CC BY
224. Хуснутдинова Э.К. Этногеномика и генетическая история народов Восточной Европы. Вестник РАМН. 2003,73 (7): 614-621.
5. Чернова М.С. Иммуногенетический профиль популяций Челябинской области (русские, татары, башкиры, нагайбаки) в структуре мировых популяций. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Челябинск, 2014
6. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006, 124 (4): 783801.
7. Altshuler D., Brooks L.D., Chakravati A. et al. A haplotype map of human genome. Nature. 2005, 437 (7063): 1299-1320.
8. Barreiro L.B., Ben-Ali M., Quach H. et al. Evolutionary dynamics of human toll-like receptors and their different contributions to host defense. PLoS Genetics. 2009, 5 (7): e1000562.
9. Barreiro L.B., Quintana-Murci L. From evolutionary genetics to human immunology: how selection shapes host defense genes. Nature Rev. Genetics. 2010, 11: 17-30.
10. Casanova J.-L., Abel L., Quintana-Murci L. Human TLRs and IL-1Rs in host defense: natural insights from evolutionary, epidemiological, and clinical genetics. Annual Rev. Immunology. 2011, 29: 447-491.
11. Hawks J., Wang E.T., Cochran G.M. et al. Recent acceleration of human adaptive evolution. PNAS.
2007, 104 (52): 20753-20758.
12. Karlsson E.K., Kwiatkowski D.P., Sabeti P.C. Natural selection and infectious disease in human populations. Nature Rev. Genetics. 2014; doi:10.1038/nrg3734.
13. Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011, 34: 637-650.
14. Leulier F., Lemaitre B. Toll-like receptors — taking an evolutionary approach. Nature Rev. Genetics.
2008, 9: 165-178.
15. Netea M.G., Wijmenga C., O'Neil L.A.J. Genetic variation in toll-like receptors and disease susceptibility. Nature Immunology. 2012, 13 (6): 535-542.
16. Pickrell J.K., Coop G., Novembre J. et al. Signals of recent positive selection in a worldwide sample of human populations. Genome Res.. 2009, 19: 826-837.
17. Raj T., Kuchroo M., Replogle J.M. et al. Common risk alleles for inflammatory diseases are targets of recent positive selection. Human Genetics. 2013, 92: 517-529.
18. Takeuchi O., Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 2010, 140: 805-820.
19. Quintana-Murci L., Clark A.G. Population genetic tools for dissecting innate immunity in human. Nat. Rev. Immun. 2013, 13 (4): 280-293.
Контактная информация: Бурмистрова А.Л.,
454021, Челябинск, ул. Братьев Кашириных, 129, р.т. (3517)99-71-76
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
О.И.Бархатова, Г.А.Левина, И.В.Раковская, Н.С.Мулабаев, Н.А.Гамова, Э.Р.Толордава, Ю.М.Романова
ПЕРСИСТЕНЦИЯ МИКОПЛАЗМ ПРИ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Городская клиническая больница им. С.П.Боткина, Москва
Цель. Изучить частоту выявления микоплазм и уреаплазм в клиническом материале от больных мочекаменной болезнью. Материалы и методы. Образцы клинического материала (сыворотка крови, моча, мочевые камни) от 31 больного мочекаменной болезнью были получены во время операции по удалению камней. В исследовании использовали культуральный метод, РАГА и ПЦР. Результаты. Изучение клинического материала от 31 больного методом ПЦР показало, что у 25 человек (80,6%) была выявлена ДНК микоплазм и уреаплазм, ДНК микоплазм чаще выявляли в мочевых камнях, реже — в сыворотке крови. ДНК Mycoplasma hominis обнаруживали в клиническом материале значительно большего числа больных. Культуральным методом от 8 пациентов было выделено 23 культуры, идентифицированные методом ПЦР как M. hominis. Все изоляты вырастали в виде «мини-колоний». Даже при многократном пассировании на агаровой среде не было получено реверсии «мини-колоний» в колонии с классической морфологией. Заключение. Установлена высокая частота выявления микоплазм и уреаплазм в клиническом материале больных с мочекаменной болезнью. Выделенные культуры M. hominis росли только в виде «мини-колоний». Обнаруженный феномен может свидетельствовать о высокой
