© Коллектив авторов, 2022
Пичугин А.В.1, Подсвирова С.А.2, Ушакова Е.И.1, Спирин Д.М.2, Лебедева Е.С.1, Атауллаханов Р.И.1
Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», 119991, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Блокада иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade) для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями успешно и широко внедряется в практической онкологии. По сути, это направление иммунотерапии представляет собой снятие супрессии с Т-клеток с помощью антител к ингибиторным рецепторам CTLA-4 или PD-1 (PD-L1), что позволяет реактивировать противоопухолевые Т-клеточные иммунные реакции и может приводить к значительным клиническим эффектам. Такая иммунотерапия позволяет спасти пациентов даже в IV стадии онкологического процесса. И все же эффективность чекпойнт-блокады недостаточно высока. Полная регрессия заболевания и полное выздоровление происходят лишь у небольшого процента пациентов. У большинства пациентов с солидными опухолями, получавших терапию чекпойнт-блокаторами, либо не было клинического эффекта, либо наблюдался частичный, относительно кратковременный эффект.
Одна из самых распространенных причин, препятствующих эффективной элиминации опухоли при чекпойнт-блокирующей терапии, состоит в том, что миелоидные клетки опухолевого микроокружения создают иммуносупрессивную среду внутри опухоли, защищая таким образом злокачественные клетки опухоли от противоопухолевых иммунных реакций, в частности от атаки цитотоксических Т- и НК-клеток.
Цель работы - исследование возможности повышения эффективности чекпойнт-блокирующей терапии антителами к CTLA-4 и PD-1 путем одновременного перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения из проопухолевого в противоопухолевое состояние с помощью ТЬК4-агониста.
Материал и методы. Использована экспериментальная модель меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J. Чекпойнт-блокаду проводили сразу двумя антителами, специфичными к CTLA-4 и PD-1. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения индуцировали внутриопухолевым введением кислого пептидогликана (КПГ, агонист TLR4). Эффективность иммунотерапии оценивали по скорости роста солидной опухоли, размеру опухоли на 16-й день после инокуляции клеток B16F0, клеточному составу инфильтрата опухоли, а также по интенсивности транскрипции ключевых генов, определяющих поляризацию и функциональную активность миелоидных и Т-клеток, выделенных из ткани опухоли и очищенных сортировкой.
Результаты. Показано, что комбинированная иммунотерапия одновременно чек-пойнт-блокирующими антителами к CTLA-4/PD-1 и агонистом TLR4 значительно замедляет рост меланомы B16F0, к 16-му дню уменьшает массу опухолей в 3 раза, индуцирует мощную инфильтрацию ткани опухоли T- и НК-клетками. В популяции инфильтрирующих опухоль Т-клеток доминируют CDS^^^^^. Содержание CD8+^-клеток и НК-клеток в 1 мг ткани опухоли под влиянием комбинированной терапии чек-пойнт-блокирующими антителами и TLR4-агонистом увеличилось в 11 раз. Очищенные из опухоли CD3+-T-клетки имели повышенную экспрессию генов ИФН-у и гранзима А,
Для корреспонденции
Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии, заведующий лабораторией активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
что свидетельствует об их поляризации в Th1- и цитотоксические Т-клетки. Кроме того, при комбинированной терапии чекпойнт-блокаторами и ТЬЯ4-агонистом происходила усиленная инфильтрация опухоли моноцитами и нейтрофилами. После проведения комбинированной терапии выделенные из ткани опухоли и очищенные миелоидные СБ11Ъ+-клетки были поляризованы в противоопухолевое состояние, что подтверждалось повышенной экспрессией гена индуцибельной NO-синтазы и отсутствием активной экспрессии гена аргиназы-1.
Заключение. Комбинированная терапия злокачественной меланомы в экспериментальной модели чекпойнт-блокаторами совместно с агонистом TLR4 значительно более эффективна по сравнению с монотерапией этими же лекарственными агентами, использованными по отдельности.
Ключевые слова: противоопухолевая иммунотерапия; чекпойнт-блокада; опухолевое микроокружение; транскрипционное перепрограммирование миелоидных клеток; TLR-агонист
Статья получена 07.09.2022. Принята в печать 17.10.2022.
