CC BY
52
Перспектива лечения эпилепсии новым классом антиконвульсантов, содержащих фармакофор глицина
Шилов Г.Н.1, Шабанов П.Д.2, Луговский А.П.3
16-я городская клиническая больница, Минск, Беларусь
2НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург; Россия 3 Институт прикладных физических проблем им. А.Н. Севченко БГУ Минск, Беларусь
Shilov G.N.1, Shabanov P.D.2, Lugovskiy A.P.3
City Clinical Hospital №6, Minsk, Belarus
2Research Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Saint-Petersburg, Russia
3Research Institute for Applied Physical Problems named after A.Sevchenko, Minsk, Belarus
Prospect treatment of epilepsy by the new anticonvulsant's class,
containing glycine's pharmacophore
Резюме. В опытах in vitro при исследовании активности хлорных каналов методом«пэтч-кламп»в режиме «от целой клетки» на культуре клеток глиомы крысы линии C6, а также в опытах in vivo при изучении биоэлектрической активности (БА) коры больших полушарий (КБП) мозга крыс (по степени торможения спектральной плотности мощности электрокортикограммы (ЭКоГ) в диапазоне 12-18 Гц) показано, что гамма-аминомасляная кислота (ГАМК, GABA), глицин и в-аланин и их Li-производные в концентрациях 10 мкмоль/л (опыты in vitro) и в дозе 10 мкг (при внутрижелудочковом введении в опытах in vivo) изменяли активность хлорных каналов и биоэлектрическую активность КБП мозга крыс. По изменению трансмембранного потенциала (активности хлорных каналов) и БА КБП мозга крыс при действии изученных аминокислот и их Li-солей можно расположить в ряд: в-аланин < ГАМК < глицин и соединение №2 < №3 < №1, то есть наиболее активным является глицин и соединение №1.
Ключевые слова: ГАМК-бензодиазепиновый рецептор, ГАМК, глицин, тормозные амнокислоты, хлорные каналы, глиома крыс, биоэлектрическая активность, электрокортикограмма, кора больших полушарий.
Медицинские новости. — 2016. — №4. — С. 66-68. Summary. Studies has been carried out in vttro experiments of the Cl-channels activity using "patch-clamp" in the from-the-whole-cell" regime on the C6 rat glyome cell culture and of the bioelectric activity (BA) in vivo of the brain cortex (BC) (by degree of depression of the spectral power density on electrocorticogram (ECoG) in the range of 12-18 Hz). It has been demonstrated that GABA, glycine along with their Li-derivatives used at the concentration 10 ymol/L (experiments in vitro) and 10 yg (intraventrical introduction in vivo) effected the Cl-channels and the brain cortex bioelectric activity. Studies of the trancemembrane potential (the Cl-channel activity) along wtth BA BC in the rat brain under the effect of the monoacids and their Li-salts made it possible to obtain the following activity row: в-alanine < GABA < glycine (compounds №2 < №3 < №1). The most active are shown to have been glycine and compound №1.
Keywords: GABA-benzodiazepine receptor, GABA, glycine, inhibitor amino acids, Cl-channels, rat glyome cell culture, electrocorticogram, bioelectric activity, brain cortex.
Медицинские новости. — 2016. — №4. — С. 66-68.
Актуальность поиска новых антиконвульсантов, в первую очередь, связана с наличием у всех современных противоэпилептических средств эффектов, приводящих к повышению порога возбудимости нейрональных мембран [2, 3, 11]. Следствием этого является снижение скорости межнейрональной передачи, что в свою очередь ведет к нарушению нормального протекания ментальных и когнитивных процессов в головном мозге, нормального формирования праксиса и, в конечном итоге, к деградации личности [12, 13]. В клинической картине подобные нейрофизиологические процессы проявляются различной степени выраженности седативным, транквилизирующим, анксиолитческим и другими эффектами, нарушающими нормальную жизнедеятельность человека [1, 13, 1б].
