CC BY
6
SCIENCE TIME
ПЕРСПЕКТИВНОСТЬ КИШЕЧНЫХ СТРЕПТОКОККОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ И МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ С САНОГЕННЫМ СТАТУСОМ
Тимошко Мария Андреевна, Богдан Виктория Константиновна, Институт физиологии и санокреатологии Министерства культуры, образования и исследований Республики Молдова, Кишинев, Республика Молдова
E-mail: [email protected]
Аннотация. Работа посвящена вопросам определения перспективности существующих и вновь предлагаемых штаммов кишечных микроорганизмов для производства пищевых продуктов и препаратов пробиотического действия.
Ключевые слова: стрептококки, штаммы, препараты, саногенный статус.
Введение
Ранние исследования Института физиологии и санокреатологии АН РМ показали, что микробиоценоз пищеварительного тракта детей 1-16 лет включает и стрептококков, и после идентификации оказалось, что они принадлежат к семейству Streptococcaceae и трём родам (Streptococcus, Lactococcus и Enterococcus) [1-4]. Обращено внимание на то, что в кишечнике стрептококки указанных родов характеризовались определенным большинством для определённых возрастных групп детей. В частности, в пищеварительном тракте детей раннего возраста (1-3 года) в большем количестве были обнаружены бактерии рода Lactococcus, а после 5-ти летнего возраста - Enterococcus. У всех исследуемых детей среднее количественное положение занимали микроорганизмы рода Streptococcus. Одновременно установлено благоприятное действие на деятельность организма со стороны бактерий указанных родов, потому что они способствовали лучшему пищеварению, профилакти^, лечению различных патологий пищеварительного тракта, а также поддержанию оптимального состояния здоровья [5-9].
Учитывая тот факт, что ряд стрептококков в определенных условиях проявляют патогенные свойства, т.е. относятся к условно-патогенной категории бактерий, то ряд авторов обращают внимание на то, что клинические культуры энтерококков в ряде случаев несли гены патогенности и не являются родственными штаммам, входящим в состав микробных препаратов пробиотического действия [10].
I
»
55
1 SCIENCE TIME 1
Большинство исследователей показывают, что кишечная микрофлора включает бактерии, не только перечисленных родов, но и других (на примере Bifidobacterium, Lactobacillus и др.), которые широко применяются в производстве пробиотических микробных препаратов. Применение последних обосновали мнение о том, чтобы считать их лучшими фармакологическими средствами профилактического и терапевтического действия при различных расстройствах кишечника, а также для поддержания оптимального состояния микробиоценоза пищеварительного тракта [11-17].
Следует отметить, что Институтом физиологии и санокреатологии АН РМ также показано, что после разработки им впервые научных и практических основ санокреатологии возникла целесообразность производства и пищевых продуктов с саногенным статусом. Особенно это касается кисломолочных продуктов [18]. Подтверждением является то, что в указанном институте доказана роль отдельных представителей микрофлоры кишечника в поддержании здоровья организма [19]. Однако известно, что селекция производственных штаммов микроорганизмы требует специфический подход, особенно, учёт производственных условий и роли предлагаемых представителей кишечной микрофлоры для здоровья организма [20, 21].
Вышесказанное обосновывает необходимость срочного определения перспективности существующих и вновь предлагаемых штаммов кишечных микроорганизмов для производства пищевых продуктов и препаратов пробиотического действия. В этой связи и цель настоящих исследований состоит в выявлении перспективности вновь выделенных штаммов кишечных стрептококков для будущего производства пищевых продуктов (на примере кисломолочных) и микробных препаратов с саногенным статусом.
Материалы и методы исследований
В качестве материала для исследований послужило содержимое кишечника (прямой кишки) людей, а также суточные культуры микроорганизмов родов Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium и Lactobacillus.
Первоначально перед нами стояла задача провести работу по отбору активных штаммов стрептококков, специфических для пищеварительного тракта здорового человека. Дальнейшая работа проводилась в несколько этапов. Началом настоящих исследований послужило выделение чистых культур стрептококков из содержимого прямой кишки клинически здоровых людей разного возраста (20-60 лет). Второй этап включал идентификацию, выделенных штаммов до родовой принадлежности. Далее потребовалось определить у них уровень санокреатогенного потенциала, а затем их совместимость с представителями родов (Bifidobacterium и Lactobacillus). На основе полученных результатов определялась перспективность включения, штаммов кишечных стрептококков в состав микробных композиций или заквасок, предназначенных для производства кисломолочных продуктов и микробных препаратов с саногеннным статусом.