Для цитирования: Пичугин А.В., Подсвирова С.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атаулла-ханов Р.И. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-690. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Планирование и постановка экспериментов, анализ данных, редактирование статьи -Пичугин А.В.; постановка экспериментов - Подсвирова С. А.; статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; анализ данных, редактирование статьи - Спирин Д.М., Лебедева Е.С.; концепция исследования, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р. И.
Pichugin A.V.1, Podsvirova S.A.2, Ushakova E.I.1, Spirin D.M.2, Lebedeva E.S.1, Ataullakhanov R.I.1
Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment increases the efficiency of CTLA-4 and PD-1 blockade in experimental malignant melanoma immunotherapy
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Blockade of immune checkpoints (immune checkpoint blockade) for the treatment of patients with malignant neoplasms is successfully and widely implemented in practical oncology. In essence, this direction of immunotherapy is the removal of suppression from T cells using antibodies to the inhibitory receptors CTLA-4 or PD-1 (PD-L1), allowing to reactivate antitumor T-cell immune responses and leading to significant clinical effects. Such immunotherapy saves patients even in the 4th stage of the oncological process. Even though the effectiveness of the checkpoint blockade is not high enough. Complete regression of the disease and complete recovery occur only in a small percentage of patients. The majority of patients with solid tumors who received checkpoint blockade either had no clinical effect or had a partial, relatively short-term effect.
One of the most common reasons preventing effective tumor elimination during checkpoint blockade therapy is that the myeloid cells of the tumor microenvironment create an immuno-suppressive microenvironment inside the tumor, thus protecting malignant cells from antitumor immune responses, in particular, from the attack of cytotoxic T and NK cells.
Aim of the work - investigation the possibility of increasing the effectiveness of checkpoint blockade therapy with antibodies to CTLA-4 and PD-1 by simultaneously reprogramming myeloid cells of the tumor microenvironment from their protumor to an antitumor state using a TLR4 agonist.
For correspondence
Ravshan I. Ataullakhanov -MD, PhD, Professor, Head of the Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Material and methods. An experimental model of B16F0 melanoma in C57BL/6J mice was used. Checkpoint blockade was performed simultaneously with two antibodies specific for CTLA-4 and PD-1. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment was induced by intratumoral administration of acidic peptidoglycan (APG, TLR4 agonist). The effectiveness of immunotherapy was assessed by the growth rate of a solid tumor, the tumor mass on day 16 after inoculation of B16F0 cells, the cellular composition of the tumor infiltrate, and also by the intensity of transcription of key genes that determine the polarization and functional activity of myeloid and T cells, purified by sorting from tumor tissue.
Results. It has been shown that combined immunotherapy with both checkpoint blocking antibodies to CTLA-4/PD-1 and a TLR4 agonist significantly suppresses the growth of B16F0 melanoma, reduces the mass of tumors by 3 times by day 16, and induces a powerful infiltration of tumor tissue by CD8+-T cells and NK cells with increased expression of granzyme A and interferon-y genes, as well as by monocytes and neutrophils polarized into an antitumor state, as evidenced by increased expression of the iNOS gene and the absence of active expression of the arginase-1 gene.
Conclusion. Combination therapy of malignant melanoma in an experimental model with immune checkpoint blockers together with a TLR4 agonist is significantly more effective than monotherapy with the same therapeutic agents used alone.
Keywords: cancer immunotherapy; checkpoint blockade; tumor microenvironment; transcriptional reprogramming of myeloid cells; TLR agonist
Received 07.09.2022. Accepted 17.10.2022.
For citation: Pichugin A.V., Podsvirova S.A., Ushakova E.I., Spirin D.M., Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment increases the efficiency of CTLA-4 and PD-1 blockade in experimental malignant melanoma immunotherapy. Immunologiya. 2022; 43 (6): 673-90. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690 (in Russian)
Funding. The study was supported with the Russian Science Foundation grant (project No. 20-15-00391). Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Planning and conducting experiments, data analysis, editing the article - Pichugin A.V.; conducting experiments - Podsvirova S.A.; statistical processing, editing the article - Ushakova E.I.; data analysis, article editing - Spirin D.M., Lebedeva E.S.; concept of the study, design of experiments, data analysis, article writing -Ataullakhanov R.I.
