CC BY
10
Актуальт проблеми сучасно! медицини
УДК: 616.24-002.5:616.9
Цапенко Ю.П., Бойко М.Г., Алieва Н.М., Красношапка Ю.О., Буслик Т. В., Краевська О.О., НовЫов С.В.
ПЕРЕВАГА ШТАМ1В M. TUBERCULOSIS РОДИНИ BEIJING СЕРЕД ВПЕРШЕ ВИЯВЛЕНИХ ХВОРИХ ТУБЕРКУЛЬОЗОМ В ПОЛТАВСЬК1Й ОБЛАСТ1
Вищий державний навчальний заклад Украши «УкраТнська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
Метою досл{дження було проведення генотитчного анал{зу та вивчення розповсюдженостг штам{в M. Tuberculosis родини Beijing серед вперше виявлених хворих туберкульозом в Полтав-ськш област1. Матерiали i методи. У дослiдженнi брали участь хворi i3 вперше виявленим туберкульозом легень (n=100). Визначення належностi iзолятiв М. Tuberculosis до родини Beijing проводилося за допомогою полiмеразноí ланцюговог реакцп (ПЛР). Продукт амnлiфiкацií аналiзували за допомогою електрофорезу в 1%-му агарозному гелi. Результати та гх обговорен-ня. Частота тфтування штамами родини Beijing у дослiджуванiй грут хворих на вперше ви-явлений туберкульоз по Полтавськш областi сягала 70,8 %. Серед вперше виявлених хворих туберкульозом резистенттсть в 2 рази част1ше спостеркалася в iзолятiв родини Beijing порiв-няно з тшими штамами M. Tuberculosis. Також спостеркався бшьший показник полiрезистентностi серед штамiв родини Beijing. Висновок. Виражена асоцшоватсть генотипу Beijing з резистенттстю до основних протитуберкульозних препарат1в потребуе впроваджен-ня молекулярно-генетичног дiагностики в фтизiатричну практику.
Ключов1 слова: туберкульоз, молекулярна бюлопя, родина Beijing.
Робота е фрагментом науково-дослщноТ теми НДР «КлЫко-функцюнальж та морфолопчж особливост переб1гу захворю-вань рестраторноТ системи (туберкульозу, саркоТдозу, дисемшованих процес1в та ХНЗЛ) та розробити методи корекцп виявлених порушень на р1зних етапах л1кування, реабт1тацп та профтактики)», № держ.реестрацп 0110U008151.
цш близько 40 % гешв i доведено ймовiрнi фун-
Вступ
Молекулярна кл^чна дiагностика — наука, що виявляе причини та мехашзми шфекцшних та соматичних захворювань на молекулярному piBrn шляхом визначення гешв i продук^в Тх дiя-льност — бтюв та нукле'Тнових кислот, перебу-вае на етап бурхливого розвитку. Молекулярна бюлопя вважаеться молодою наукою. Не дивля-чись на вщносну молодють, за роки свого юну-вання вона здшснила значний вплив на розвиток науки про шфекцшш хвороби i зокрема на розвиток фтизiатрiТ [10].
До 1990 року вщмшнють мiж окремими штамами збудника туберкульозу визначалася пере-важно за допомогою фаготипування та по характеру лкарсько'Т стшкосп, що значно обмежува-ло можливостi епщемюлопчних дослiджень, оскiльки кiлькiсть фаготипiв M. tuberculosis (МБТ) значно обмежена, а метод антибютикограми за-стосовуеться ттьки по вiдношенню до медика-ментозно-стшких штамiв [5, 7].
З середини 80-х рош ХХ ст. проводилися числены дослщження з вивчення геному мкобак-терiй туберкульозного комплексу — M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti. Визначе-на повна послщовнють геномiв M. leprae та двох штамiв M. tuberculosis, зокрема лабораторного штаму H37Rv i клiнiчного iзоляту з високою вiру-лентнiстю CDC1551 [4, 5, 8].
