CC BY
61
© О. В. Філатова, М. Г. Бойко УДК 616. 24-002. 5-08:575. 191 О. В. Філатова, М. Г. Бойко
РОЛЬ ГЕНЕТИЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ В ЛІКУВАННІ ТУБЕРКУЛЬОЗУ
ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія» (м. Полтава)
Публікація є фрагментом науково-дослідної роботи «Вивчити ефективність організації лікування хворих на туберкульоз легень і вдосконалити заходи щодо її поліпшення» кафедри фтизіатрії з дитячою хірургією, № держ. реєстрації 0108U000216.
Вступ. Туберкульоз представляє собою хворобу, що є дуже поширеною у всьому світі. За оцінкою ВООЗ, третина населення Землі інфікована Mycobacterium tuberculosis [ 1,2,3]. М. tuberculosis може адаптуватися до дії чинників імунної відповіді організму хазяїна антибіотиків за допомогою точкових мутацій [4,5]. Останнє десятиліття минулого століття було відмічене появою і початком широкого поширення лікарсько-стійких штамів збудника туберкульозу у багатьох країнах світу. Застосування методів споліготипувания аналізу для епідеміологічного типувания штамів М. tuberculosis дозволило визначити сімейства споріднених штамів і створити комп’ютерні бази даних, що містять інформацію про генотипові профілі штамів [6]. Серед генетичних ліній/сімейств, що виділяються усередині виду М. tuberculosis, генотип Beijing характеризується генетичною однорідністю та широким географічним поширенням [7,8]. Нині, цей генотип привертає увагу, оскільки штами Beijing демонструють підвищену вірулентність [9,10,11], асоціацію з лікарською стійкістю [12,13] та високу активність [14,15]. Популяційна структура М. tuberculosis робить можливим аналіз його окремих ліній. В зв’язку з цим, необхідне досконале вивчення особливостей генетичної різноманітності і еволюційного процесу М. tuberculosis, генетичних механізмів розвитку лікарської стійкості і пошук нових інформативних маркерів [16,17].
Мета дослідження. 1. Вивчити мікроеволюційні та макроеволюційні зміни в геномі і розробити най-ефекивніші підходи для моніторингу циркулюючих штамів М. tuberculosis. 2. Провести аналіз генома М. tuberculosis генотипу Beijing. 3. Вивчити генетичні основи розвитку лікарської стійкості як форми мікроеволюції М. tuberculosis. 4. Розробити методологічні підходи на основі інформативних молекулярних маркерів для ефективного моніторингу і діагностики лікарської стійкості циркулюючих штамів М. tuberculosis. генотипу Beijing.
Об’єкт і методи дослідження. У роботі були використані препарати ДНК штамів М. tuberculosis 60-х хворих, виділених в лабораторії Полтавського обласного клінічного протитуберкульозного
диспансеру від жителів Полтави та полтавської області. Визначення мутацій стійкості до протитуберкульозних препаратів проводили з використанням методів мультиплексною аллель-специфической ПЦР (МАС-ПЦР (гени rpoB (кодони 516, 526, 531), (katG315, embB306) і ПЦР-ПДРФ з використанням рестриктаз rnspl (katG315).
Результати досліджень та їх обговорення. Більше штамів М. tuberculosis було вивчене методами IS6110 - RFLP і споліготипування в лабораторії полтавського обласного клінічного протитуберкульозного диспансеру в 2012-2013 рр. Близько половини (42 всіх вивчених штамів належали до генетичного сімейства Beijing. Умови обох варіантів пропонованого методу МАС-ПЦР (однокроковий і гніздовий) були оптимізовані для досягнення максимальної специфічності на 40 зразках ДНК, що мали наступний розподіл аллелей rpoB : дикий тип - 10, 531TTG - 4, 531TGG - 6, 516GTC - 4, 516TAC - 2, 516GGC - 1, 522CAG - 3, 526TAC - 4, 526GAC - 3, 526CTC - 3. Аналіз 60 проб ДНК RIF- стійких штамів, виділених від хворих, був проведений методом простої однокроковою МАС- ПЦР Мутації в одному з трьох вивчених кодонів rpoB 516б 526 або 531 були виявлені у 48 (80%) штаммів. Таким чином можемо зауважити, що метод забезпечує досить високу чутливість визначення стійкості МБТ до ріфампицину. Аналіз методом МАС-ПЦР виявив мутації в rpoB у 7 з 45 RIF- чутливих штамів. Аналіз проб з 40 клітинних лізатів був проведений методом гніздової аллель-специфической ПЦР У усіх випадках, результати аналізу лізатів і очищеної ДНК співпадали. Умови розробленого методу МАС-ПЦР були відпрацьовані на 60 штамах, що мали такий розподіл алелей: katG315: дикий тип (AGC) - 35, ACC - 25, як було встановлено раніше методом ПЦР з використанням рестриктази rnspl. Аналіз проб неочищеною ДНК був проведений на вибірці з 30 клітинних лізатів. У усіх випадках результати МАС-ПЦР аналізу katG315 для лізатів і очищеної ДНК тих же штамів співпадали. Відмічено корисні особливості розроблених методів для аналізу генів katG і rpoB. Аналіз методом МАС-ПЦР гена rpoB забезпечує розширений мутаційний аналіз кодонів 516 і 526. Аналіз методом МАС-ПЦР гена katG дозволяє визначити дві найбільш важливі мутації стійкості в цьому гені, пов’язані із стійкістю до изониазиду. Варіант katG 315 - ACC є найбільш частим у світі, особливо в регіонах з високим рівнем присутності резистентних штамів (табл., рис.).