Введение
Иммунотерапия злокачественных новообразований имеет целью вернуть здоровье пациенту или, по крайней мере, остановить прогрессию онкологического заболевания, прицельно направив определенные иммунные механизмы на борьбу с имеющейся у пациента опухолью. Методы и средства, применяемые для иммунотерапии пациентов со злокачественными новообразованиями, весьма разнообразны. В последнее десятилетие в широкую практику онкологии вошла блокада иммунных контрольных точек, в оригинале - «immune checkpoint blockade». Это направление иммунотерапии базируется на исследованиях регуляции иммунных реакций через ингибирующие рецепторы Т-клеток, в частности через рецепторы CTLA-4 и PD-1 [1, 2].
Установлено, что моноклональные антитела (МкАт), блокирующие указанные рецепторы, можно применять для реактивации супрессированных Т-клеток в организме, пораженном злокачественным новообразованием [3-5]. Лекарственные препараты на основе МкАт, блокирующих рецепторы CTLA-4 и PD-1, а также ли-ганд PD-L1, разрешены для лечения пациентов с ме-ланомой, немелкоклеточным и мелкоклеточным раком легких, раком мочевого пузыря и метастатическим
гормон-резистентным раком предстательной железы [6-9], злокачественными новообразованиями головы и шеи, почечно-клеточным раком почек, уротелиальной карциномой, раком пищевода, желудка, толстой кишки, первичной карциномой печени, лимфомой Ходжкина, злокачественной плевральной мезотелиомой [10-15], трижды негативным раком молочной железы и гепато-целлюлярной карциномой [16, 17].
Иммунотерапия чекпойнт-блокаторами эффективно стимулирует противоопухолевые реакции Т-клеток и позволяет спасти пациентов даже в IV стадии опухолевого процесса. И все же эффективность чекпойнт-блокады недостаточно высока. Полная регрессия заболевания и полное выздоровление происходят лишь у небольшого процента пациентов. У большинства па-циетов с солидными опухолями, получавших терапию чекпойнт-блокаторами, либо не было клинического эффекта, либо наблюдался частичный, относительно кратковременный эффект.
Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что при использовании чекпойнт-блокады у пациентов c распространенными онкологическими заболеваниями частичный лечебный эффект (partial response) наблюдался в 8-43 % случаев (широкий интервал значений
СП f.
Таблица 1. Клинические результата: применения чекпойнт-блокады для лечения пациентов с распространенными онкологическими заболеваниями
Диагноз Тип терапии ДОВ, мес ДВБП, мес ЧОО, % ПР, % ЧР, % Пациентов с III-IV стадией, % Источники
Меланома анти-CTLA4 8 2 33 3 14 100 [18]
анти-PD-!/ PD-L1 12 11 60 7 9 100 [19]
Немелкоклеточ-ный рак легких анти-PD-!/ PD-L1 6 3 25 2 10 100 [20]
Рак простаты анти-CTLA4 20 Нет данных 61 0 18 95 [21]
анти-PD-1/ PD-L1 Нет данных 30-45 53 0,5 24 100 [22]
Уротелиальная карцинома анти-PD-1/ PD-L1 25 14 44 11 33 Нет данных [23]
Карцинома молочной железы анти-PD-1/ PD-L1 30 6 19 4 11 100 [24]
Почечно-клеточ-ная карцинома анти-PD-1/ PD-L1 40 13 51 Нет данных Нет данных Нет данных [25]
Примечание. ЛОВ - разность общей выживаемости между исследуемой группой и группой стравнения (AOS в англоязычной литературе); АВБП - разность беспрогрессивной выживаемости между экспериментальной группой и группой сравнения (APFS); ЧОО - частота объективного ответа (ORR); ПР - полная ремиссия (complete response), ЧР - частичная ремиссия (partial response).
отражает различия результатов в различных клинических исследованиях в зависимости от диагноза, стадии заболевания, варианта терапии и других факторов). Полное исчезновение проявлений болезни (complete response) достигалось довольно редко, этот показатель варьировал от 0 до 15 %. В частности, полное выздоровление достигалось у 2-3 % пациентов с меланомой после проведения блокады CTLA-4 и у 0,5-8 % пациентов с немелкоклеточным раком легких в результате лечения блокаторами PD-1 или PD-L1.
Какие факторы препятствуют успеху иммунотерапии? Как их распознать и преодолеть, чтобы достичь успеха? Поиск ответов на эти вопросы, а также разработка новых методов повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии вообще и чекпойнт-блокады в частности - это одно из самых актуальных направлений иммунологии и онкологии.
