. Курильщиков А.М., Тикунова Н.В., Кабилов М.Р. Методы и объекты метагеномных исследований. Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. 2012, 10 (1): 191-201.
3. Жебрун А.Б. От молекулярной к геномной и метагеномной эпидемиологии. Журн. микробиол. 2014, 3: 91-100.
4. Albarino C.G., Foltzer M., Towner J.S. et al. Novel paramyxovirus associated with severe acute febrile disease, South Sudan and Uganda, 2012. Emerg. Infect. Dis. 2014, 20 (2): 211—216.
5. Alcaraz L.D., Belda-Ferre P., Cabrera-Rubio R. et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin. Microbiol. Infect. 2012, 18 (4): 54-57.
6. Belda-Ferre P., Alcaraz L. D., Cabrera-Rubio R. et al. The oral metagenome in health and disease. ISME. 2012, 6: 46-56.
7. Bogaert D., Keijser B., Huse S. et al. Variability and diversity of nasopharyngeal microbiota in children: a metagenomic analysis. PLoS One. 2011, 6 (2): 1-8.
8. Briese T., Paweska J.T., McMullan L. K. et al. Genetic detection and characterization of Lujo virus, a new hemorrhagic fever-associated arenavirus from Southern Africa. PLoS Pathog. 2009, 5 (5): 1-8.
9. Caporaso J. G., Kuczynski J., Stombaugh J. et al. QIIME Allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Meth. 2010, 7: 335-336.
10. Carola S., Rolf D. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77 (4): 1153-1161.
11. Charlson E.S., Chen J., Custers-Allen R. et al. Disordered microbial communities in the upper respiratory tract of cigarette smokers. PLoS ONE. 2010, 5 (12):1-10.
12. Chen I.M., Grechkin Y., Dubchak I. et al. IMG/M: a data management and analysis system for metagenomes. Nucleic Acids Res. 2008, 36 (Database issue): 534-538.
13. Cheung M.K., Lam W.Y., Fung WY.W. et al. Sputum microbiota in tuberculosis as revealed by 16S rRNA pyrosequencing. PLoS ONE. 2013, 8 (1): 1-8.
14. Cole J.R., Wang Q., Cardenas E. et al. The ribosomal database project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 2009, 37 (Database issue): 141-145.
15. Cox M.J., Cookson WO. C.M., Moffatt M.F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum. Mol. Genet. 2013, 22 (1): 88-94.
16. DeSantis T.Z., Hugenholtz P., Larsen N. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (7): 5069-5072.
17. Disz T., Akhter S., Cuevas D. et al. Accessing the SEED genome databases via Web services API: tools for programmers. BMC Bioinformatics. 2010, 11 (319): 1-11.
18. Fahlen A., Engstrand L., Baker B.S. et al. Comparison ofbacterial microbiota in skin biopsies from normal and psoriatic skin. Arch. Dermatol. Res. 2012, 304: 15-22.
19. Foulongne V., Sauvage V., Hebert C. et al. Human skin microbiota: high diversity of DNA
viruses identified on the human skin by high throughput sequencing. PLoS One. 2012, 7(6): 1-11.
20. Glass E.M., Wilkening J, Wilke A. et al. Using the metagenomics RAST server (MG-RAST) for analyzing shotgun metagenomes. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, 2010 (1): pdb prot5368.
21. Greninger A.L., Chen E.C., Sittler T. et al. A metagenomic analysis of pandemic influenza A (2009 H1N1) infection in patients from North America. PLoS One. 2010, 5 (10): 1-16.
22. Joseph S.J., Read T.D. Bacterial population genomics and infectious disease diagnostics. Trends Biotechnol. 2010, 28 (12): 611-618.
23. Huson D.H., Auch A.F., Qi J. et al. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Res. 2007, 17 (3): 377-386.
24. Kanehisa M., Goto S., Kawashima S. et al. The KEGG resource for deciphering the genome. Nucleic Acids Res. 2004, 32 (Database issue): 277-280.
25. Kim M., Park E., Roh S. W. et al. Diversity and abundance of single-stranded DNA viruses in human feces. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77 (22): 8062-8070.
26. Koren O., Spor A., Felin J. et al. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. PNAS. 2011, 108 (1): 4592-4598.
27. Li K., Bihan M., Yooseph S. Analyses of the microbial diversity across the human microbiome. PLoS ONE. 2012, 7 (6): 1-18.
28. Liu B., Faller L.L., Klitgord N. et al. Deep sequencing ofthe oral microbiome reveals signatures of periodontal disease. PLoS ONE. 2012, 7 (6): 1-16.
29. Loman N.J., Constantinidou C., Chan J.Z. M. et al. High-throughput bacterial genome sequencing: an embarrassment of choice, a world of opportunity. Nat. Rev. Microbiol. 2012, 10 (9): 599-606.