Геном МБТ був повнютю розшифрований в 1998 роц групою авторiв пiд керiвництвом S. Cole. Вiн мiстить близько 4000 рамок зчитуван-ня, як кодують бiлки та 4 411 529 п. н., 65,6 % яких становлять гуанш i цитозин [4, 8]. Пюля розшифрування геному H37Rv визначено функ-
кцп ще 20 % Í3 них. Одшею з особливостей геному M. tuberkulosis е присутнiсть reHiB, що бага-торазово дублюють функцiонування ключових ферментних систем. Доведено, що МБТ синте-зуе всi необхiднi складовi для обмiну речовин: незамiннi амшокислоти, вiтамiни, ферменти i кофактори. Генний апарат M. tuberculosis сприяе швидкш адаптацп мiкроорганiзму до рiзких змш довкiлля [8]. В наш час молекулярна генетика МБТ вважаеться одшею з найбтьш вивчених серед шших мiкроорганiзмiв [4].
Вивчення циркуляцп i розповсюдження шта-мiв туберкульозу як споаб епiдемiчного контролю е важливою задачею, котра не виршена до цього часу. Завдяки генетичним вщмшностям серед штамiв M. tuberculosis можна встановити вогнища, шляхи передачi та трансмiсiю штамiв МБТ [1, 4, 7, 8].
Методи генотипування M. tuberculosis, як за-стосовуються в молекулярнiй епщемюлоги, до-сить рiзнi. Мкобактерп, що належать до туберкульозного комплексу, генетично досить консер-вативш. Для них характерна щентична нуклео-тидна послiдовнiсть гена 16S РНК, i вони на 99,9 % гомолопчш на генетичному рiвнi. Основним джерелом 'х генетичного полiморфiзму е мобн льнi генетичн елементи ( IS — елементи, про-фаги), елементи, що повторюються (DR, MIRU) та делеци [1, 8].
Золотим стандартом для вивчення генетич-них перебудов M. tuberculosis е типування по полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагметчв хромосомно'' ДНК, якi мiстять IS6110. Окрiм цьо-
В1СНИК ВДНЗУ «Украг'нська медична стоматологгчна академгя»
го, застосовуються методи, заснован на полiме-разнм ланцюговм реакцп: типування по числу спейсорних послщовностей DR — регюну (спо-лiнготипування), по варiабельному числу танде-мних повторiв (VNTR), по числу розаяних по-BTOpiB (MIRU), полiморфну збагачену G-C повторами послщовысть (PGRS) [1, 4, 5, 7, 8].
Методи молекулярноТ епщемюлогп дали та-кож новi можпивостi для встановлення асоцiацiТ мiж генотипом збудника й особливостями ключного перебiгу захворювання, вивчення чинниюв ризику трансмiсiТ медикаментозно резистентних штамiв i штамiв iз пiдвищеною патогеныстю. Не-сприятлива епiдемiологiчна ситуацiя з туберку-льозу залежить вiд поширеносп, у першу чергу, штамiв генетичноТ родини Beijing (W) [2, 3, 4, 5, 6, 8, 9]. Генотип Beijing (W) був виявлений в ба-гатьох частинах св^. Вперше даний штам був виявлений в КитаТ, а подальшi дослщження про-демонстрували широку розповсюдженнiсть да-ного сiмейства в краТнах Ази та минулого Радян-ського Союзу [2, 3, 4, 5]. Штам W став причиною бтьше 500 випадюв захворювання в Нью-Йорку [5]. Доведено, що коли штам родини Beijing вперше упроваджуеться в популяцю вш швидко починае розповсюджуватися. Прикладом е спа-лах туберкульозу на островi Гран-Канарiя в 1993 роц^ коли пiспя потрапляння на острiв пацiента, iнфiкованого штамом родини Beijing, потрiбно було лише 3 роки для швидкоТ дисемiнацiТ дано-го генотипу [3]. В Росмськм ФедерацiТ генотип Beijing е превалюючим майже повсюдно - це було виявлено дослщженнями в багатьох округах [4]. За даним ряду експеримен^в, штам мае пщвищену вiрулентнiсть i можпивiсть обiйти iму-нолопчний захист органiзму, та несе загрозу розвитку розповсюдження множинноТ лiкарськоТ спйкос-п [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9].
pUC19/Mspl 12 3 4
Мета дослщження
Проведення генотипового аналiзу та вивчення розповсюдженост штамiв M. Tuberculosis ро-дини Beijing серед вперше виявлених хворих ту-беркульозом в Полтавськiй областi.