Именно в этом направлении выполнена работа, представленная в данной статье. Мы описываем результаты экспериментальной иммунотерапии, состоящей из комбинации чекпойнт-блокады с помощью МкАт к Т-клеточным рецепторам CTLA-4 и PD-1, нацеленной на реактивацию противоопухолевых Т-клеток, и транскрипционного перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения, имеющего целью включение противоопухолевой цитотоксической программы макрофагов и дендритных клеток в опухолевой ткани, а также устранение иммуносупрессивной среды внутри опухоли.
Перепрограммирование миелоидных клеток как новый подход в иммунотерапии опухолей, принципиальные идеи, клеточные и молекулярные механизмы, а также фармакологические средства для такой иммунотерапии были рассмотрены в нашей недавней статье [26].
Материал и методы
Экспериментальные животные. Мыши-самки линии C57BL/6J 8-10-недельного возраста были получены из питомника «Столбовая», содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными локальным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).
Реактивы и растворы. Использованы коллагеназа I типа (C0130, Sigma-Aldrich, США), коллагеназа IV типа (17104-019, GIBCO, США), ДНКаза (D4263-1VL, Sigma-Aldrich, США). В качестве агониста рецепторов TLR4 использован кислый пептидогликан из растений (КПГ) [27]. Использованы МкАт против мышиного рецептора CTLA-4 (BP0131, клон 9H10, Bio X Cell, США) и против мышиного рецептора PD-1 (BP0146, Bio X Cell, США). Также использованы PBS без магния и кальция - фосфатный буфер, содержащий 10 мМ Na3PO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ хлористого калия, рН 7,37,5 (Amresco, США). Буфер для отмывки клеток (PBS-cell) составлен из PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 % глюкозы, рН 7,4. Буфер цитометрический (PBS-cyto) составлен из PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5 % БСА, 0,01 % азида натрия, 0,35 мМ ЭДТА, рН 7,4. Его применяли для отмывки клеток от несвязавшихся и неспецифически связавшихся антител, а также во время инкубации клеток с антителами.
Подкожная инокуляция 2х105 клеток меланомы B16F10
мышам C57BL/6J ?
Иммунотерапия
КПГ
в/о ▼
н—I—I—I—|-
КПГ в/о
т н-ь
КПГ в/о
Т
-ь-Ь
КПГ
в/о ▼
i I i >
2 3
7 8 9 10 11 12 13
А ▲ ▲
МкАт МкАт МкАт
в/бр в/бр в/бр
Рис. 1. Схема иммунотерапии, использованная в данной работе для лечения мышей С57БЬ/61 с солидной злокачественной мела-номой Б16Е0
МкАт - моноклональные антитела, блокирующие СТЬЛ-4 и РБ-1, внутрибрюшинное введение (в/бр); КПГ - кислый пептидогли-кан (TLR4-агонист), внутриопухолевое введение (в/о) - инъекция непосредственно в ткань опухоли.
0
1
4
5
6
Культуры клеток in vitro. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пиру-вата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл ген-тамицина (все реактивы «ПанЭко», Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.
Клетки мышиной меланомы линии B16F0 (кат. CRL-6322, ATCC, США) культивировали в ПС в пластиковых чашках Петри до монослоя, занимающего 80 % поверхности. Адгезированные клетки B16F0 снимали со дна чашки раствором трипсин-ЭДТА («ПанЭко», Россия), отмывали центрифугированием в PBS-cell (1260 об/мин, 4 °С, 10 мин), определяли концентрацию жизнеспособных клеток на проточном цитофлуориметре BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США) с использованием флуоресцентных микросфер с известной концентрацией. Для нового пассажа использовали 1/6-1/10 часть от полученного количества клеток B16F0. Пересевы культуры делали дважды в неделю. Для инокуляции мышам готовили суспензию клеток B16F0 в концентрации 2 млн клеток в 1 мл PBS.
Экспериментальная модель меланомы у мышей. Протоколы иммунотерапии. Клетки меланомы B16F0 в количестве 2 • 105 клеток в 100 мкл PBS без магния и кальция инокулировали мышам C57BL/6J подкожно в область бедра с помощью инсулинового шприца (игла 30G). На 6-й день после введения клеток B16F0 опухоли становились пальпируемы. Размеры индивидуальных опухолей измеряли каждые 2-3 дня с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли по формуле:
V = l х w2/2, где V - объем, l - длина, w - ширина.