вариабельности микоплазм и возможности существования ранее неизвестной формы их персистенции в организме человека.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 101-106
Ключевые слова: микоплазмы, персистенция, ПЦР, мочевые камни
O.I.Barkhatova, G.A.Levina, I.V.Rakovskaya, N.S.Mulabaev, N.A.Gamova, E.R.Tolordava, Yu.M.Romanova
PERSISTENCE OF MYCOPLASMA DURING UROLITHIASIS
Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital, Moscow, Russia
Aim. Study the frequency of detection of mycoplasma and ureaplasma in clinical material from urolithiasis patients. Materials and methods. Clinical material samples (blood sera, urine, uroliths) from 31 urolithiasis patients were obtained during operations of urolith removal. Cultural method, LAR and PCR were used in the study. Results. The study of clinical material from 31 patients by PCR has shown, that in 25 individuals (80.6%) DNA of mycoplasma and ureaplasma was detected, and mycoplasma DNA was more frequently detected in uroliths and less — in blood sera. Mycoplasma hominis DNA was detected in clinical material of a significantly larger number of patients. 23 cultures were isolated from 8 patients by a cultural method, that were identified by PCR as M. hominis. All the isolates have grown as «mini colonies». Even after multiple passages in agar medium, reversion of «mini-colonies» into colonies with a classic morphology was not obtained. Conclusion. A high frequency of detection of mycoplasma and ureaplasma in clinical material of patients with urolithiasis was established. The isolated M. hominis cultures have only grown as «mini-colonies». The phenomenon discovered could give evidence on high variability of mycoplasma and a possibility of existence of previously unknown form of their persistence in human organism.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 101—106 Key words: mycoplasma, persistence, PCR, uroliths
ВВЕДЕНИЕ
Микоплазмы — представители класса Mollicutes являются мельчайшими способными к свободному существованию бактериями. В организме человека обитают, по крайней мере, 16 видов микоплазм, 7 видов — в урогенитальном тракте, 4 вида из них патогенны для человека: Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum [4].
M. hominis с высокой частотой обнаруживают во влагалище и цервикальном канале при бактериальном вагинозе и воспалительных заболеваниях урогенитального тракта (УГТ). Многократно описаны случаи острого и хронического пиелонефрита, вызванного M. hominis [12]. Исследователи считают, что хронический пиелонефрит может развиться в результате проникновения микоплазм в почки из очагов инфекции нижних отделов УГТ. Описаны пороки развития плода при внутриутробном инфицировании его этой мико-плазмой [4].
Уреаплазмы вызывают острый и хронический уретриты, септический артрит, передающийся половым путем на фоне гамаглобулинемии, и являются причиной рождения детей с низкой массой тела и пороками развития респираторного тракта [4]. Специфическое свойство уреаплазм — наличие уреазной активности может являться провоцирующим фактором в камнеобразовании. В работах 70 — 80 гг. ХХ в показано образование камней в почках крыс при их экспериментальном заражении U. urealyticum в почку или мочевой пузырь. Камни образовывались у 60% животных уже на 4 — 5 день инфекции. Заражение крыс M. hominis также приводило к образованию камней в мочевом пузыре у 10% животных через 6 недель после заражения. Процесс можно было предотвратить или приостано-
вить с помощью доксициклина. Было показано также, что U. urealyticum может быть выделена из камней и мочи 13% пациентов с метаболическими камнями в сравнении с 30% пациентов с инфекционными камнями [7, 13]. Однако в более поздних исследованиях не удалось получить убедительных доказательств камнеобразования под действием уреаплазм. Уреаплазмы, также как M. hominis, часто обнаруживают в тканях предстательной железы при хроническом простатите.