В этой связи интерес современной нейрохимии и нейрофармакологии к физиологическим функциям тормозных
аминокислот (в первую очередь, таких, как ГАМК и глицин основных тормозных нейромедиаторов) - не случаен: во-первых, они являются основным звеном в контроле возбудимости нейромембран, во-вторых, как известно, для клетки аминокислоты являются «биотиками», то есть соединениями, включающимися в естественные метаболические цепочки, что не нарушает нормальные клеточные биохимические процессы и делает их перспективными для создания лекарственных соединений, лишенных многих недостатков, свойственных практически всем известным противосудорожным препаратам, которые по своим свойствам для клетки и организма в целом являются «ксенобиотиками» [1, 5, 8, 13]. В то же время из современных представлений нейрофармакологии следует, что создание любого нового нейротропного препарата, как правило, связано с решением двух ключевых задач: во-первых, с синтезом соединения,
обладающего реципрокностью к соответствующему рецептору (в отношении противосудорожных препаратов интерес представляют ГАМК-бензодиазепиновый рецепторный комплекс и глициновые рецепторы), во-вторых, с приданием этому соединению химических свойств, способствующих преодолевать гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). Причем решение второй задачи может оказаться намного более сложным процессом, поскольку сохранение гомеостаза центральной нервной системы (ЦНС) - это один из наиболее значимых компонентов в иерархии функционирования любой системы организма.
Таким образом, изучение особенностей функционирования ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса и сопряженных с ним хлорных каналов, а также изучение биоэлектрической активности КБП является ценным инструментом в разрешении
Рисунок 1
I Изменение трансмембранного потенциала при действии глицина в концентрации 10 мкмоль/л
Рисунок 2
Изменение трансмембранного потенциала при действии основных тормозных аминокислот в концентрации 10 мкмоль/л
-120 -100 -80 -60 — -40
Равновесный трансмембранный потенциал, мВ
Глицин ГАМК в-аланин
Примечание: * - достоверное отклонение
20
о
многих проблемных аспектов в понимании механизмов возникновения различного рода патологических состояний ЦНС, связанных с изменением возбудимости клеточных мембран [2, 3, 14, 15].
Известно, что тормозные функции и ГАМК, и глицина в конечном счете опосредуются через базисные тормозные нейромедиаторные системы, к которым в частности относится ГАМК-бензодиазепиновые и глициновые рецепторы, сопряженные с хлорным кана-лом [4, 7]. В то же время считается, что тормозной эффект глицина может опосредоваться не только через собственные рецепторы, но и через пресинапитические NMDA-рецепторы и ГАМК-рецепторы [1, 6, 16, 17]. В настоящее время доказано, что именно ковшеобразный конформер ГАМК играет роль тормозного медиатора в ЦНС, тогда как глицин, являющийся коагонистом ГАМК-рецепторов, по своей молекулярной
геометрии в большей степени схож с циклическим конформером ГАМК и «функциональным скелетом» бензодиазепинов и барбитуратов [6, 7, 20-23]. Тем не менее механизмы взаимодействия этих двух тормозных нейромедиаторных систем не совсем понятны, а их изучение в перспективе, возможно, во многом определило бы поиск и синтез нового класса антиконвульсантов и ноотропов [8-10, 18-21].
Нейрофармакологам и неврологам хорошо известно, что ни ГАМК, ни глицин при пероральном или даже парентеральном введении не демонстрируют выраженный противосудорожный активности даже в очень больших дозах. Такой клинический феномен объясняется прежде всего тем, что будучи по своей химической природе цвиттерионами эти тормозные аминокислоты (как впрочем и многие другие полярные соединения) не способны проходить через ГЭБ. В свою очередь,
ряд исследователей, занимающихся разработкой концепции ГЭБ, показали, что преобразование полярных аминокислот в ионофоры позволяет им в той или иной степени улучшить прохождение ГЭБ [9, 14]. Правда, целый ряд феноменов, связанных с прохождением ГЭБ полярными соединениями, классифицируемыми как «тесная ионная пара», «сольватно разделенная ионная пара» или «свободно сольватированные ионы», недостаточно изучен и понятен. Тем не менее в последнее время появился определенный прогресс в понимании некоторых особенностей функционирования ГЭБ. Так, в частности, G. Eisenman удалось установить наличие селективности мембранных каналов для одновалентных катионов [14]. То есть в зависимости от «силы поля внутри канала» и радиуса иона: максимальная «сила поля»» в сочетании с наименьшим радиусом катиона (к примеру, у Li+ в сравнении с К+ и Na+) в конечном счете может привести к улучшению транспорта через «канал с сильным полем», таким образом объясняя феномен лучшего прохождения аминокислотой ГЭБ.