После первого измерения (день 6) мышей разделяли на 4 группы таким образом, чтобы медиана и среднее значение объема опухолей были приблизительно равными во всех группах. Протоколы лечения в группах различались. Группа 1 - контрольная, мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % №С1 вну-трибрюшинно. Группа 2 - мышей лечили инъекциями фармацевтического агониста ТЬЯ4 (КПГ). Группа 3 -для лечения мыши получали инъекции чекпойнт-блоки-рующих МкАт (анти-РБ-1 + анти-СТЬА-4). Группа 4 -комбинированная терапия инъекциями ТЬЯ4-агониста и чекпойнт-блокирующих МкАт (анти-РБ-1 + анти-СТЬА-4). Агонист ТЬЯ4 (КПГ) вводили в ткань опухоли в дозе 3 мкг в объеме 20 мкл. Инъекции ТЬЯ4-агониста мыши получали через 6, 9, 12 и 15 дней после инокуляции клеток меланомы Б16Б0. Чекпойнт-блокирующие МкАт (анти-РБ-1 + анти-СТЬА-4) вводили внутрибрюшинно в объеме 200 мкл, содержащем 250 мкг каждого из указанных МкАт. Лечебные инъекции антител проводили через 7, 10 и 13 дней после инокуляции клеток Б16Б0. На 16-й день эксперимент останавливали (рис. 1).
Срок остановки эксперимента на 16-й день после инокуляции клеток меланомы Б16Б0 выбран не случайно. К этому времени опухоли у контрольных животных достигали объема ~300 мм3, что позволяло иметь как минимум 3-4 достоверных измерения в динамике роста опухоли. Кроме того, одним из важных показателей иммунотерапии было влияние на клеточный состав опухоли. К 16-му дню опухоли были достаточного размера для всестороннего анализа клеточного состава и функциональных свойств клеток опухолевого микроокружения, выделенных сортировкой. К тому же на этой стадии развития опухоли еще не были поражены зонами некроза, что тоже рассматривалось как положительный фактор для аккуратного изучения клеточного состава опухоли.
Приготовление суспензии клеток опухоли. Мышей выводили из эксперимента путем дислокации
Таблица 2. Панель антител, использованная для анализа поверхностных маркеров основных популяций СБ45+-лейкоцитов в ткани опухоли методом проточной цитофлуориметрии
Антиген Флуорофор Клон МкАт Производитель, страна
CD45 BV510 30-F11 Rat IgG2b, к BioLegend, США
CD19 FITC 1D3 Rat IgG2a, к BioLegend, США
CD8a PE-CF594 53-6.7 Rat IgG2a, к BD Biosciences, США
CD49b (pan-NK cells) PE DX5 Rat IgM к BioLegend, США
CD4 PerCP-Cy5.5 RM4-5 Rat IgG2a, к BD Biosciences, США
TCR y/5 PE/Cy7 GL3 Armenian Hamster IgG BioLegend, США
CD3 APC 17A2 Rat IgG2b к BioLegend, США
CD11b APC-Cy7 M1/70 Rat IgG2b, к BioLegend, США
шейных позвонков. Опухоли извлекали в асептических условиях, сразу помещали в среду RPMI-1640, с помощью ножниц и пинцета быстро измельчали до гомогенного состояния. Полученную тканевую массу помещали в среду RPMI-1640 с коллагеназами I и IV типов и ДНКазой, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при 37 оС и 5 % CO2 для энзиматического расщепления стромальных элементов и получения суспензии клеток опухоли. По завершении энзима-тической стадии к суспензии добавляли PBS/БСА до объема 15 мл и центрифугировали при 1260 об/мин 10 мин, 4 °C. Клеточный осадок суспендировали в 1 мл PBS/БСА и переносили на ситечко с ячейками 70 мкм, протирая поршнем и промывая PBS/БСА до конечного объема 30 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 1260 об/мин 10 мин, 4 °C, осадок ресуспендировали.
Проточная цитофлуориметрия и сортировка чистых популяций клеток. Для определения содержания различных типов клеток в опухоли клеточную суспензию окрашивали двумя панелями МкАт, позволяющих анализировать лимфоидные и миелоид-ные типы клеток, соответственно (табл. 2 и 3). Клетки инкубировали в течение 15 мин при 4 °C в темноте, в присутствии флуорохром-меченных МкАт, после чего клетки отмывали в PBS-cyto и добавляли 200 мкл суспензии калибровочных микросфер, в которую также вносили DAPI (1 мкг/мл) для отличия живых и мертвых клеток. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре-сортиров-щике BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Результаты обрабатывали с помощью программы FCS Express 6 De Novo Software (Dotmatics, США).