Матерiали i методи
У дослiдженнi брали участь хворi iз вперше виявленим туберкульозом легень (n=100) на базi Полтавського обласного ктычного протитубер-кульозного диспансеру протягом травня - верес-ня 2012 року.
Поав, культивування, щентифка^я та визна-чення чутливостi мкобактерм до протитубер-кульозних препаратiв були проведен у бактерiологiчнiй лабораторiТ ПОКТД зпдно з наказом МОЗ УкраТни № 45 вiд 06.02.02 р. Дослщження медикаментозноТ стiйкостi до препара^в першого та другого ряду препара^в здiйснювалося з використанням методу абсо-лютних концентрацiй на щтьному живильному середовищi Левенштейна-Йенсена у вщповщносп до зазначеного наказу.
На базi iнституту свинарства i агропромисло-вого виробництва НацюнальноТ академiТ аграр-них наук УкраТни проводилося визначення на-лежност iзолятiв М. Tuberculosis до родини Beijing за допомогою полiмеразноТ ланцюговоТ реа-кцiТ (ПЛР), яка базуеться на визначенн IS 6110 шсерцп у мiжгеннiй dnaA - dnaD дiлянцi. Продукт амплiфiкацiТ аналiзували за допомогою елек-трофорезу в 1%-му агарозному гелк За наявност шсерци розмiр аплiфiкованого продукту складав 2000 пар нуклеотидiв, що вiдповiдало належностi збудника до родини Beijing. За вщсу-тност iнсерцiТ розмiр амплiфiкованого фрагменту дорiвнював 537 п.н. (рисунок 1).
5 6 7 9 10 lkb
Рисунок. Електрофореграма зразюв ДНКM. Tuberculosis: на 1, 2, 3, 5, 7, 10 дорожках ДНК належить до родини Beijing, 1kb -маркер молекулярноТмаси; стрлками вказан1 розм1ри фрагмент1в 2О00, 537 пар нуклеотид1в.
Актуальт проблеми сучасно!" медицини
Результати та ïx обговорення.
В результатi проведено!' роботи всього культур було отримано вщ 100 хворих з вперше ви-явленим туберкульозом легень. Одинадцять культур внаслщок контамшацп або шших причин були виключенi з подальшого аналiзу. Таким чином, аплiфiкацiя ДНК iзолятiв, з метою щентифн кацп штамiв родини Beijing, була проведена на матерiалi 89 культур M. Tuberculosis хворих з вперше виявленим туберкульозом легень. Належнють до родини Beijing виявлено 63 зраз-ках (70,8 %). Належнють iзоляту до шших родин M. Tuberculosis визначено у 26 (29,2 %) випад-
Резистентнсть до протит
ках. Середнш вк пацieнтiв коливався у межах 44,7±1,4 рокiв. Серед па^етчв чоловiкiв було 79,8 %, жiнок - 18 осiб (20,2%). Мешканц мiста Полтави склали 36,9 %, iншi (73,1 %) були меш-канцями Полтавсько'1 областi. У 8 па^етчв (8,9 %) була наявна В1Л- iнфекцiя.
В результат проведеного аналiзу резистент-ностi M. Tuberculosis до хiмiопрепаратiв в^^ча-емо в 2 рази бтьший рiвень резистентностi мн кобактерiй в родин Beijing (38,1 %) у порiвняннi з штамами iнших генетичних груп (19,23 %) (p<0,001) (таб. 1).
