CC BY
4с культурой клеток, в которых осуществляли трансфекцию с помощью микрогранул, развитие цитопатического действия (ЦПД), характерного для ВБА, обнаруживали уже на 2-е сутки, в то время как в других образцах появление ЦПД не наблюдали. На 4-е сутки ЦПД было обнаружено в культуре клеток, трансфекцию в которых осуществляли с использованием липофек-тамина. На культуре клеток с ДЕАЕ-де-кстраном ЦПД не наблюдали в течение 6 дней (срок наблюдения). Полученный ци-топатический эффект был обусловлен вирусом болезни Ауески, что подтверждено также методом ПЦР со специфическими праймерами к gp 50, размер ПЦР-продукта составлял 492 п.о.
Таким образом, разработан метод мик-рокапсулирования ДНК, состоящий из следующих этапов: 1) сорбция ДНК пористы-
ми микрочастицами СаСО3 при 4° С 2024 часа; 2) нанесение полимерных слоев Alg- PLL-Alg- PLL-Alg- PLL; 3) растворение внутреннего ядра СаСО3; 4)отмывание микрокапсул с заключенной в них ДНК.
Выводы
Проведенные исследования показали, что разработанный метод микрокапсули-рования ДНК путем послойной адсорбции противоположно заряженных биодегради-руемых полиэлектролитов на сферические макропористые микрочастицы СаСО3 может быть использован для доставки генетического материала (нуклеиновой кислоты) в эукариотические клетки in vivo и in vitro. Разработанный метод микрокап-сулирования может быть использован при конструировании ДНК-вакцин.
Работа выполнена по проекту РФФИ 06-04-08-277
РЕЗЮМЕ
Работа относится к области нанотехнологий и технологиям соматической генной терапии. Представлены результаты получения микрокапсул с регулируемыми параметрами (диаметр, толщина оболочки, состав и проницаемость мембраны) и иммобилизации в них ДНК вируса болезни Ауески. Микрокапсулирование ДНК может быть использовано как способ доставки ДНК-вакцин. SUMMARY
The area of nanotechnologies and somatic gene therapy technologies is considered. The paper demonstrates results of generation of microcapsules having regulated properties (diameter, capsule thickness, membrane composition and permeability) and the results of Aujeszky's disease viral DNA immobilization in these microcapsules. The DNA microcapsulation can be used for DNA-vaccine delivery.
Литература
1. Микрокапсулирование ДНК как способ доставки X.D. Hu, D.H. Hu, [et al.] //Vaccine.2005. Vol. 23. ДНК вакцин /В.И. Балышева, Н.Н.Власова, О.Е. Р. 4167-4174.
Селина, [и др.] // Росс. вет. журн. Мелкие домаш- 3. Clark, J.R. Bacterialvirusis as human vaccinsFuture
ние и дикие животные. 2007. №1. С. 25-26. 2. Combined DNA vaccine encapsulated in microspheres enhanced protection efficacy against Mycobacterium tuberculosis infection of mice /H. Cai,
drugs /J.R. Clark, J.B. March //Expert Rev. Vaccines. 2004. Vol. 3,4. P. 463-476 4. Johnson M. E., Mossman S., Cecil T., Evans L. Patent No.:US 2002/0032165 A1 Mar.14, 2002.
УДК 619:619.98:579.842.14
И.А. Степанова, О.В. Бородина, Ф.А. Ширяев
ПЕРСИСТЕНЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ОРГАНИЗМЕ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ
Введение
Сальмонеллез - инфекционное контагиозное заболевание многих видов домашних, диких животных и птиц, широко распространенное среди сельскохозяйственных животных, наносящее большой ущерб животноводству и представляющее угрозу здоровью людей [1, 6].
Возбудители сальмонеллеза могут вызывать как первичные инфекции (брюшной тиф человека, сальмонеллезы молод-
няка животных, пуллороз птиц), так и вторичные, осложняющие бактериальные и вирусные болезни (пневмонии молодняка, чума свиней). У людей они вызывают пищевые токсикоинфекции при употреблении инфицированных продуктов животного происхождения [2, 3].
Домашняя птица, свиньи, крупный рогатый скот являются основным резервуаром инфекции, а продукты питания животного происхождения - источником зараже-
ния людей. Одной из причин такого положения является способность сальмонелл длительное время персистировать в организме животных (сальмонеллоносительс-тво), а при выделении во внешнюю среду длительно (до года) сохраняться в навозе и контаминированных предметах [1].