Нами было изучено: активность (способность открывания) хлорных каналов посредством измерения трансмембранного потенциала при действии ГАМК и агонистов глициновых рецепторов -глицина, р-аланина и их литиевых солей в опытах in vitro, а также влияние внутри желудочкового ведения ГАМК, глицина и их сочетания на нейрофизиологическую активность головного мозга белых крыс в опытах in vivo.
Материалы и методы
Опыты in vitro. Исследования активности хлорных каналов проводили методом «пэтч-кламп» в режиме «от
Рисунок 3
ЭКоГ в норме, при внутрижелудочковом введении ГАМК, глицина и их сочетания
№ 4 • 2016
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
Рисунок 4
150
Степень торможения спектральной плотности мощности ЭЭГ в диапазоне частот 12-18 Гц с течением времени
100
50
5-я мин 10-я мин
Примечание: верхняя - контроль, 1-й сверху - ГАМК, 2-й - глицин, 3-й - ГАМК+глицин
целой клетки» на культуре клеток глиомы крысы линии C6 через одни сутки после начала культивирования посредством измерения трансмембранного потенциала (сдвигов мембранного и равновесного потенциалов). Концентрация всех исследуемых препаратов в опытах in vito составила10 мкмоль/л.
Опыты in vivo. Под гексеналовым наркозом в черепную коробку крыс вживляли электроды для снятия ЭКоГ один из которых был полым, то есть одновременно являлся и хемотродом для последующего внутрижелудочкового введения исследуемого препарата. Спустя 3-е суток у животных регистрировались биоэлектрические потенциалы до и после внутрижелудочкового введения ГАМК (в дозе 10 мкг), глицина (10 мкг) и комбинации ГАМК + глицин (в дозах 5 мкг + 5 мкг соответственно). В дальнейшем проводили компьютерный анализ изменения биоэлектрической активности КБП мозга крыс по степени торможения спектральной плотности мощности ЭКоГ в диапазоне 12-18 Гц в течение 15 мин. Регистрацию и компьютерную обработку ЭКоГ осуществляли с помощью ЭЭГ-аппарата фирмы «МИЦАР» (Российская Федерация, по методике монополярного отведения, с использованием программного обеспечения ЭЭГ-2000).
Результаты и обсуждение
При анализе данных, полученных в опытах in vito показано, что равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы линии C6 на 2-е сутки с момента культивирования лежит в диапазоне от -90 до -70 мВ. При активации (открывании) хлорных каналов мембранный потенциал сдвигается к равновесному потенциалу хлорных каналов, который составляет -55 - -60 мВ. Из представленных данных на рис. 1 и 2 видно, что как ГАМК, так и глицин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно изменяют трансмембранный потенциал, то есть активируют (открывают) хлорный
канал, причем эффект глицина оказался даже более выраженным, чем при введении ГАМК, тогда как агонист глициновых рецепторов р-аланин не влиял на активность хлорных каналов. Подобный эффект продемонстрировали и литиевые соли тормозных кислот (в связи со схожестью результатов данные не представлены). Полученные результаты свидетельствуют о том, что глицин может непосредственно влиять на активность ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса, однако связываясь с другим локусом, нежели ковшеобразный конформер ГАМК [5].
При анализе данных, полученных в опытах in vivo, показано, что глицин в той же дозе, что и ГАМК, значительно мощнее и дольше (вплоть до 15-й минуты) тормозит биоэлектрические потенциалы мозга крыс, что хорошо видно на графике степени торможения спектральной плотности мощности ЭКоГ (рис. 3, 4). Более того, сочетанное введение ГАМК и глицина в той же суммарной дозе (10 мкг) в большей степени тормозит биоэлектрические потенциалы мозга крыс, нежели отдельное введение этих тормозных нейромедиаторов (см. рис. 3). Результаты подтверждают данные, полученные в опытах in vitro о влиянии глицина на активность хлорных каналов, что позволяет предположить наличие в ГАМК-бензодиазепиновом рецепторном комплексе двух различных локусов: локуса для связывания ковшеобразного конформера ГАМК, а также локуса для связывания его циклического конформера, глицина и бензодиазепинов. Это предположение подтверждается также выраженным синэргетическим эффектом при совместном введении ГАМК и глицина (см. рис. 3).