1 SCIENCE TIME 1
Результаты исследований
Из содержимого кишечника клинически здоровых людей выделены 358 штамма бактерий в форме стрептококков, которые после идентификации отнесены к двум семействам (Streptococcaceae и Enterobacteiaceae) трём родам (Streptococcus, Lactococcus и Enterococcus).
Таблица 1
Характеристика стрептококков, выделенных из кишечника здоровых людей разного возраста
Возраст, лет Общее количество, изученных штаммов соответственно типу питания Принадлежность после идентификации Количество отобранных штаммов соответственно типу питания Занимаемая доля соответственно типу питания, %
Семейство Род
1 2 1 2 1 2
20 23 23 Streptococcaceae Streptococcus, 5 9 21,73 39,13
Lactococcus 4 11 17,39 47,82
Enterobacteiaceae Enterococcus 14 3 60,86 13,04
25 20 20 Streptococcaceae Streptococcus, 5 7 25,00 35,00
Lactococcus 3 10 15,00 50,00
Enterobacteiaceae Enterococcus 12 3 60,00 15,00
30 21 21 Streptococcaceae Streptococcus, 4 8 19,04 38,09
Lactococcus 3 10 14,28 47,61
Enterobacteiaceae Enterococcus 14 3 66,66 14,28
35 20 20 Streptococcaceae Streptococcus, 5 8 25,00 40,00
Lactococcus 2 10 10,00 50,00
Enterobacteiaceae Enterococcus 13 2 65,00 10,00
40 17 17 Streptococcaceae Streptococcus, 4 6 23,52 35,29
Lactococcus 2 9 11,76 52,94
Enterobacteiaceae Enterococcus 11 2 64,70 11,76
45 20 20 Streptococcaceae Streptococcus, 5 9 25,00 45,00
Lactococcus 2 8 10,00 40,00
Enterobacteiaceae Enterococcus 13 3 65,00 15,00
50 18 18 Streptococcaceae Streptococcus, 6 6 33,33 33,33
Lactococcus 0 0 0 0
Enterobacteiaceae Enterococcus 12 12 66,66 55,55
55 19 19 Streptococcaceae Streptococcus, 6 6 21,05 21,05
Lactococcus 0 0 0 0
Enterobacteiaceae Enterococcus 13 13 68,42 63,15
60 21 21 Streptococcaceae Streptococcus 7 7 33,33 33,33
Lactococcus 0 0 0 0
Enterobacteiaceae Enterococcus 14 14 76,19 66,66
Примечание: Тип питания: 1 - смешанный; 2 - молочный.
1 SCIENCE TIME 1
Анализ данных таблицы 1 выявил, что штаммы стрептококков, которые были выделены из содержимого кишечника людей, дающие предпочтение молочному типу питания, в основном относились к родам Streptococcus и Lactococcus, а смешанному - к роду Enterococcus. Это подтверждено занимаемой долей каждого из них. Такая закономерность наблюдается до 45 лет, а у людей после 50-летнего возраста бактерии рода Lactococcus не высевались и в большем количестве обнаруживались представители рода Enterococcus.
Весьма важно отметить, что у здоровых людей после пятидесяти лет в численности кишечных стрептококков разница не была установлена. Следовательно, для производственных целей допускается выделить чистые культуры микроорганизмов лишь от людей в возрасте до 45 лет и при условии, что они потребляли молочный тип питания.
Следующим этапом исследований являлся определение у отобранных штаммов санокреатогенного потенциала на основе их показателей антагонистической активности и способности к адгезии.
Полученные результаты таких исследований отражены в таблице 2.
Таблица 2
Показатели антагонистической активности и способности к адгезии у штаммов микроорганизмов, выделенных из кишечника людей разного возраста
Род бактерий Число, изученных штаммов Показатель подавления роста тест-микробов, % Количество микробных клеток прикрепленных к 25 эритроцитам крови человека Показатель адгезии, к.е.
