CC BY
541
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 619: 615: 37. 012
Л. А. Неминущая, Т. А. Скотникова, Е. И. Титова, О. В. Провоторова,
Н. К. Еремец, И. В. Бобровская, З. А. Канарская
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ
СИНБИОТИКОВ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Ключевые слова. Биотехнология, пробиотик, пребиотик, синбиотик, белковая кормовая добавка, питательные среды, культивирование, готовая лекарственная форма.
Статья посвящена разработке типовых эффективных экономичных технологий получения препаратов микробиологической природы - пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки. С целью унификации процесса культивирования штаммов-продуцентов и повышения его эффективности в технологии изготовления препаратов для культивирования пробиотических бактерий, гриба и дрожжей-сахаромицетов использована универсальная питательная среда на основе ферментолизата отходов зерносырья.
Keywords. Biotechnology, probiotics, prebiotics, sinbiotic, an protein fodder additive, nutrient mediums, the cultivation, the ready
medicinal form.
Article is devoted working out typical effective the economic technologies of reception of drugs of the microbialogic nature - probiotics, prebiotics and an protein fodder additive. For the purpose of unification ofprocess of cultivation of strains-producers and increase of its efficacy in manufacturing techniques of drugs for cultivation probiotics bacteria, a mushroom andyeast-sacharomyces the universal nutrient medium on a basis fermentolisat a waste fodder-grain-wastes is used.
Решение актуальных проблем развития сельского хозяйства напрямую связано с переводом отрасли на современные агропромышленные технологии. Система модернизации АПК, комплексное техническое и технологическое перевооружение отрасли невозможны без построения цепочки «разработчик -производитель (поставщик) - потребитель», где «производитель (поставщик)» является ключевым звеном. Технологическое и техническое перевооружение отрасли дает существенную отдачу. Статистика показывает значительное снижение затрат, повышение производительности труда. Наукоемкие технологии играют ключевую роль в обеспечении населения качественной продукцией животноводства и растениеводства. Без ветеринарных препаратов, кормов и кормовых добавок, созданных на основе последних достижений науки, сложно добиться высокой конкурентоспособности на рынке [1].
Чтобы увеличить производство и защитить отечественного производителя, важно сфокусировать внимание на снижении себестоимости и улучшении качества продукции. Это возможно только при использовании конкурентоспособных технологий ее производства и переработки.
Главная задача всех отраслей сельского хозяйства, в том числе и животноводства, - повышение рентабельности, что предполагает увеличение объемов производства при снижении себестоимости продукции. Этого можно добиться только в том случае, если животные и птица обладают крепким здоровьем и устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Обеспечить резистентность и повысить продуктивность нельзя без полноценного правильного кормления и использованием
различных кормовых добавок и пробиотических препаратов [2]. Вещества и их комплексы, входящие в состав премиксов, обеспечивают, помимо питательной ценности, такие их свойства, как антиоксидант-ные, антибактериальные, антистрессовые, иммуномодулирующие, антипаразитарные, противовоспалительные, воздействие на переваривание корма или его абсорбцию непосредственно в тканях пищеварительного тракта, стимулирование секреции пищеварительных ферментов, ингибирование развития патогенной микрофлоры в кишечнике, защита кишечника при смене корма [3]. А в сочетании с пробиотиками такие добавки обладают еще и лечебнопрофилактическими свойствами.
Кормовые белковые продукты, получаемые на основе микробиологического синтеза, по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традиционным белковым кормам, таким как соевый шрот, мясокостная и рыбная мука и др. Биотехнологический способ получения обеспечивает их экологическую чистоту. Такие добавки могут достойно конкурировать с зарубежными аналогами. Все эти препараты возможно производить по унифицированным технологиям на гибких технологических линиях, которые могут быть тиражированы и размещены непосредственно в местах потребителя продукции - на агропредприятиях и птицводческих комплексах [4]. С помощью биотехнологий себестоимость единицы животноводческой продукции снижается минимум на треть.