Широкое применение противосальмо-неллезных вакцин в свиноводстве значительно снизило за последние годы количество случаев тифозной формы течения сальмонеллеза. Однако наличие энтероколитов и выделение сальмонелл из патма-териала от вакцинированных животных иногда воспринимается как неудовлетворительное качество вакцин [6].
Считается, что вакцинация предотвращает или снижает клинически выраженный сальмонеллез и малоэффективна против субклинических форм заболевания и сальмонеллоносительства [4, 5]. Поэтому целью работы было определение выживания сальмонелл в крови свиней, иммунизированных инактивированной вакциной, а также возможного выделения бактерий с фекалиями после экспериментального внутрибрюшинного заражения.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на поросятах 4-недельного возраста. Всего использовано 20 животных, 16 из которых иммунизировали вакциной против сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной производства ФГУ «ВНИИЗЖ» (ТУ 9884-09300495527-02), а 4 невакцинированных служили в качестве контроля. Вакцину разводили с трехкратным шагом в плацебо и вводили поросятам однократно внутримышечно по 0,5 см3, используя по 4 животных на разведение.
Через 21 день после иммунизации поросят заражали суспензией 18-часовой агаровой культуры Salmonella choleraesuis штамма №370. Заражение проводили внутри-брюшинно в дозе 40 млрд микробных клеток (м.к.) на животное.
За животными вели наблюдение в течение 10 дней с момента заражения. До и после экспериментального заражения у поросят ежедневно измеряли температуру тела. Для бактериологического анализа брали пробы крови (метод гемокультуры) и кала (метод копрокультуры), а также получали сыворотку крови для определения уровня противосальмонеллезных антител через 2, 4, 6, 8 и 10 суток. Уровень противосаль-монеллезных антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции агглютинации (РА). По истечении
срока наблюдения провели вынужденный убой всех животных с последующим бактериологическим анализом отобранного от них патологического материала.
Прижизненному бактериологическому исследованию подвергали кровь и кал экспериментально зараженных поросят. Кровь у животных брали из ушной вены, прокалывая ее стерильной иглой. Сразу после взятия кровь высевали в 6-7 пробирок на МПА и МПБ. После 20-24-часового выращивания делали пересев на среду Эн-до в чашки Петри. Дальнейшие бактериологические исследования проводили по общепринятой методике.
Для выделения копрокультур от зараженных поросят в стерильные пробирки брали небольшое количество кала (2-3 г), разводили физиологическим раствором и после оседания грубых частиц делали посев на среды накопления - среду Мюллера и желчный МПБ. Через сутки делали дробный пересев на скошенный МПА в пробирках. Выделенные чистые культуры сальмонелл испытывали со специфическими монорецепторными сыворотками.
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования показали, что первые трое суток после экспериментального заражения у невакцинирован-ных поросят контрольной группы наблюдалось повышение температуры тела до 41,3° С (при норме 38,0-40,0° С), рвота, отказ от корма. На четвертые сутки одно животное пало. На 5-6 сутки состояние здоровья поросят нормализовалось. Температура тела снизилась до 39,8-40,8° С, но в течение всего срока наблюдения у животных наблюдали угнетенное состояние и плохое поедание корма.
Для прижизненного бактериологического анализа от животных брали пробы крови и кала. От павшего животного бактериологическому анализу подвергали пробы внутренних органов (селезенка, печень, мезентериальные лимфоузлы и др.). Из крови, кала и исследуемых органов был выделен штамм 5. ско1етае8Ш8, использованный для заражения. Концентрация сальмонелл в кале к 6-м суткам достигала 100 000 м.к./г (4,5-5,0 ^КОЕ/г).
После контрольного заражения вакцинированных поросят у трех подсвинков (разведение вакцины 1:27) было кратковременное повышение температуры тела до 40,5° С. У остальных животных, как и ожидалось, клинических признаков заболевания выявлено не было.