Наиболее выраженное патогенное действие из всех перечисленных микоплазм оказывает M. genitalium [8, 9, 11]. Она вызывает хронический и острый негонококковый уретрит, занимая по частоте выявляемости при этой патологии второе место после хламидий.
Все указанные выше виды микоплазм могут участвовать в развитии смешанных инфекций. Однако за длительный период их изучения получены убедительные доказательства, что они сами по себе могут вызывать широкий спектр заболеваний, при которых другие инфекционные агенты не выявляются.
Микоплазмы способны прикрепляться к любым клетках микроорганизма, в том числе к эритроцитам и лимфоцитам. С током лимфы и крови они разносятся по органам и тканям, вследствие чего развивается генерализованная микоплазменная инфекция. Генерализация инфекционного процесса — одна из особенностей микоплазменных инфекций [3]. Другой особенностью является длительная персистенция возбудителя в тканях инфицированного организма [5]. Их выделение при персистентных инфекциях часто затруднительно. Из-за малого размера генома и отсутствия ряда ферментных систем микоплазмы нуждаются в биосинтетических предшественниках аминокислот и ДНК, стероидах и жирных кислотах. Несмотря на трудности их выделения из организма, их роль в хронизации инфекции респираторного тракта и УГТ общепризнана. Тем не менее, для диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется использовать не только культу-ральный, но и современные серологические и молекулярно-генетические методы. В наибольшей степени это относится к M. genitalium, выделение которой из организма представляет наибольшие трудности, и диагноз инфекции осуществляется только на основании данных ПЦР [10].
Целью работы явилось изучение возможной патогенетической роли микоплазм в развитии постоперационных осложнений при мочекаменной болезни (МКБ). Задача первого этапа исследований — определение частоты выявления представителей семейства Mycoplasmataceae в клиническом материале, полученном непосредственно в ходе оперативного вмешательства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клинический материал для исследования был получен из урологического отделения клинической больницы им. С.П. Боткина Москвы. От 31 больного исследовали: образцы свежевыделенной мочи и мочи, полученной при катетеризации из почечной лоханки, образцы сыворотки крови и мочевые камни, извлеченные при проведении чрескожной контактной нефролитолапаксии (дробление и извлечение камня из почки под визуальным контролем с помощью нефроскопа). Этот метод позволяет предотвратить контаминацию камня посторонней бактериальной флорой.
Всего было исследовано 124 пробы. Наличие микоплазм в пробах определяли культу-ральным, серологическим (РАГА) и молекулярно-генетическим (ПЦР) методами.
Для выделения микоплазм из клинического материала использовали коммерческую питательную среду Difco PPLO агар (1,3%) с добавлением 20% сыворотки крови лошади, 1% L-аргинина (для аргининзависимых видов) или 0,05% мочевины (для уреаплазм) и 1000 ЕД/мл пенициллина. Уреаплазмы выращивали в бульоне той же прописи.
Для посева материала почечного камня его стерильно растирали в ступке в небольшом количестве физиологического раствора. Чашки и пробирки с посевами инкубировали при температуре 37°С до 14 дней, каждые два дня контролируя рост бактерий. При появлении специфического роста или подозрении на него проводили пассирование колоний на чашках с аналогичной питательной средой. Принадлежность выделенных культур к ми-коплазмам и уреаплазмам подтверждали с помощью ПЦР.
Для определения сопутствующей бактериальной флоры раздробленные камни помещали в LB-бульон и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С с аэрацией. Выращенные бульонные культуры высевали на агаровые селективные среды (среда Эндо, кровяной агар, энтерококковый агар, стафилококковый агар, среда Сабуро) и получали
чистые культуры. Выросшие микроорганизмы идентифицировали до вида с помощью биохимического тестирования.