30. Loman N.J., Constantinidou C., Christner M. et al. A culture-independent sequence-based metagenomics approach to the investigation of an outbreak of Shiga-toxigenic Escherichia coli O104:H4. JAMA. 2013, 309 (14): 1502-1510.
31. Lysholm F., Wetterbom A., Lindau C. et al. Characterization ofthe viral microbiome in patients with severe lower respiratory tract infections, using metagenomic sequencing. PLoS ONE. 2012, 7 (2): 1-12.
32. Miller R.R., Montoya V., Gardy J.L. et al. Metagenomics for pathogen detection in public health. Genome Medicine. 2013, 5 (81): 1-14
33. Minot S., Sinha R., Chen J. et al. The human gut virome: inter-individual variation and dynamic response to diet. Genome Res. 2011, 21 (10): 1616-1625.
34. Mokili J.L., Dutilh B.E., Lim Y.W. et al. Identification of a novel human papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLoS One. 2013, 8 (3): 1-12.
35. Morgan X.C., Huttenhower C. Chapter 12: human microbiome analysis. PLOS Comp. Biol. 2012, 8 (12): 1-14.
36. Muller J., Szklarczyk D., Julien P. et al. eggNOG v2.0: extending the evolutionary genealogy ofgenes with enhanced non-supervised orthologous groups, species and functional annotations. Nucleic Acids Res. 2010, 38 (Database issue): 190-195.
37. Nakamura S., Maeda N., Miron I.M. et al. Metagenomic diagnosis of bacterial infections. Emerg. Infect. Dis. 2008, 14 (11): 1784-1786.
38. Nakamura S., Yang C., Sakon N. et al. Direct metagenomic detection of viral pathogens in nasal and fecal specimens using an unbiased high-throughput sequencing approach. PLoS One. 2009, 4 (1): 1-8.
39. Palacios G., Druce J., Du L. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 2008, 358 (10): 991-998.
40. Pareek C.S., Smoczynski R., Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. J. Appl. Genetics. 2011, 52 (4): 413-435.
41. Pruesse E., Quast C., Knittel K. et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 2007, 35 (21): 7188-7196.
42. Quan P.L., Wagner T.A., Briese T. et al. Astrovirus encephalitis in boy with X-linked agammaglobulinemia. Emerg. Infect. Dis. 2010, 16 (6): 918-925.
43. Ravel J., Gajer P., Abdo Z. et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. PNAS. 2011, 108 (1): 4680-4687.
44. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS. 1977, 74 (12): 5463-5467.
45. Schloss P.D., Westcott S.L., Ryabin T. et al. Introducing Mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75: 7537-7541.
46. Steyer A., Gutierrez-Aguire I., Kolenc M. et al. High similarity of novel orthoreovirus detected in a child hospitalized with acute gastroenteritis to mammalian orthoreoviruses found in bats in Europe. J. Clin. Microbiol. 2013, 51 (11): 3818-3825.
47. Sun S., Chen J., Li W et al. Community cyberinfrastructure for advanced microbial ecology research and analysis: the camera resource. Nucleic Acids Res. 2011, 39 (Database issue): 546-551.
48. Tatusov R.L., Fedorova N.D., Jackson J.D. et al. The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics. 2003, 4: 41.
49. The human microbiome project consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 2012, 486 (740): 207-214.
50. Thomas T., Gilbert J., Meyer F. Metagenomics — a guide from sampling to data analysis. Microbiol. Inform. Exp. 2012, 2 (3): 1-12
51. Turnbaugh P.J., Hamady M., Yatsunenko T. et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 2009, 457 (7228): 480-484.
52. Tyakht A.V., Kostryukova E.S., Popenko A.S. et al. Human gut microbiota community structures in urban and rural populations in Russia. Nat. Commun. 2013, 4 (2469): 1-9.
53. Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D. Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Clin. Chem. 2009, 55 (4): 641-658.
54. Wei X., Yan X., Zou D. et al. Abnormal fecal microbiota community and functions in patients with hepatitis B liver cirrhosisas revealed by a metagenomic approach. BMC Gastroenterol. 2013, 13 (175): 1-8.
55. Willner D., Furlan M., Haynes M. et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in cystic fibrosis and non-cystic fibrosis individuals. PLoS ONE. 2009, 4 (10): 1-12.
56. Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Teng J.L.L. et al. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin. Microbiol. Infect. 2008, 14: 908-934.
57. Xu B., Liu L., Huang X. et al. Metagenomic analysis of fever, thrombocytopenia and leuko-penia syndrome (FTLS) in Henan province, China: discovery of a new bunyavirus. PLoS Pathog. 2011, 7 (11): 1-10.
58. Yang J., Yang F., Ren L. et al. Unbiased parallel detection of viral pathogens in clinical samples by use of a metagenomic approach. J. Clin. Microbiol. 2011, 49 (10): 3463-3469.
Поступила 10.09.14
Контактная информация: Алексеева Анна Евгеньевна, к.б.н.,
603950, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71, р.т. (831)432-87-91