Escherichia Salmonella
Streptococcus 69 73,52±3,39 70,81±3,62 106,25-113,75 4,25-4,55
Lactococcus 83 70,25 ±2,92 68,57±3,81 95,75-105,50 3,83-4,22
Enterococcus 28 77,41±3,58 75,49±3,36 121,25-130,00 4,85-5,20
Её анализ показал, что все изученные штаммы стрептококков обладали высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям кишечных инфекций, принадлежащих к родам Escherichia и Salmonella, однако самым высоким этот показатель отмечен у штаммов рода Enterococcus. Подобные данные получены и относительно их способности к адгезии. Подтверждением сказанному являются показатели подавления роста тест-микробов, а также адгезии, которые находились в пределах 68,57 - 77,41 % и 3,83 - 5,20 к.е. Следовательно, они были высокими.
Таким образом, по результатам двух этапов отобраны по 5 штаммов из каждого рода кишечных стрептококков (Streptococcus, Lactococcus и Enterococcus), которые рекомендуются для включения в состав микробных композиций с представителями родов Bifidobacterium и Lactobacillus, имеющие палочковидную форму.
По этому принципу в дальнейшем определялась совместимость между выделенными, изученными и отобранными штаммами стрептококков с пятью
1 SCIENCE TIME 1
видами бифидобактерий и шестью видами лактобацилл.
Полученные результаты приведены в таблице 3 и доказывают, что все изучаемые штаммы стрептококков, отобранные для дальнейшего использования в производственной практике, при культивировании с микроорганизмами в палочковидной форме (родов Bifidobacterium и Lactobacillus) оказались совместимыми. Это подтверждено разницей результатов исследований в конце опытов по сравнению с их началом, которая в случае подавления роста у стрептококков - находилась в пределах от -0,35 до -2,49%, у бифидобактерий - в -1,10 и у лактобацилл - в -0,41 %, а в случае стимулирования роста соответственно от +0,47 до +3,87; от +0,61 до +3,43 и от +2,10 до +4,73 %.
Таблица 3
Количественные показатели стрептококков, выделенных из кишечника людей разного возраста и представителей родов Bifidobacterium и Lactobacillus при совместном их культивировании
Серии опы- Виды бактерий, Количество микробных клеток в 1 мл взвеси микроорганизмов, десятичные логарифмы (лог),
тов исполь- соответственно времени определения Разница, %
зуемых В начале испытания В конце
в качестве испытания
теста 1 2 1 2 1 2
1 8,46±0,15 9,79±0,20 8,55±0,21 9,85±0,18 +1,06 +0,61
2 8,41±0,25 9,98±0,22 8,20±0,20 9,87±0,15 -2,49 -1,10
I 3 8,53±0,20 9,90±0,21 8,50±0,23 9,95±0,17 -0,35 +0,50
4 8,38±0,18 9,81±0,30 8,60±0,25 10,07±0,20 +2,62 +2,65
5 8,07±0,21 9,89±0,15 8,54±0,20 10,20±0,18 +5,82 +3,13
6 8,36±0,25 7,74±0,18 8,30±0,22 7,98±0,21 -0,71 +3,10
7 8,30±0,15 7,30±0,28 8,17±0,25 7,62±0,22 -1,56 +4,38
8 8,43±0,35 7,49±0,21 8,53±0,22 7,81±0,25 +1,18 +4,27
II 9 8,23±0,26 7,23±0,15 8,04±0,25 7,20±0,21 -2,30 -0,41
10 8,49±0,18 7,80±0,20 8,53±0,21 8,07±0,15 +0,47 +3,46
11 8,60±0,25 7,85±0,18 8,50±0,20 8,11±0,21 -1,16 +3,31
1 8,88±0,18 9,70±0,20 9,17±0,15 9,98±0,21 +3,26 +2,88
2 9,17±0,20 9,49±0,21 9,36±0,18 8,69±0,20 +2,07 +2,10
III 3 8,94±0,21 9,69±0,18 9,07±0,20 9,80±0,25 +1,45 +2,16
4 8,76±0,15 9,62±0,209, 8,96±0,21 9,85±0,23 +2,28 +2,39
5 8,98±0,22 53±0,16 9,13±0,18 9,79±0,21 +1,67 +2,72
6 8,77±0,15 7,60±0,18 8,86±0,15 7,96±0,16 +1.02 +4,73
7 9,04±0,20 7,41±0,19 9,20±0,18 7,73±0,17 +1,76 +4,31
8 8,82±0,25 7,77±0,21 9,04±0,22 8,07±0,19 +2,49 +3,86
IV 9 8,66±0,21 7,36±0,20 8,90±0,19 7,62±0,18 +2,77 +3,53
10 8,63±0,15 7,86±0,18 8,96±0,15 8,13±0,15 +3,87 +3,43