Образцы клинического материала исследовали на наличие в них ДНК M. hominis, M. genitalium и U. spp. методом ПЦР. Для этого были использованы лицензированные тест-системы (ООО «ИнтерЛабСервис»). Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-сорбВ», предназначенного специально для работы с клиническим материалом. Для выявления ДНК использовали следующие тест-системы: АмплиСенс Mycoplasma hominis, АмплиСенс Mycoplasma genitalium, АмплиСенс Ureaplasma spp. (тест-система, обнаруживающая одновременно U. urealyticum и U. parvum) и универсальную тест-систему «МИК-КОМ», выявляющую ДНК микоплазм. ПЦР ставили согласно прилагаемым к тест-системам методическим инструкциям. Детекцию продуктов амплификации проводили в агарозе с помощью электрофореза.
Антигены клеток микоплазм в пробах сыворотки крови выявляли в реакции агрегатге-магглютинации (РАГА) по методике, разработанной в ФНИЦ им. Н.Ф. Гамалеи [4].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
При исследовании клинического материала от 31 больного культуральным методом микоплазмы были выделены в образцах от 8 человек (28,8%). Всего было получено 23 культуры микоплазм, идентифицированные методом ПЦР как M. hominis. В 5 случаях микоплазма была выделена из камня, в 5 — из свежевыделенной мочи, в 8 — из мочи лоханки и в 5 случаях — из сыворотки крови больных. Выделить уреаплазмы ни в одном случае не удалось.
Все выделенные культуры микоплазм были представлены в виде чрезвычайно мелких светопреломляющих колоний («мини-колонии») значительно менее 10 мкм в диаметре, обнаруживаемых только с помощью светового микроскопа при увеличении х125. Ни в одном случае мы не наблюдали типичных «fried-egg» колоний. Рост был скудным, колонии пассировались с трудом, иногда после 3 — 4 пассажей погибали, иногда, по-видимому постепенно адаптируясь к среде, успешно перевивались. Но и при пассировании в течение нескольких месяцев морфология колоний не подвергалась изменениям, реверсии к классическим для этого вида колониям ни разу не наблюдали. Заметим, что и из образцов мочевых камней микоплазма вырастала также только в виде «мини-колоний».
Результаты исследования клинических образцов методом ПЦР показали, что из 31 обследованного больного ДНК микоплазм выявлена у 25 человек (80,6%). ДНК микоплазм чаще всего обнаруживали в мочевом камне 21(84%), моче лоханки 9(36%), свежевыделенной моче 14(56%), реже — в сыворотке крови 8 (32%). Анализ видового состава выявленных микоплазм показал, что M. hominis тестировали наиболее часто 12(48%). Также выявлена ДНК M. genitalium 1(4%), ДНК U. spp. 1(4%) и ДНК нескольких возбудителей 8 (32%). В трех случаях была выявлена ДНК, которую не удалось идентифицировать имеющимися у нас моно тест-системами.
Всего из 124 изученных клинических образцов ДНК разных видов микоплазм была обнаружена в 52 случаях.
Образцы сыворотки крови 14 пациентов исследованы методом РАГА на наличие в них антигенов M. hominis. Положительные результаты получены в 8 случаях, причем в шести из них они коррелировали с результатами ПЦР и культурального метода.
В нашей недавней работе (Романова Ю.М. и др., 2015) было высказано предположение, что микоплазмы могут принимать участие в образовании биопленок на мочевых камнях. Для проверки этого предположения было проведено исследование сопутствующей бактериальной флоры камней от 27 больных. Результаты показали, что 10 камней (37%) были инфицированы следующими бактериями: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Streptococcus spp. В 17 камнях бактерии обнаружены не были. Как ранее было показано, все выделенные бактерии обладали уреазной активностью и были способны формировать биопленку.