Таблиця 1
кульозних npenapamie wmaMie родини Beijing та нших родин
Резистентнють або чутливють Генотип
Beijing 1нший
Резистентнють 24/63 (38,1%) 5/26 (19,23%)
Чутливють 19/63 (30,16%) 15/26 (57,69%)
Монорезистентнють 7/63 (11,11%)
Полiрезистентнiсть 17/63 (27%) 5/26 (19,2%)
Чутливими до протитуберкульозних препара-^в серед штамiв шшого генотипу були 57,69%, що в 1,9 рази перевищувала чутливють серед штамiв родини Beijing (30,16%) (p<0,005). Таким чином, результати нашого аналiзу пщтверджу-ють данi попереднiх дослiджень [2, 3, 6, 9 та шш.] про виражену асоцшованють генотипу Beijing з резистентнютю до основних протитуберкульозних препара^в. При подальшому аналiзi монорезистентнiсть (стiйкiсть до одного препарату) в^^чалася лише серед штамiв родини Beijing, i становила 11,11 %. В 1,4 рази переви-щував показник полiрезистентностi (стiйкiсть до двох i бтьше препара^в) серед штамiв родини Beijing (27 %) у порвняннi з штамом шшого генотипу (19,2 %) (p<0,05) . При цьому з них 6 iзоля-тiв бактерiй (9,5 %) в родинi Beijing були мульти-резистентними (стiйкими до рифампщину та iзо-нiазiду одночасно), а серед iзолятiв iншого генотипу цей показник становив 7,6 %. Поряд з цим, серед полiрезистентних iзолятiв бактерiй родини Beijing стшкють до препаратiв другого ряду спо-стерiгалася у 9 (14,2 %) штамiв, тодi як серед iзолятiв iншого генотипу стiйкiсть до другого ряду була в^^чена у 3 (11,5 %) штамiв.
Серед 8 iзолятiв вiд хворих туберкульозом з наявною ВIЛ-iнфекцiею 2 iзоляти вiдносилися до iншого генотипу й були чутливими протитуберкульозних хiмiопрепаратiв. В свою чергу ^i 6 iзолятiв бактерiй були штамами родини Beijing, та мали вс стшкють до препара^в першого та другого рядiв.
Висновок
1. Частота шфкування штамами родини Beijing у дослщжуванш групi хворих на вперше виявлений туберкульоз по Полтавськш област ся-гала 70,8 %.
2. Серед вперше виявлених хворих туберку-льозом резистентнiсть в 2 рази часпше спосте-р^алася в iзолятiв родини Beijing (38,1%) порiв-няно з iншими штамами M. Tuberculosis
(19,23%).
3. Показник полiрезистентностi був бтьший серед штамiв родини Beijing (27 %) у порiвняннi з штамом iншого генотипу (19,2 %).
4. Виражена асоцшованють генотипу Beijing з резистентнютю до основних протитуберкульозних препара^в потребуе впровадження молеку-лярно-генетичноТ дiагностики в фтизiатричну практику.
Лiтература
1. Андреевская С.Н. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского Региона в Москву и Московскую область) / С.Н. Андреевская, Л.Н. Черноусова, Т.Г. Смирнова [и др.] // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2006. - № 1. - С. 29-35.
2. Асмолов О.К. Медикаментозна резистентнють мкобактерш ту-беркульозу в Одеськш област УкраТни та фактори ризику роз-повсюдження резистентного туберкульозу : дат перспективного ,двор1чного дослщження / О.К. Асмолов, В.В. Нколаевський, В.Й. Кресюн [та ш.] // УкраТнський пульмонолопчний журнал. -
2005. - № 2. - С. 9-15.
3. Балабанова Я.М. Преобладание штамов Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing и факторы риска их трансмиссии в Самарской области / Я.М. Балабанова, В.В. Николаевский, М. Радди [и др.] // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. -
2006. - № 2. - С. 31-36.
4. Баранов А.А. Приминение методов молекулярной биологии для исследования микобактерии туберкулёза / А.А. Баранов, А.О. Марьяндышев // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. - № 4. - С. 3-8.
5. Карачунский М.А. Молеклярная эпидемиология туберкулёза / М.А. Карачунский, Л.Н. Черноусова // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2007. - № 4. - С. 3-8.
6. Ляшенко О.О. Мкобактерп рiзних генотишв та Тх роль в кшшч-нш картин туберкульозу легень : спец. 14.01.26. «Фтизiатрiя» / О.О. Ляшенко. - К., 2008. - 20 с.
7. Матракшин А. Г. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis из Республики Тыва / А.Г. Матракшин, Е.М. Месько, Н.К. Белякова [и др.] // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2004. - № 3. - С. 37-40.