Из суспензии клеток опухоли выделяли чистые популяции миелоидных CD3-CD11b+CD45+-клеток и CD3+CD11b+CD45+-Т-клеток для дальнейшей характеристики их функционального состояния. Очищенные популяции получали методом сортировки на проточном цитофлуориметре-сортировщике BD FACS Aria II. Чистота сортированных популяций составляла 95%.
Определение экспрессии генов в очищенных сортировкой клеточных популяциях, выделенных из ткани опухоли. Экспрессию целевых генов анализировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Очищенные сортировкой клетки осаждали центрифугированием (1260 об/мин, 10 мин, 4 °C). Надосадочную жидкость удаляли, осадок мие-лоидных клеток лизировали в 200 мкл лизирующего буфера с гуанидин-изотиоцианатом из набора реагентов «РНК-экстран» (Синтол, Россия), затем выделяли РНК по протоколу производителя. Осадок Т-клеток лизировали в 500 мкл буфера RLT из набора реагентов «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, Германия). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя коммерческий набор «ОТ-1» (Синтол, Россия), согласно инструкции производителя. ПЦР-РВ проводили в объеме 25 мкл, в реакцию добавляли 14 pM каждого праймера, 3 pM зонда, 2,5 е.а. ДНК-полимеразы SynTaq, 2,5 мМ MgCl2, 0,25 мМ DNTPs.
Для детекции флуоресценции использовали специфичные зонды Taq-man с меткой FAM либо интеркали-рующий краситель Sybr Green I (R-402, Синтол, Россия). Амплификацию проводили на приборе DTprime-4 (ДНК-технология, Россия).
Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad
Таблица 3. Панель антител, использованная для анализа поверхностных маркеров миелоидных клеток в ткани опухоли методом проточной цитофлуориметрии
Антиген Флуорофор Клон МкАт Производитель, страна
CD45 BV510 30-F11 Rat IgG2b, к BioLegend, США
CD11b FITC M1/70 Rat IgG2b, к BioLegend, США
CD11c PE N418 Armenian Hamster IgG BioLegend, США
Ly6G PE/Dazzle™ 594 YTS156.7.7 Rat IgG2b, к BioLegend, США
Ly6С PE/Cy7 HK1.4 Rat IgG2c, к BioLegend, США
F4/80 APC BM8 Rat IgG2a, к BioLegend, США
anti-I-A/I-E APC/Cy7 M5/114.15.2 Rat IgG2b, к BioLegend, США
350-1
300-
„ 250' S
s
§ 200 S,
G
&
150-
100-
50-
1 - К
2 - МкАт
3 -TLR4
4 - МкАт + TLR4
9 10 Дни
14 15
Э
500-,
400-
g 300
s
£ с о
§ 200-
100 -
p=0,0007
p=0,0177
p=0,0438
K
TLR4
МкАт [МкАт + TLR4]
Рис. 2. Влияние иммунотерапии на скорость роста и размер меланомы Б16Е0 у мышей С57БЬ/61
К - мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % ЫаС1; TLR4 - монотерапия агонистом TLR4; МкАт - терапия моноклональными антителами к СПЛ-4 и РБ-1; (МкАт + TLR4) - комбинированная терапия антителами к СТЬЛ-4 и РБ-1 совместно с агонистом TLR4.
0
0
Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Брауна-Форсайта или с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Шидака (различия считались значимыми приp < 0,05).
Результаты
В использованной модели сингенной меланомы у мышей C57BL/6J в месте подкожной инокуляции злокачественных клеток B16F0 у всех без исключения животных вырастала солидная опухоль. В течение 16 суток средний объем возникающих опухолей достигал значений ~300 мм3 (рис. 2). Экспериментальная иммунотерапия проводилась по схеме, представленной на рис. 1, в трех вариантах: 1) лечение одновременно двумя МкАт, блокирующими рецепторы CTLA-4 и PD-1 (далее - монотерапия МкАт); 2) лечение агонистом TLR4 (далее - монотерапия TLR4); 3) комбинированное лечение чекпойнт-блокирующими МкАт CTLA4/ PD-1 и агонистом TLR4 [далее - комботерапия или (МкАт + TLR4)].