Спектр и направленность использования биотехнологических продуктов в мире выглядит следующим образом: лекарственные и диагностические средства - 77 %, сельское хозяйство и ветеринария -
14 %, экология и промышленность - 8 остальное - 1. Это говорит о том, что наибольшее внимание концентрируется на создании новых эффективных средств профилактики, диагностики и лечения заболеваний животных и человека. Доля присутствующих на российском рынке отечественных биотехнологических фармацевтических препаратов в 7,4 раза ниже, чем зарубежных [5]. Развитие производства отечественных биотехнологических фармацевтических препаратов и научные исследования по их разработке является актуальным и характеризуется следующими тенденциями:
• ускорением процесса вывода нового продукта на рынок;
• усовершенствованиями, направленными на увеличение выхода продукта при производстве ЛС;
• ростом производственных мощностей;
• ростом производства как патентованных, так и дженериковых ЛС;
• возрастающей гибкостью производства, связанной с необходимостью быстро переходить на выпуск новых препаратов в ответ на запросы рынка;
• возрастанием роли науки, проявляющемся в движении от «знать как» к «знать почему»;
• развитием биотехнологии, одной из наиболее молодых и перспективных отраслей высокотехнологического производства ЛС, с которым многие эксперты связывают решение актуальных медикосоциальных проблем;
• возрастанием роли регулирующих органов.
В мировой практике получило широкое распространение использование кормовых белковых продуктов, полученных на основе микробиологического синтеза, которые по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традиционным белковым кормам, таким, как соевый шрот, мясокостная мука, рыбная мука и др. [6, 7].
Во ВНИТИБП накоплен большой опыт и научный потенциал для развития современных направлений промышленной биотехнологии, который стал основой разработанной в институте «Концепции регионального развития и научного обеспечения биологических производств средств повышения плодородия почв, защиты растений, увеличения продуктивности животных, экологической и продовольственной безопасности». Данная Концепция подразумевает разработку и внедрение в различных регионах страны унифицированных промышленных технологий и технологических линий на модульной основе с использованием современного оборудования и систем автоматизации. Такие производства будут экономически выгодными за счет:
1) расширения ассортимента и увеличения объема производства биопрепаратов, разработанных по новым технологиям;
2) повышения эффективности производства и снижения себестоимости продукции;
3) приближения производителя к потребителю продукции;
4) совершенствования координации научных исследований и сокращения сроков внедрения инновационных технологий.
В рамках реализации положений Концепции в институте научно обоснована концепция создания синбиотических комплексов «пробиотик + пребио-тик» и «пробиотики + белковая кормовая добавка». Разработаны новые препараты (пробиотики АВИ-ЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, пребиотик АВИСТИМ, белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ) и синбиотиче-ские комплексы на их основе АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ.
Новые препараты представляют собой:
- АВИЛАКТ-1К - пробиотик для птиц - бактериальный препарат, содержащий живые клетки молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus штамма 1К;
- АВИСУБТИЛ - пробиотик для птиц - бактериальный препарат, содержащий живые клетки Bacillus subtilis штамма B - 1948;
- АВИСТИМ - пребиотик для птиц - биологически активная добавка, состоящая из получаемой при культивировании высшего лечебного гриба Fusarium sambucinum шт. MKF 2001-3 культуральной жидкости, и содержащая в своем составе аминокислоты (включая незаменимые), микроэлементы и витамины (А, Е, Н и группы В);
- ЦЕРЕВЕТ - белковая кормовая (микробиологическая) добавка, содержащая сухую биомассу инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae diastaticus ВКПМ - у -1218.
Синбиотики:
- АВИЛАКТ-ФОРТЕ - комплекс пробиотика АВИЛАКТ-1К и пребиотика АВИСТИМ;
- ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ - комплекс пробиотиков АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ с белковой кормовой добавкой ЦЕРЕВЕТ.
Сложилось мнение, что технология производства пробиотиков не требует высокой культуры производства и доступна каждому, имеющему желание и оборудование. Однако это далеко не так. Пробиотики -одна из самых наукоемких областей ветеринарной фармации, включающая селекцию штаммов, технологию культивирования и сушки. Поэтому фирма, производящая пробиотики, должна иметь свою историю на рынке. Как правило, такая фирма осуществляет научное сопровождение своей продукции, имеет широкий ассортимент продукции, поддерживает связь с потребителями, проводит учет эффективности применения пробиотиков [8].
Производство биологически активных добавок (БАД) с использованием новых видов микроорганизмов-пробиотиков, продуцируемых ими биологически активных веществ и других компонентов опирается на знание биотехнологии, в основе которой лежат микробиологические процессы [4].
Кроме подбора штаммов-продуцентов син-биотиков большое значение имеет разработка эффективных малозатратных технологий получения этих препаратов. Основным требованием к технологии получения синбиотиков является использование процессов и оборудования, позволяющих обеспечить ак-
тивность (высокое накопление) и стабильность препаратов. Это достигается путем подбора питательных сред, разработкой управляемых методов глубинного культивирования, разработки способов и режимов стабилизации, подбора стабилизаторов и наполнителей. Качественные и количественные методы контроля препарата должны полностью отражать характеристики его безопасности и качества. Только в этом случае препарат может быть конкурентоспособным как на отечественном, так и на мировом рынке пробиотиков [8].