8. Пшак В.П. Туберкульоз: генетичш аспекти взаемодп оргашзму людини i М. tuberculosis / В.П. Пшак, С.П. Польова, Ю.1. Бажо-ра, М.М. Чеснокова // 1нтегративна антрополопя. - 2011. - № 1. - С. 4-11.
9. Тунгусова О.С. Влияние лекарственной устойчивости на фит-нес микобактерий туберкулёза генотипа W- Beijing / О.С. Тунгу-сова А.О. Марьяндышев, Д. А. Каугант [и др.] // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2005. - № 8. - С. 46-50.
10. Чумак А.А. Молекулярно-генетичш дослщження в лабораторий дiагностицi на сучасному етап / А.А.Чумак // Лабораторна дiаг-ностика. - 2009. - № 1. - С. 3.
HidП¡К ВДНЗУ «Украгнсъка медична стоматологгчна академ1я»
Реферат
ПРЕИМУЩЕСТВО ШТАММОВ M. TUBERCULOSIS СЕМЕЙСТВА BEIJING СРЕДИ ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННЫХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЁЗОМ В ПОЛТАВСКОЙ ОБЛАСТИ
Цапенко Ю.П., Бойко Н.Г., Алиева Н.Н., Красношапка Ю.О., Буслик Т.В., Краевская А.А., Новиков С.В. Ключевые слова: туберкулёз, молекулярная биология, семейство Beijing.
Целью исследования было проведение генотипического анализа и изучение распостранения штаммов M. Tuberculosis семейства Beijing среди впервые выявленных больных туберкулёзом в Полтавской области. Материалы и методы. У исследовании принимали участие больные с впервые выявленным туберкулёзом лёгких (n=100). Определение отношения изолятов M. Tuberculosis к семейству Beijing проводилось с помощью полимеразной цкпной реакции (ПЦР). Продукт аплификации анализировали с помощью электрофореза в 1% -ом аграрном геле. Результаты и их обсуждение. Частота инфицирования штаммами семейства Beijing у исследованной группе больных на впервые выявленный туберкулёз по Полтавской области становила 70,8 %. Среди впервые выявленных больных туберкулёзом резистентность в 2 раза чаще наблюдалось у изолятов семейства Beijing в сравнении с другими штамамми M. Tuberculosis. Также наблюдался больший показатель полирезистентности среди штаммов семейства Beijing. Вывод. Выраженная ассоциативность генотипа Beijing с резистентностью к основным противотуберкулёзным препаратам требует внедрения молекулярно-генетической диагностики во фтизиатрическую практику.
Summary
PREVALENCE OF M. TUBERCULOSIS STRAINS OF BEIJING GENUS AMONG PATIENTS WITH FIRSTLY DIAGNOSED TUBERCULOSIS IN POLTAVA REGION
Tsapenko Y.P., Boiko M.G., Alieva N.M., Krasnoshapka Y.O., Buslyk T.V., Kraevska O.O., Novikov S.V. Key-words: tuberculosis, molecular biology, Beijing genus.
The objective of the research is to carry out genotypic analysis and study of M. Tuberculosis strains of Beijing genus distribution among the patients with firstly diagnosed tuberculosis in Poltava region.
Materials and methods. The investigation involved patients with firstly diagnosed tuberculosis (n=100). The polymerase chain reaction (PCR) has been used to determine isolates of M. Tuberculosis strains belonging to Beijing genus. Amplification products have been analyzed by electrophoresis in 1% of agarose gel. The results and their discussion. The frequency of M. Tuberculosis strains of Beijing genus infecting in research group of patients with firstly diagnosed tuberculosis was 70,8 % in Poltava region. Among the patients with firstly diagnosed tuberculosis the resistance has been observed to be twice frequent in isolates of Beijing genus compared with other M. Tuberculosis strains. Higher index of polyresistance among strains of Beijing genus has been also observed. Conclusion. Marked associativity of Beijing genotype with the resistance to the main anti-tubercular pharmaceuticals requires molecular genetic diagnostics introduction into phthisiology practice.