Выводы:
1. В структуре ГАМК-бензодиазе-пинового комплекса существуют два локуса для связывания различных конформеров ГАМК: локус для связывания ковшеобразного конформера ГАМК, а также локус для связывания его циклического конформера, глицина и бензодиазепинов.
2. Циклический конформер ГАМК и глицин являются эндогенными агонистами ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса.
3. Li-соли ГАМК и глицина, способные преодолевать ГЭБ, являются перспективными соединениями для лечения эпилепсии.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. КатцунгБ.Г. Базисная и клиническая фармакология. - М., 2000. - С.406-428.
2. Вислобоков А.И., Борисова В.А., Прошева В.И., Шабанов П.Д. Фармакология ионных каналов / Ци-тофармакология. Т1. - СПб., 2012. - 528 с.
3. Прозоровский В.Б. // Химия и жизнь. - 2006. -№7. - С.13-29.
4. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. - М., 1987. -С.213-229.
5. Шилов Г.Н., Балаклеевский А.И., Бубель О.Н., Го-голинский В.И. // Здравоохранение. - 1997. - №8. -С.24-29.
6. Шилов Г.Н., Бубель О.Н., Пушкарчук А.Л. // Тезисы докладов. XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М., 2004. - С.61.
7. Шилов Г.Н., Переверзев В.А. // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы / Материалы 3-й международной конференции. -Минск, 2005. - С.98.
8. Шилов Г.Н., Бубель О.Н., Переверзев В.А. // Тезисы докладов. XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М., 2006.
9. Шилов Г.Н, Иванютин В.А, Шабанов П.Д. // Обзоры по клинической фармакологии. - 2015. - Т.13. -С.202-203.
10. Эди М.Ж., Тайрер Дж.Х. Противосудорожная терапия. - М., 1983. - 323 с.
11. Яхно Н.Н., Штульман Д.Р. Болезни нервной системы. - М., 2003. - С.208-244.
12. Brody T.M., Lamer J., Minneman K.P. Human Pharmacology Molecular to Clinical (3 ed.). - Mosby, 1998. - 1001 p.
13. Camerino D.C, Tricarico D., Desaphy J.F // Neurotherapeutics. - 2007. - Vol.4. - P.184-198.
14. Eisenman G., Dani J.A. // Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. - 1987. -Vol. 16. - P.205-226.
15. Fugg G.E., Ferster A.S. // J. Neurosci. - 1983. -Vol. 9, №4. - P.701-719.
16. The pharmacological basis of therapeutics. New-York, 2004. - P.461-486.
17. Shilov G.N, Bubel O.N. et al. // Epilepsy. - 1998. -Vol. 39, suppl. 2. - P. 99.
18. Shilov G.N. et al. Interaction GABA and glycine receptors in CNS's anticonvulsive control // 12-th Congress of the Federation of Neurological Societies. -Spain, 2008.
19. Shilov G.N et al. // EFNS European journal of neurology. - 2008. - Vol.bi15, suppl.3. - P.220.
20. Shilov G.N. et al. Some new conception of the GABA-benzodiazepine receptors structure and perspective of seizure therapy with antiepileptic drugs with glycine pharmacophore // 9-th European Congress on Epileptology. - Rhodes, 2010.
21. Shilov G.N. Relationship of the molecular geometry and quantum-chemical characteristics some aminoacids with their inhibitor possibility in CNS // 29-th International Epilepsy Congress. -Rome, 2011.
22. Shilov G.N. et al. View at the cyclic GABA's conformer and Glycine, as at natural endogen agonist GABA-benzodiazepine's receptor complex // The 30th International Epilepsy Congress. - Toronto, 2013.
23. Shilov G.N. Cyclic GABA conformer and Glycine as natural endogen agonists of GABA-benzodiazepine-receptor complex // The 31-st International Epilepsy Congress, 2015.
Поступила 28.01.2016 г.