Результаты бактериологического ана-
«+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака
Таблица 2
Выделение сальмонелл из кала экспериментально зараженных свиней
Таблица 1
Выделение сальмонелл из крови экспериментально зараженных свиней
№ Разведение вакцины Обнаружение сальмонелл, дни
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 - - - - - - - - - -
2 0 - - - + - - - + + -
3 - - - - - - - - - -
4 - - - + - + + - + -
5 - - - - - - - - - -
6 1:3 - - - - - - - - - -
7 - + + - + - - - + -
8 - + + + + + + + + -
9 - - - - - - - - -
10 1:9 - - - - + - - - - -
11 - - - - - + - - + -
12 - - - - - - - - - -
13 - - - + + + + + + -
14 1:27 - - + - - - - + - -
15 - + + + + + + - - -
16 - - - - - - - - - -
17 + + + пал
18 Невакцинированные + + + + + + + + + +
19 + + + + + + + + + +
20 + + + + + + + + + +
№ Разведение вакцины Обнаружение сальмонелл, дни
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 - - - - - - - - - -
2 0 - - - - + + + + + +
3 - - - - + + + + + +
4 - - - - - + + + + +
5 - - - - - - - - - -
6 1:3 - - - + + + + + + +
7 - - - + + + + + + +
8 - - - - - - - - - -
9 - - - - - - - - -
10 1:9 - - - - + + + + + +
11 - - - - + + + + + +
12 - - - - - - - - - -
13 - - - + + + + + + +
14 1:27 - - - + + + + + + +
15 - - - + + + + + + +
16 - - - - - - - - - -
17 - - + пал
18 Невакцинированные - - + + + + + + + +
19 - - + + + + + + + +
20 - - + + + + + + + +
«+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака
лиза проб крови (табл. 1) и кала (табл. 2) от вакцинированных свиней, оставшихся клинически здоровыми после заражения, свидетельствуют, что возбудитель сальмо-неллеза обнаруживался в крови животных уже на второй день после заражения, а начиная с 4-х суток жизнеспособные сальмонеллы можно было выделить из кала.
После убоя животных 5. ско1етае8Ш8
выделили из тканей печени, селезенки, легкого, содержимого тонкого отдела кишечника, мезентериальных лимфоузлов и желчи тех поросят, у которых возбудитель выделяли при жизни из крови.
Результаты исследования сывороток крови свиней показали (табл. 3), что уровень противосальмонеллезных антител после вакцинации у них был низкий как
1- титр активности сыворотки;
2- средняя величина ± средняя ошибка для средней величины
Таблица 3
Уровень противосальмонеллезных антител
№ животного Разведение вакцины Уровень антител через 21 день после вакцинации Уровень антител на 10-й день после заражения
ИФА РА ИФА РА
1 0 17801 501 2500 200
2 1540 100 2600 100
3 1780 100 2960 200
4 560 50 1780 100
M±m2 1415±290 75±14 2460±247 150±28
5 1:3 560 50 1900 200
6 1900 100 2440 800
7 1440 50 3460 400
8 1780 100 2500 200
M±m 1420±302 75±14 2575±324 400±141
9 1:9 480 50 1980 200
10 1090 100 2600 200
11 2930 100 3380 400
12 1460 200 3850 400
M±m 1490±520 112±31 2952±414 300±57
13 1:27 1360 100 2930 800
14 1090 50 2440 200
15 1590 200 3930 400
16 440 50 1780 200
M±m 1120±248 100±35 2770±452 400±141
17 Невакцини-рованные 560 <25 пал
18 140 25 2550 400
19 460 50 3100 400
20 170 <25 2500 200
M±m 332±104 31±6 2716±191 333±66
на соматический в РА, так и на жгутиковый антиген в ИФА. При этом четкой зависимости уровня антител от дозы антигена не наблюдали. После контрольного заражения уровень специфических антител повысился в среднем у вакцинированных животных в 2 раза, у невакциниро-ванных - в 8-10 раз.
Важно отметить, что иммунизация поросят инактивированной вакциной против сальмонеллеза хотя и защищает животных от клинически выраженной формы заболевания (тифоидной), однако не предотвращает диссеминацию сальмонелл и выделение возбудителя с фекалиями. Возможно, это обусловлено способностью сальмонелл сохраняться и размно-
жаться в фагоцитах. Бактерии, циркулируя в крови животных, попадают в желчный пузырь, откуда с желчью выделяются в просвет кишечника, а затем с фекалиями во внешнюю среду.
Выводы
1. Инактивированная вакцина против сальмонеллеза свиней обеспечивает защиту иммунизированных животных от заболевания, но не исключает персистенцию сальмонелл в организме и выделение возбудителя с экскрементами во внешнюю среду.
2. Не выявлена зависимость между защитой и уровнем противосальмонеллез-ных антител в крови вакцинированных животных.