Технологическая схема производства препаратов микробиологической природы включает основные стадии, обеспечивающие их качество:
- приготовление и контроль питательных сред;
- приготовление и контроль посевного материала;
- культивирование микроорганизмов;
- получение готовой формы препарата;
- упаковка, маркирование и хранение.
Разрабатываемые препараты имеют микробиологическую природу, поэтому процесс их изготовления является типовым для микробиологических производств и подчиняется общей технологической схеме, которая складывается из подготовительных и вспомогательных работ, а также основных технологических процессов. Подготовительные работы включали подготовку воздуха, помещений, оборудования, одежды, посуды, инструментов, материалов для укупоривания (пробки, колпачки) и этикетирования (этикетки).
Вспомогательные работы - получение посевной серии, приготовление ростовых и селективных сред, вспомогательных растворов. Основной технологический процесс состоял из этапов приготовления питательной среды, культивирования бактерий в реакторе, фасования, сублимационного высушивания (в случае получения сухой формы), укупоривания и этикетирования препарата. Качество препарата в процессе производства обеспечивали системой технологического контроля, качество готового контролировали по показателям, определенным при изготовлении посевных серий. Для разработки схемы контроля определяли контрольные точки, контролируемые в этих точках показатели, их допустимые интервалы и методы определения.
Для минимизации риска загрязнения продукта посторонними микроорганизмами, механическими частицами и химическими веществами производственные помещения охарактеризованы по классам чистоты в зависимости от характера технологических процессов (см. табл. 1).
Определены требования к качеству исходных материалов и полупродуктов, безопасности производства и охране окружающей среды.
С целью унификации процесса культивирования штаммов-продуцентов и повышения его эффективности в технологии изготовления входящих в состав синбиотиков препаратов (пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки) для культивирования пробионтных бактерий, гриба и дрожжей-сахаромицетов использована универсальная питательная среда на основе ферментолизата отходов зер-носырья.
Таблица 1 - Перечень технологических операций, осуществляемых в помещениях разных классов чистоты
Класс чис- тоты* Содержание микроорганизмов (КОЕ/м3 воздуха), не более Технологическая операция
100(В) 5 Работа со стерильным материалом. Культивирование. Сборка стерилизующих фильтров и съемных узлов оборудования. Отбор проб стерильного продукта. Стерилизующая фильтрация растворов. Сублимационное высушивание. Укупоривание. Хранение стерильных материалов первичной упаковки. Выгрузка после стерилизации и хранение стерильной технологической одежды, питательных сред, посуды и инструментов.
С 100 Приготовление и префильт-рация растворов. Разборка и мойка стерилизующих фильтров. Стерилизующая фильтрация дезинфиц. растворов. Подготовка одежды, инструментов и посуды к стерилизации.
Д 200-500 Этикетирование, упаковка готовой продукции. Хранение на складе. Хранение и подача этикеток, упаковочных и вспомогательных материалов. Приготовление и префильт-рация дезинфицирующих растворов.
* Классы чистоты определены в соответствии с ГОСТ
Р 52249-2009.
В качестве сырья используются зерновые отходы, основой которых являются нестандартное зерно злаковых и крупяных культур, пшеничные и ржаные отруби, дерть и др. [9].
Для получения ферментолизата смесь измельченной ржи и пшеничных отрубей (в соотношении 30 : 70) разбавляли водой (гидромодуль 1 : 6 или 1 : 8) и подвергали последовательно: термообработке; обработке в роторно-пульсационном аппарате при повышенной температуре; ферментолизу зерновой пульпы протеолитическими ферментами при рН 5,0 - ,2. Среду стерилизовали при 1 атм 40 мин. Характеристика среды
после стерилизации: редуцирующих веществ РВ - 2,5 -3,0 %; ОД - 0,9 -1,0 г/дм3; Р2О5 - 0,4 - 0,5 г/дм3.
На рис. 1 - 4 представлены блок-схемы получения препаратов, входящих в состав синбиотических комплексов и схема получения препаратов с использованием универсальной питательной среды представлена на рисунке 4.
Комплекс с:
- пребиотиком АВИСТИМ;
- пробиотиком АВИСУБТИЛ и кормовой добавкой.