Таблиця
Послідовності праймерів, використаних для аналізу генів резистентності
Ген Праймер, зонд Послідовність (5’-)
katG katG1 F AGCTCGTATGGCACCGGAAC
katG4RB AACGGGTCCGGGATGGTG
katg0F GCAGATGGGGCTGATCTACG
katg4R AACGGGTCCGGGATGGTG
katg5R ATACGACCTCGATGCCGC
rpoB ROF GTCGCCGCGATCAAGGA
RIR TGACCCGCGCGTACAC
R516B GCTGAGCCAATTCATGGA
R526B GTCGGGGTTGACCCA
R531B ACAAGCGCCGACTGTC
40
35
30
25
20
15
10
5
0
□ Стійкість до ізоніазіду 38 (63,4%)
---------,---------f
□ Стійкість до ріфампіцину 22 (36,6%)
Висновки. Розроблений метод мультиплек-сної аллель-специфической ПЦР для аналізу основних мутацій резистентності в генах rpoB і katG ефективний для виявлення більшості мультире-зистентних штамів М. tuberculosis, циркулюючих в Полтаві та Полтавській області. Mутації резистентності в katG315, і rpoB531 найчастіше зустрічаються у штамів генотипу Beijing порівняно з штамами інших генотипів. Розроблені методологічні підходи на основі застосування комплексу інформативних
Рис.1. Стійкість до окремихпрепаратів.
молекулярних маркерів можуть бути використані для проведення філогенетичних і филогеографических досліджень, ефективного моніторингу і діагностики лікарської стійкості циркулюючих штамів М. tuberculosis.
Перспективи подальших досліджень. Наступні дослідження будуть направлені на подальші генетичні розробки для корегування лікування різних форм туберкульозу.
література
1. Алексеева Г. И. Mониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в республике Саха (Якутия) / Г. И. Алексеева, А. Ф. Кравченко // Пробл. туб. и болезней легких. - 2007. № 7. - с. 30-33
2. Андреевская С. Н. Влияние генотипа M. tuberculosis на выживаемость мышей при экспериментальном туберкулезе / С. Н. Андреевская, JI. H. Черноусова, Т. Г. Смирнова [и др.] // Пробл. туб. и болезней легких. -2007. - № 7- С. 45-50.
3. Васильева, И. А. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза / И. А. Васильева, JI. H. Черноусова, А. С. Заседателев [и др.] // Пробл. туб. - 2002. - №б. -С. 21-24.
4. Винокурова M. К. Клиническая структура впервые выявленного туберкулёза органов дыхания в республике Саха (Якутия) / M. К. Винокурова, А. А. Корнилов, Е. А. Иванов // Туберкулёз сегодня : Тез. докл. VII Российского съезда фтизиатров. - M., 2003. - С. 9.
5. Голышевская В. И. Применение новых микробиологических технологий в диагностике туберкулеза / В. И. Голышев-ская, А. А. Корнеев, Л. Н. Черноусова [и др.] // Пробл. туб. - 199б. - № б. - С. 22- 25.
6. Гращенкова О. В. Совершенствование эпидемиологического анализа при туберкулезной инфекции / О. В. Гращенко-ва, А. В. Васильев // Пробл. туб. - 2000. - №б. - С. ЗЗ-Зб.
7. Джекобе У. Р. Mолекулярно-генетические подходы к идентификации факторов вирулентности Mycobacterium tuberculosis. / У. Р. Джекобе, Б. Р. Блум // Туберкулез. Патогенез, защита, контроль; пер. с англ.; под ред. Б. Р. Блума. -M. : Mедицина, 2002. - С. 271-290.
8. Mишин В. Ю. Эффективность лечения туберкулеза легких, вызванного микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью / В. Ю. Mишин, В. И. Чуканов, И. А. Васильева // Пробл. туб. - 2002. - № 12. - С. 18-22.
9. Рабухин А Е. Химиотерапия больных туберкулезом / А. Е. Рабухин. - M. : Mедицина, 1970. - 174 с.
10. Самойлова А. Г. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза актуальная проблема фтизиатрии (обзор литературы) / А. Г. Самойлова, А. О. Mарьяндышев // Пробл. туб. и болезней легких. - 2005. - № 7. - С. 3-9.