Монотерапия МкАт достоверно задерживала рост опухолей B16F0. Внешний размер опухолей, измеренный при жизни животных, под влиянием чек-пойнт-блокирующих МкАт уменьшался в среднем на 22,5 % (p = 0,0243, рис. 2А). После аутопсии опухоли можно было выделить и взвесить. Средняя масса опухолей в группе мышей, леченных двумя МкАт против CTLA-4 и PD-1, была в среднем на 50 % (p = 0,0177, рис. 2Б) меньше средней массы опухолей у контрольных мышей, получавших инъекции физиологического раствора.
Лечение агонистом TLR4 с целью перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения оказывало такой же противоопухолевый эффект, как чекпойнт-блокада. Под влиянием агониста TLR4 рост солидной меланомы достоверно замедлялся. В группе мышей, получавших монотерапию агонистом TLR4, внешний размер опухоли был уменьшен на 22,2 % (р = 0,0128), по сравнению с опухолями в контрольной группе. Средняя масса выделенных опухолей в группе мышей, получивших монотерапию TLR4, снижалась на 44 % (р = 0,0438) по сравнению с опухолями в контрольной группе.
Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа АЛГОЛА, с использованием критерия Шидака. На графике А представлены средние значения и стандартное отклонение. На графике Б представлены медианы и минимальные/максимальные значения для каждой группы.
Комбинированная терапия (МкАт + TLR4) оказала самое сильное противоопухолевое действие. Ингиби-рование роста опухоли составило 63 % (р = 0,0001) по внешнему размеру опухолей и 80,5 % (р = 0,0007) по массе опухолей. Лечебное действие комбинированного лечения чекпойнт-блокирующими антителами и перепрограммирующим агонистом TLR4 было достоверно более сильным по сравнению с лечебным действием чекпойнт-блокаторов или агониста TLR4, использованных по отдельности (см. рис. 2, р = 0,0001).
Сокращение размеров опухолей под влиянием использованной нами иммунотерапии сопровождалось изменением клеточного состава опухолевого микроокружения. Первое, что со всей очевидностью выявлялось при цитометрии клеточной суспензии, полученной из опухоли, - это усиленная инфильтрация
10 000-|
X
Й 8000
а 6000 -
4000 -
Й 2000-
■ y8-T-клетки
□ НК-клетки
□ CD8+-T-клетки И CD4+-T-клетки
■ Нейтрофилы
□ Моноциты
K TLR4 МкАт [МкАт+TLR4]
Рис. 3. Клеточный состав воспалительного инфильтрата мела-номы В16Е0 у мышей С57БЬ/61 на 16-й день иммунотерапии по сравнению с контролем без лечения
К - мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % ЫаС1; ТЬК4 - монотерапия агонистом ТЬК4; МкАт -терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1; [МкАт + ТЬК4] - комбинированная терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1 совместно с агонистом ТЬК4.
лейкоцитами (рис. 3-5). В результате монотерапии МкАт или монотерапии агонистом ТЬЯ4 количество СБ45+-лейкоцитов, инфильтрирующих опухоль, возрастало в среднем в 2,3 (р = 0,0497) или в 2 (р = 0,0056) раза соответственно. Каждый миллиграмм опухолевой ткани под влиянием иммунотерапии чекпойнт-блокато-рами или ТЬЯ4-агонистом дополнительно инфильтрировали —4000-5000 лейкоцитов крови. Большая часть вновь пришедших клеток была представлена миело-идными СБ 11Ь+-клетками, среди которых доминировали СВ11Ъ+Ьу6СЫ811Р4/80'п'-моноциты. Интересно, что ТЬЯ4-агонист индуцировал приход нейтрофильных СБ11Ъ+Ьу60+-гранулоцитов, чего не наблюдалось при монотерапии чекпойнт-блокаторами. Очевидной была и тенденция к нарастанию содержания резидентных СБ11Ь+Ьу6С"1Т4/80ы811-макрофагов и СБ11с+МИС-1Г-дендритных клеток.
Комбинированная терапия (МкАт + ТЬЯ4) вызывала наиболее значительные изменения клеточного состава опухолевого микроокружения. Общее количество СБ45+-лейкоцитов в ткани опухоли увеличивалось
0
20 000 -|
- 15 000 -
£
С я
г- о 10 000 -
1) я
Т
I 5000 -
CD45 -лейкоциты
^=0,0094
Г
^=0,0497
р=0,0056
Г
1*Д
K TLR4
5
I
МкАт [МкАт +TLR4]
Миелоидные CD11b -клетки
р=0,0028
10 000 п
и
° я
8000 -
о я 6000 "
оа о
В ь-
« г 4000 Н
т1_.