Выращивание посевного материала в термостате
Культивирование молочнокислых бактерий в биореакторе (У=300л)
Высушивание биомассы пробиотика
Рис. 1 - Блок-схема получения пробиотика АВИ-ЛАКТ-1К
Комплекс
с пробиотиком АВИЛАКТ-1К и кормовой добавкой ЦЕРЕВЕТ.
Выращивание посевного материала в колбах на качалке
Культивирование бактерий в биореакторе (V=300)
Высушивание биомассы пробиотика
Рис. 2 - Блок-схема получения пробиотика АВИСУБТИЛ
зернового
субстрата
I
Подготовка Ферментолиз • Культивиро- Обезвожива Плазмолиз Сушка
Подготовка
Засевной
Биомассы
Комплекс с пребиоти-ками АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ
II Мицелий
КЖ
Выращивание Культивирование мицелия в кол- в биореакторе бах на качалке
Отделение биомассы мицелия от культуральной жидкости (КЖ)
Сушка мицелия
Упаковка и использование как БАД
Комплекс с пребиотиком АВИЛ АКТ -1К
Рис. 4 - Блок-схема основных стадий производства:
I - Кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ
II - Пребиотика АВИСТИМ и мицелия гриба Ета-гіит ЗатЬиеіпит
В результате проведенных исследований показана возможность использования среды на основе ферментолизата отходов зерносырья для культивирования бактерий пробиотиков, гриба и дрожжей.
Рис. 3 - Схема получения препаратов с использованием универсальной питательной среды
Изготовление готовых форм препаратов. Для пробиотиков разработано две готовые формы - жидкая и сухая. После культивирования и контроля качества продукт в первом случае фасовали в первичную тару и укупоривали, во втором - фасовали в кассеты и подвергали сублимационному высушиванию по режиму, разработанному для питательной среды ФЗ. Количество живых бактерий L. acidophilus и B. subtilis в сухом материале составляло не менее 3 х 109 КОЕ/г и 5 х 1010 КОЕ/г соответственно. Жидкий препарат расфасовывали в стеклянную или полиэтиленовую тару, предназначенную для лекарственных средств и пищевых продуктов. Сухой препарат расфасовывали в полимерные пакеты.
Для получения готовой формы пребиотика АВИСТИМ культуральную жидкость отделяли от биомассы гриба фильтрацией на нутч-фильтрах, подвергали стерилизующей фильтрации и расфасовывали в стеклянную или полиэтиленовую тару.
При получении готовой формы препарат ЦЕРЕВЕТ биомассу дрожжей подвергали плазмолизу, контролировали на отсутствие живых клеток и сушили на распылительной сушилке типа Niro Atomizer. В сухом продукте содержание сырого протеина составляло 40 - 45 %, истинного белка - 30 - 38 %. Препарат фасовали в полимерные пакеты.
В данной работе установлена возможность применения двух форм пробиотика - сухой и жидкой, выбор которой определяет потребитель. Однако использование сублимационного высушивания имеет ряд недостатков (большие энергозатраты, неудобство фасования препарата в случае крупных партий, высокая гидрофильность и др.) и может быть заменено другими видами сушки (в кипящем слое, конвекционный и др.), которые лишены названных недостатков и позволяют получить более современные формы препарата, например, путем иммобилизации на гранулах корма или сорбентах [9, 10].
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана технология изготовления препаратов, входящих в состав синбиотических комплексов (режимы культивирования препаратов с использованием питательных сред на основе молочной сыворотки и отходов зерносырья; параметры сублимационного высушивания); проведены доклинические исследования их безопасности и специфической активности; разработаны способы применения в сухой (смешивание с кормом) и жидкой формах (выпаивание и нанесение на гранулы корма); оценена лечебно-профилактическая и экономическая эффективность при откорме бройлеров кроссов «Конкурент», «Кобб-500», «Кобб - авиан-48». Показано, что препараты не токсичны (для мышей и SPF-эмбрионов кур), безвредны (для цыплят суточного возраста), не обладает раздражающим действием на слизистые оболочки (по результатам модифицированного ХЕТ-КАМ теста). Применение синбиотиков способствует: повышению зоотехнических показателей (увеличение привесов на 6,9 - 10,2 %, сохранности птицы на 2,5 -3,8 %, уменьшение затрат корма на 3,8 - 6,1 %); улучшению качества мяса (уменьшение содержания жира в мясе) и увеличению доли съедобной части тушки (выхода мясных частей); повышению эффективности вакцинации птицы против ньюкаслской болезни при наличии в хозяйстве коли-инфекции. Использование комплексов способствует повышению резистентности организма птицы, переболевшей колибактериозом. Пробиотики обладают выраженной антагонистической активностью (in vitro u in vivo) в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (E. coli u Salmonella) и характеризуется умеренной чувствительностью к антибиотикам: гентамицину, офлоксацину, ципрофлоксацину, энтрофлону, флаво-мицину, линкомицину и высокой чувствительностью к: кламоксилу, левомицетину, тетрациклину, цефазо-лину, ампициллину и рифампицину. Экономический эффект от применения синбиотических комплексов АВИЛАКТ- ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ получен за счет повышения сохранности поголовья, прироста живой массы и снижения затрат корма и составил в расчете на 1000 голов 1370,3 руб. и 7862 руб. соответственно. Разработки защищены патентами РФ.