РЕЗЮМЕ
В статье представлены результаты исследования выживаемости сальмонелл в организме вакцинированных свиней. Установлено, что после контрольного заражения в крови вакцинированных животных определенное время могут присутствовать жизнеспособные сальмонеллы. Показано, что иммунизация поросят инактивированной вакциной против сальмонеллеза защищает животных от заболевания, но не исключает сальмонеллоносительство и выделение возбудителя во внешнюю среду. SUMMARY
The paper presents the study results of salmonella persistence in organisms of vaccinated pigs. It is demonstrated that after the challenge vaccinated animals are protected against salmonellosis but they remain salmonella-carriers and shed salmonella with faeces. Viable salmonella can be present in blood of vaccinated animals for a certain period of time.
1. Ахмедов, А.М. Сальмонеллезы молодняка / А.М. Ахмедов. 2-е изд., испр. и доп. М.: Колос, 1983. 256 с.
2. Матвиенко, Б.А. Сальмонеллезы животных - биологическая и ветеринарная проблема / Б.А. Матвиенко // Эпизоотол., эпидемиол., средства диагностики, терапии и специфич. профилактики инфекц. болезней, общих для человека и животных: матер. Всесоюз. конф. Львов, 1988. С. 293-294.
3. Anderson, M. The clinical syndromes caused by Sal-
тура
monella infections / M. Anderson, P. Blanchard // Vet. Med. 1989. Vol.4, №8. Р 816-819
4. Collins, E M. Infection - immunity in experimental Salmonellosis / E Collins, G.B. Mackaness // J. Exp. Med.- 1966.- №124.-Р. 601-619.
5. Osawa, N. Experimental salmonellosis. Postinfective immunity and its significance for conferring cellular immunity / N. Osawa / / J. Bacteriol. 1967. Vol.93. Р. 1534-1540.
6. Walton, J. R. Salmonellosis / J. R. Walton // Brit. Vet. J. 1983. Vol. 139, №3. Р. 185-191.
УДК 619:616.98:579.843.96.
А.А. Фроловцева, В.С. Русалеев, А.В. Потехин
СЕРОТИПИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ АКТИНОБАЦИЛЛЕЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ СВИНЕЙ
Введение
Актинобациллезная плевропневмония свиней - инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами. Заболевание вызывают бактерии A. pleuropneumoniae семейства Pastemettaceae.
Штаммы A. pleuropneumoniae разделяют на 15 серовариантов по капсуль-ному антигену (1, 8). Известно, что се-роспецифические антигены бактерий А. р1еигорпеитошае локализованы в кап-сульных полисахаридах и О-полисахарид-ных компонентах (О-цепях) липополиса-харидов (8).
Для определения серовариантной принадлежности бактерий A. pleuropneumoniae используют ряд серологических реакций -реакция агглютинации, реакция иммуно-электрофореза, реакция непрямой гемаг-глютинации, реакция преципитации и им-муноферментный анализ с моноклональ-ными антителами [2, 3, 4, 5].
Изучение серовариантного разнообразия изолятов возбудителя актинобацил-лезной плевропневмонии свиней, циркулирующих на территории Российской Федерации, позволит более объективно оценивать эпизоотологию данного заболевания и отбирать наиболее перспективные штаммы для совершенствования и разработки препаратов для специфической профилактики.
Целью данной работы было изучение
серовариантной принадлежности изоля-тов Actinobacillus pleuropneumoniae, выделенных из патологического материала от свиней в различных регионах Российской Федерации.
Материалы и методы
В работе использовали изоляты A. pleuropneumoniae «Ш-1», «К-2» и «К-1», выделенные из патологического материала в лаборатории микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ», и референтные штаммы A. pleuropneumoniae №№ 27088 (1 серотип), 27089 (2 серотип), 27090 (3 серотип), 33377 (5 серотип), 33590 (6 серотип), полученные из Американской коллекции типовых культур.
Получение антигенов. Для получения антигенов использовали 12-15-часовые агаровые культуры изолятов и штаммов A. pleuropneumoniae.
Капсульный антиген для реакции преципитации (РП), реакции непрямой гемаг-глютинации (РНГА) получали по методикам, описанным R. Nielsen, P. J. O'Connor [6] и R. Nielsen et al. [7].
Соматический антиген для реакции агглютинации (РА) получали по методике A. Gunnarsson et al. [2].
Получение гипериммунных сывороток. Гипериммунные сыворотки крови кроликов готовили по методике R. Nielsen et al. [7].
Реакцию преципитации (РП) в агаровом геле, реакцию агглютинации (РА) и реакцию непрямой гемагглюти-нации (РНГА) для определения серова-риантной принадлежности изолятов A. pleuropneumoniae проводили по традици-