11 8,50±0,20 7,90±0,21 8,79±0,18 8,20±0,20 +2,36 +3,79
1 8,82±0,15 9,78±0,20 9,07±0,15 10,04±0,18 +2,83 +2,96
2 8,96±0,18 9,86±0,22 9,17±0,16 10,13±0,20 +2,34 +2,73
3 9,07±0,25 9,91±0,23 9,32±0,21 10,20±0,21 +2,45 +2,82
V 4 8,59±0,20 9,80±0,21 8,85±0,18 10,11±0,19 +3,02 +3,16
5 8,78±0,22 9,89±0,20 9,20±0,20 10,23±0,18 +3,60 +3,43
6 8,80±0,21 7,80±0,18 9,13±0,19 8,13±0,16 +3,75 +4,23
7 9,11±0,25 7,79±0,23 9,38±0,22 7,97±0,21 +2,96 +2,31
8 8,90±0,18 7,96±0,20 9,20±0,16 8,23±0,15 +3,37 +3,56
VI 9 8,41±0,19 8,04±0,22 8,68±0,17 8,30±0,20 +3,21 +3,23
10 8,60±0,15 7,94±0,18 8,92±0,15 8,20±0,16 +3,72 +3,27
11 8,46±0,20 7,84±0,19 8,66±0,18 8,11±0,17 +2,36 +3,44
1 SCIENCE TIME 1
Примечание: Серии опытов: I, III и V посев осуществлялся совместно с бактериями рода Bifidobacterium; II, IV и VI - с бактериями рода Lactobacillus. Изученные штаммы стрептококков относились к трём видам ( соответственно в сериях I и II - к Streptococcus thermophilus; III и IV - к Lactococcus lactis; а V и VI - к Enterococcus faecium.
Виды бактерий, используемых как тест-микробы: 1 - B. bifidum; 2 - B. infantis; 3 - B. longum; 4 - B. breve; 5 - B. adolescentis; 6. - L. acidophilus; 7 - L. helveticus; 8. - L.casei; 9 - L.coryniformis; 10. - L. plantarum; 11. - L. fermentum. В начале и конце испытания:
Количество микробных клеток в начале и конце испытания, а также разница конечных данных по сравнению с начальными: 1. - стрептококков; 2. -тест-микробoв.
Таким образом, на основании литературных данных и результатов настоящих исследований можно высказать положение о том, что перспективность штаммов микроорганизмов для производства пищевых продуктов (на примере кисломолочных) и микробных препаратов с саногенным статусом значительно увеличивается по мере проявления с их стороны полезных для организма свойств. К таковым следует отнести: 1) наличие у них индекса размножения, который должен быть не менее 1:30, а также 2) санокреатогенного потенциала, включающего коэффициента подавления роста эшерихий и сальмонелл - не менее 50% и показателя их способности к адгезии - не менее 3,0. Одновременно следует учитывать, что представители семейства Enterococcaceae относятся к условно-патогенной категории микрофлоры и при селекции производственных штаммов, относящихся к такому семейству, первостепенной задачей должно быть определение такого свойства как отсутствие у них генов патогенности (3). Учет перечисленных трёх полезных для организма свойств подтверждают перспективность использования отобранных штаммов бактерий для создания микробных композиций или заквасок, предназначенных для производства пищевых продуктов и микробных препаратов с саногенным статусом (на примере кисломолочных продуктов и пробиотиков).
Литература:
1. Timo§co Maria, Bogdan Victoria, Velciu Aliona. Semnificatia unor genuri de microorganisme ale familiei Streptococcaceae in activitatea vitala a macroorganismului // Buletin de perinatologie. - 2013. - nr.1(57). - pp. 8- 11.
2. Timo§co Maria, Florea Natalia Aprecierea rapida a prezentei dereglarilor sanatatii sistemului digestiv prin determinarea nivelului cantitativ al unor reprezentanti ai microflorei intestinale // Sanatate Publica §i Management in Medicina. - 2013. - 3 (48). - pp. 233-234.
3. Velciu A., Timo§co M. Starea sanatatii §i microbiocenozei intestinale la copii de varsta timpurie postnatala in dependenta de modul de alimentare. // Buletin de perinatologie. - 2013. - nr.6 (57).