В настоящее время проводятся испытания синбиотического комплекса ЛАКТОСУБТИЛ ФОРТЕ на жеребых кобылах, жеребятах при отъеме в условиях КФХ «Гришин» Нижегородской области, поселок Починки. Эффективность оценивается по различным клиническим признакам, биохимическим и гема-
тологическим показателям крови. Получены положительные результаты в динамике состояния животных после применения препарата.
Синбиотический комплекс ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ для промышленного птицеводства и технология его изготовления отмечены Россельхозакадемией в числе лучших завершенных научных разработок 2010 года.
Литература
1. Фисинин, В.И. Обращение к специалистам сельского хозяйства / В.И. Фисинин // Бизнес Партнер. - М., 2009. -С. 3 - 4.
2. Неминущая, Л.А. Синбиотики - белковый кормовой продукт 21 века / Л.А.Неминущая, Г.И. Воробьева, Э.Ф. Токарик, В.И. Еремец, И.Л. Беро, А.Я. Самуйленко: в сб. мат-лов международн. научно-практич. конф., посв. 40-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2009. - С. 489 - 497.
3. Рымарева, Л.В. Дрожжи кормовые из зерновой барды -полноценный белково-витаминный корм для сельскохозяйственных животных и птицы / Л.В. Рымарева, Т.И. Ло-занская, Н.М. Худякова. // Ценовик. - Август, 2008. - С.14
- 20.
4. Самуйленко, А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов / А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан - М: Россельхозакадемия.- Т 1.- Т 2.- М.: РАСХН, 2000.-781 с.
5. Верстакова, О.Л. Доклиническая оценка лекарственных средств, полученных биотехнологическими методами / О.Л. Верстакова, В.И. Масычева // Ведомости НЦ ЭСМП. - 2006. -№2. - С. 13 - 20.
6. Римарева, Л.В. Перспективные биотехнологии в производстве биокорректоров пищи, БАД и кормов / Л. В. Рима-рева, Н.С. Погоржельская // Биотехнология: вода и пищевые продукты: мат. научного и практич. конгресса. - М., 2008.- С. 367-268.
7. Хусаинов, И.А. Получение мальтозосодержащего кормового продукта пребиотического действия ферментирова-нием зерна ржи / И.А. Хусаинов, А.В. Канарский, З.А. Канарская, М.А. Поливанов // Вестник Казан. технол. унта. - 2011. - Т. 14, №3. - С. 174 - 179.
8. Панин, А.Н. Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробиотических препаратов / Панин А.Н., Малик Н.И., Авылов Ч.К. // Науч. основы пр-ва вет. биол. препаратов: сб. науч. тр.- Щелково, 2000. - С. 343 - 345.
9. Сушкова, В.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества / Сушкова В.И., Воробьева Г.И. - М.: ДеЛи принт, 2008. - 216 с.
10. Хусаинов, И.А. Разработка способа сушки кормового продукта пребиотического действия / И.А. Хусаинов, А.В. Канарский, З.А. Канарская, М.А. Поливанов // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2011. - Т. 14, - №9. - С. 252 - 256.
© Л. А. Неминущая - канд. биол. наук, доц., зав. лаб. обеспечения качества фармпрепаратов и кормовых добавок, упі[email protected]; Т. А. Скотникова - д-р биол. наук, доц., зав. лаб. обеспечения качества вакцин. [email protected]; Е. И. Титова - асп. ВНИТИБП, [email protected]; О. В. Провоторова - м.н.с., лаб. обеспечения качества вакцин, [email protected],; Н. К. Еремец - канд. биолог. наук, доцент, зав. отделом обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии и животноводства, [email protected].; И. В. Бобровская - канд. биолог. наук, зав. лаб. технологических методов контроля и доклинических испытаний, [email protected]; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доцент кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ, [email protected].