11. Соколова Г. Б. Клинико-рентгенологические и бактериологические особенности лекарственно-резистентного туберкулеза / Г. Б. Соколова, Н. В. Богадельникова, M. Г Бирон [и др.] // Пробл. туб. и болезней легких. - 200б. - № 12. -С.1б-20.
12. Филинюк О. В. Mножественно-лекарственно-устойчивый туберкулез легких: медико-социальные особенности и эффективность стационарного этапа лечения / О. В Филинюк, Г. В. Янова, А. К. Стрелис // Пробл. туб. и болезней легких. - 2008. - №8. - С. 23-29.
13. Casart У IS6110 in oriC affects the morphology and growth of Mycobacterium tuberculosis and attenuates virulence in mice / Y Casart, L. Turcios, I. Florez // Tuberculosis (Edinb). - 2008. - V. 88, № б. - P. 545-552.
14. Drobniewski F. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia / F.
Drobniewski, У Balabanova, V. Nikolayevsky [et al.] // JAMA. 2005. - V. 293, № 22. - P. 272б-2731.
15. Kamerbeek J. Simultaneous detection and strain differetiatin of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.
/ J. Kamerbeek, L. Shouls, A. Kolok [et al.] //J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. -P. 907-914.
16. Lopez BA Marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes / B. Lopez, D. Aguilar, H. Orozco [et al.] // Clin. Exp. Immunol. 2003. - V. 133, №. l. - Р. 30-37.
УДК б1б. 24-QQ2. 5-08:575. 191
роль генетичних досліджень в лікуванні туберкульозу
Філатова О. в., Бойко М. Г.
Резюме. Обстежено культури харкотиння б0 хворих на вперше діагностований деструктивний туберкульоз легень. Результати дослідження свідчать про те, що близько половини (42 всіх вивчених штамів належали до генетичного сімейства Beijing. Аналіз б0 проб ДНК RIF- стійких штамів, виділених від хворих, був проведений методом простої однокрокової MАС-ПЦR Mутації в одному з трьох вивчених кодонів rpoB 51бб 52б або 531 були виявлені у 48 (80%) штаммів. Зауважемо, що даний метод забезпечує досить високу чутливість визначення стійкості MBI до рифампицину. Відмічено корисні особливості розроблених методів для аналізу генів katG і rpoB. Аналіз методом MАС-ПЦР гена rpoB забезпечує розширений мутаційний аналіз кодонів 51б і 52б. Аналіз методом MАС- ПЦР гена katG дозволяє визначити дві найбільш важливі мутації стійкості в цьому гені, пов’язані із стійкістю до ізониазиду. Варіант katG 315 - ACC є найбільш частим в Полтаві та Полтавській області.
Ключові слова: генетика, туберкульоз, ізоніазід, ріфампіцин.
УДК б1б. 24-QQ2. 5-08:575. 191
роль генетических исследований в лечении туберкулеза
Филатова Е. в., Бойко н. Г.
Резюме. Обследовано культуры мокроты б0 больных с впервые диагностированным деструктивным туберкулезом легких. Результаты исследования свидетельствуют о том, что около половины (42 всех изученных штаммов принадлежали к генетическому семейства Beijing. Анализ б0 проб ДНК RIF-устойчивых штаммов, выделенных от больных, был проведен методом простой одношаговой MАС-ПЦР. Mутации в одном из трех изученных кодонов rpoB 51бб 52б или 531 были обнаружены у 48 (80%) штаммов. Заметим, что данный метод обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения устойчивости MBI к рифампицину. Отмечено полезные особенности разработанных методов для анализа генов katG и rpoB. Анализ методом MАС-ПЦР гена katG позволяет определить две наиболее важные мутации устойчивости в этом гене, связанные с устойчивостью к изониазида. Вариант katG 315 - ACC является наиболее частым в Полтаве и Полтавской области.
Ключевые слова: генетика, туберкулез, изониазид, рифампицин.
UDC б1б. 24-QQ2. 5-08:575. 191
Role of Genetic Researches in Tuberculosis Treatment
Filatova O. V., Boyko M. G.
Summary. Sputum cultures were examined 6Q patients with newly diagnosed destructive pulmonary tuberculosis. The study shows that about half (42 of all studied strains belonged to the genetic family Beijing. Analysis of 6Q DNA samples RIF- resistant strains isolated from patients, was conducted by a simple one-step RT-PCR MAC. Mutations in one of the three studied codons rpoB 516Ь 52б or 531 were detected in 48 (80%) strains. Note that this method provides a sufficiently high sensitivity of MBT resistance to rifampicin. Noted useful features of the developed methods for the analysis of gene katG and rpoB. analysis by MAS-PCR gene rpoB provides extended mutation analysis of codons 51б and 52б. Analysis by MAC katG gene PCR to determine the two most important resistance mutations in this gene associated with resistance to isoniazid. Option katG 315 - ACC is the most common in Poltava and Poltava region.
Key words: genetics, tuberculosis, isoniazides, rifampicines.
Стаття надійшла б. 03. 2013 р.
Рецензент - проф. Ярешко А. Г.