»
60
1 SCIENCE TIME 1
4. Timo§co Maria, Bogdan Victoria, Florea Natalia Impactul unor agenti microbieni din familia Streptococcaceae in activitatea vitala a organismului uman §i animal. // Curierul medical. - 2014. - vol.57 (nr.1). - pp.73-77.
5. Bergey's Manual of Sistematic Bacteriology. B:_Brenner, D.J., Krieg, N.R., Staley, J.T. & Garrity, G.M. (eds., 2005). 2nd ed., vol. 2, parts A, B and C, Springer-Verlag, New York, NY.
6. Кишечные бактерии, пробиотики и перспективы их применения для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта [Электронный ресурс]. - URL: https:// medi.ru/info/2994 (дата обращения: 17.08.2018)
7. Timo§co Mara, Velciu Aliona, Bogdan Victoria. Reprezentanti ai microbiocenozei intestinale §i starea sanatatii organismuluI // Buletin de perinatologie. - 2014. - nr.3 (63).- pp. 25-28.
8. Timo§co Maria, Bogdan Victoria, Velciu Aliona. Semnificatia unor genuri de microorganisme ale familiei streptococcaceae in activitatea vitala a macroorganismului // Buletin de perinatologie. - 2013. - nr.1 (57). - pp. 8- 11.
9. Timo§co Maria, Velciu Aliona , Bogdan Victoria. Starea bacteriocenozei intestinale ca factor de semnalizare a dereglarilor in sanatate. Buletin de perinatologie. - 2015.-nr.3. - pp.54-59.
10. Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И. и др. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 2008.
- № 5. - С. 83-87.
11. Ботина С.Г., Климина К.М., Коробан Н.В. и др. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus // Генетика.
- 2010. - Т. 46. - № 11. - С. 1485-1492.
12. Ботина С.Г., Полуэктова Е.У., Глазова А.А. и др. Характеристика устойчивости к антибиотика потенциальных пробиотических, бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы человека // Микробиология.
- 2011. - Т. 80. - № 2. - С. 175-183.
13. Нетребенко О.К. Обзор новых статей и материалов по механизмам действия и роли пробиотиков у детей (2007-2008 г.) // Педиатрия. - 2009. - № 87 (2). - С. 130-135.
14. Shah, N.P., Da Cruz, A.G., Faria J.A.F. Probiotic and prebiotic Foods: Technology, Stability and Benefits to Human Health. New York. - 2013. - 545 p.
15. Timo§co Maria, Florea Natalia Aprecierea rapida a prezentei dereglarilor sanatatii sistemului digestiv prin determinarea nivelului cantitativ al unor reprezentanti ai microflorei intestinale // Sanatate Publica §i Management in Medicina. - 2013. - 3 (48). - pp. 233-234.
16. Timo§co Maria, Bogdan Victoria, Florea Natalia Impactul unor agenti microbieni din familia Streptococcaceae in activitatea vitala a organismului uman §i animal // Curierul medical. - 2014. - Vol. 57 (nr.1). - pp. 73-77.
1 SCIENCE TIME 1
17. Фурдуй Ф.И., Чокинэ В.К., Фурдуй В.Ф. и др. Трактат о научных и практических основах санокреатологии. Том 1. Проблема здоровья. Санокреатология. Потребность общества в её развитии. Типогр. АН РМ, 2016, 228 с. ISBN 978-9975-62-400-8.
18. Timo§co Mara, Velciu Aliona, Bogdan Victoria. Reprezentan^i ai microbiocenozei intestinale §i starea sänätä^ii organismuluI // Buletin de Perinatologie. - 2014. - nr. 3 (63). - pp. 25-28.
19. Евстигнеева Т.Н. Селекция промышленных штаммов микроорганизмов: учеб. -метод. пособие. Санкт-Петербург: СПб.: Университет ИТМО, 2017. 59 с.
20. Тимошко М.А., Велчу А.И., Богдан И.К. Санокреатогенный потенциал отдельных родов микроорганизмов кишечника // Science Time. - 2018. - № 2. - С. 68-75.
21. Тимошко М.А., Струтинский Ф.А, Богдан В.К., Федаш В.В. Микробиота кишечника и ее роль в поддержании оптимального уровня здоровья организма. В сборнике научных публикаций «ВЕЛЕС»: материалы международной конференции. Киев, 2016. - С. 33-37.