При изучении материла этих камней (27 образцов) на наличие в них микоплазм методом ПЦР установили, что из 10 камней, инфицированных бактериями, ДНК микоплазм была выявлена в 6 (60%) случаях, а из 17 неинфицированных — в 11 (64,7%).
Одновременно культуральным методом микоплазмы в виде «мини-форм» были выделены в 5 случаях, причем только из неинфицированных бактериями камней. Из инфицированных камней микоплазмы выделить не удалось.
ОБСУЖДЕНИЕ
При обследовании клинического материала, полученного от 31 пациента культураль-ным методом, микоплазмы были выделены от 8 (28,8%) пациентов. Частота выявления ДНК микоплазм была значительно выше — от 25 пациентов (80,6%). Разницу в полученных данных можно объяснить трудностями выделения микоплазм из клинического материала при персистентных инфекциях, а также возможной потерей способности расти в отсутствии эукариотической клетки, в результате длительного паразитизма, т.е. переходом в некультивируемое состояние.
На такую возможность указывают Baseman J.B. и Tully J.G. [5]. Известно также, что ПЦР выявляет не только нативную ДНК, но и ее фрагменты, поэтому эту реакцию не рекомендуют использовать для контроля излеченности после антибиотикотерапии. Следует заметить, что в предоперационном периоде и во время операции больные получали антибиотики. Выделение микоплазм из проб сывороток крови свидетельствует о генерализованном характере микоплазменной инфекции.
Известно, что в формировании очагов инфекции при различных хронических рецидивирующих инфекционных заболеваниях важную роль играют биопленки [1]. В нашей недавней работе (Романова Ю.М. и др., 2015) было показано, что микроорганизмы, инфицирующие почки, могут существовать в биопленке. В некоторых случаях с помощью ПЦР и электронной микроскопии в составе биопленки были обнаружены единичные клетки микоплазм. Данных о способности микоплазм образовывать биопленки на различных поверхностях в литературе нет. Можно предположить, что они могут входить в состав бактериальной биопленки и, возможно, в некоторой степени участвовать в ее формировании, тем более что клетки некоторых видов микоплазм имеют капсулу или окружены капсулоподобным веществом, содержащим полисахаридный комплекс.
Полученные нами данные свидетельствуют однако о том, что микоплазмы могут существовать в мочевых камнях при отсутствии других бактерий, при этом в виде моноинфекции даже несколько чаще, чем в составе смешанной бактериальной популяции.
Особое внимание заслуживает факт персистенции микоплазм в моче и мочевых камнях в виде клеток, образующих «мини-колонии». Такие культуры никогда не реверсировали в классические «fried-egg» формы. Подобное явление мы отмечали ранее [2] при посеве крови пациентов с персистентной урогенитальной микоплазменной инфекцией. В системе in vitro при контакте клеток микоплазм с гипериммунной антисывороткой мы наблюдали образование таких форм. При контакте клеток микоплазм с мочой от инфицированных и неинфицированных ими пациентов подобного явления не наблюдали. Было высказано предположение, что образование «мини-форм» происходит под воздействием гуморальных факторов иммунной системы.
Образование «мини-форм» демонстрирует феномен широкой изменчивости микоплазм и существование неизвестной ранее формы их персистенции в различных очагах в организме человека.
Л ИТЕРАТУРА
1. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетических контроль и система регуляции их развития. Генетика. 2004, 40 (11): 1445-1456.
2. Левина Г.А., Бархатова О.И., Горина Л.Г. и др. Необычные формы персистенции Mycoplasma hominis в организме инфицированных людей. Журн. микробиол. 2012, 4:104-109.
3. Раковская И.В., Горина Л.Г., Балабанов Д.Н. и др. Генерализованная микоплазменная инфекция у больных и носителей. Журн. микробиол. 2014, 2: 37-43.
4. Раковская И.В. Микоплазмы — возбудители микоплазменных инфекций. В кн.: Руководство по медицинской микробиологии. Под. ред. Лабинской А.С. и др. М., БИНОМ, 2010, с. 964-991.
5. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging and burdened by their notoriety. Emerging Infect.Dis. 1997, 3 (1): 21-32.
6. Ermolaeva S., Rakovskaya I., Miller G. et al. Non-thermal plasma affects viability and morphology of Mycoplasma hominis. J. Appl. Microbiol. 2014, 116: 1129-1136.
7. Deodhar L.P. Experimental mycoplasma infection in albino rats. J. Postgrad. Med. 1985, 31: 161-163
8. Falk L.,Fredlund H., Jensen J. Signs and symptoms of urethritis and cervicitis among women with or without Mycoplasma genitalium or Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm. Infect. 2005, 81: 73-78.
9. Horner P.J., Gilroy C.B., Thomas B.J. et al. Association of Mycoplasma genitalium with acute nongonococcal urethritis. Lancet. 1993, 342: 582-585.
10. Ross J.D., Jensen J.S. Mycoplasma genitalium as a sexually transmitted infection: implications for screening, testing, and treatment. Sex Transm. Infect. 2006, 82: 269-271.
11. Taylor-Robinson D., Gilroy C.B., Thomas B.J. et al. Mycoplasma genitalium in chronic nongonococcal urethritis. Int. J. STD AIDS. 2004,15: 21-25.
12. Wong S.S., Yuen K.Y Acute pyelonephritis caused by Mycoplasma hominis. Pathology. 1995, 27: 6163.
13. Yuce A., Yucesoy M., Yucesoy K. et al. Ureaplasma urealyticum-induced urinary tract stones in rats. Urol. Res. 1996, 24 (6): 345-348.
Контактная информация: Бархатова О.И., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-44-70
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Ю.А.Белая1, О.Ф.Белая2, В.Г.Петрухин1, М.С. Вахрамеева1, С.М.Быстрова1, А.В.Пронин1
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПЕРСИСТЕНЦИИ HELICOBACTER PYLORI В ОРГАНИЗМЕ
Федеральный Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова
Приводятся обобщенные результаты 15-летних проспективных исследований частоты встречаемости и динамики циркуляции патогенетически значимых ЛПС/О-антигенов, высокомолекулярных белков, включая CagA, и VacA Helicobacter pylori в биологических средах организма у больных желудочно-кишечными заболеваниями и бессимптомных добровольцев в связи с воздействием внутренних и внешних факторов. Установлены особенности циркуляции антигенов и ответной иммунной реакции организма, отражающие их взаимодействие в тандеме паразит—хозяин, риск и прогноз возможных обострений в процессе длительной персистенции Helicobacter pylori в организме.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 106—112
Ключевые слова: Helicobacter pylori, персистенция, свободные антигены, иммунные комплексы, факторы воздействия, прогноз обострений, ЛПС/О-антиген, CagA, VacA
Yu.A.Belaya1, O.F.Belaya2, V.G.Petrukhin1, M.S.Vakhrameeva1, S.M.Bystrova1, A.V.Pronin1
IMMUNOLOGIC MONITORING OF HELICOBACTER PYLORI PERSISTENCE IN THE ORGANISM
1Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, 2Sechenov First Moscow State Medical University, Russia
Generalized results of15-year prospective studies of frequency of occurrence and dynamics of circulation ofpathogenetically significant LPS/O-antigens, high molecular weight proteins, including CagA, and VacA of Helicobacter pylori in biological media of organism in patients with gastrointestinal diseases and asymptomatic volunteers due to effects of external and internal factors are presented. Features of antigen circulation and reciprocal immune reaction of the organism are established, that reflect their interaction in the parasite-host tandem, risk and prognosis of possible complications in the process of long-term persistence of Helicobacter pylori in the organism.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 106—112
Key words: Helicobacter pylori, persistence, free antigens, immune complexes, effect factors, complication prognosis, LPS/O-antigen, CagA, VacA