Я ^ Ч ^
¿3й
2000-
TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
CD11b+Ly6G+ -гранулоциты
р=0,0019
4000 -|
и
с <и г 3000 -
„ &
О я
— о 2000 -
(и 2
Т X
щ Й I 1000 -
у
0 -
Г
-1
р=0,0017
р=0,0433 р=0,0493
П
Г
1
Л
K TLR4
О-
МкАт [МкАт +TLR4]
т
т
т
0
0
К
CD11b+Ly6ChighF4/80int-моноциты
5000 -|
4000 -
3000 -
р=0,0004
р=0,0162
1
р=0,0177
Г
Н
ъ
2000 - т
'0:т1
£
TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
CD11b+Ly6CintF4/80high-макрофаги
2 я
I §
Я ^
Ч ^ и
4000 п
3000 -
2000-
1000 -
р=0,0225
К TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
Дендритные CD11с+МНС-H+ -клетки
1500 п
° я
1000 -
¡§я
I—
р=0,0267
р=0,01
[а
К TLR4
МкАт [МкАт +TLR4]
т
т
т
т
т
0
0
К
Рис. 4. Влияние иммунотерапии на инфильтрацию опухоли миелоидными клетками
Здесь и на рис. 5: сингенная меланома Б16Р0, 16-й день, мыши C57BL/6J. К - мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % МаС1. ТЬК4 - монотерапия агонистом ТЬК4; МкАт - терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1; [МкАт + ТЬК4] - комбинированная терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1 совместно с агонистом ТЬК4. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ЛМОИ4 с использованием критерия Брауна-Форсайта. На графиках представлены средние значения и стандартное отклонение.
5000 и
4000 -
3000-
2000-
1000 -
СВ3 -Т-клетки
_р=0,0065_
р=0,0351
Г
р=0,0337
Г
1
ТЬИ4
МкАт [МкАт+ ТЬИ4]
1500 п
я ¡§я
1000 -
500 -
СВ4 -Т-клетки
К ТЬИ4
МкАт [МкАт+ ТЬИ4]
2500-
и 2 я £ § 2000 -
3 £ о с а ° 1500 -
Количес на 1 мг 1000 -
500 -
СВ8 -Т-клетки
_р=0,0377_
т
Г
и
г
ТЬИ4 МкАт [МкАт+ ТЬИ4]
т
т
т
т
т
т
т
т
т
0
0
0
К
К
80 -|
р 60Н
¡2 х 5 с а ° 40 -\
20 н
у
у8-Т-клетки
1а
К ТЬИ4
МкАт [МкАт+ ТЬИ4]
600 п
1400 -
200 -
НК-клетки
р=0,0081
Г
р=0,0444
п
р=0,0240
Г
р=0,05
К ТЬИ4
МкАт [МкАт+ ТЬИ4]
Рис. 5. Влияние иммунотерапии на инфильтрацию опухоли лимфоидными клетками
т
т
т
0
0
в 3,4 раза (р = 0,0094). Во столько же раз увеличивалось содержание миелоидных СБ11Ъ+-клеток (р = 0,0028) и CD11b+Ly6Chl8hF4/80mt-моноцитов (р = 0,0004). Происходила инфильтрация опухоли нейтрофильными CD11b+Ly6G+-гранулоцитами. Содержание этих клеток увеличивалось в 8,5 раз (р = 0,0019), достигая 18 % от всех лейкоцитов в ткани опухоли.
Примечательно содержание тканевых
CD11b+Ly6ClntF4/80Ы8h-макрофагов и CD11c+MHC-II+-дендритных клеток в опухоли после комбинированного лечения чекпойнт-блокирующими МкАт и агонистом TLR4 (рис. 4). Количество этих резидентных клеток в расчете на 1 мг опухолевой ткани не изменилось.
Анализ инфильтрации опухоли лимфоидными клетками показал (рис. 5), что в результате комбинированной терапии (МкАт + TLR4) количество Т- (р = 0,0065) и НК-клеток (р = 0,0081) в расчете на 1 мг опухолевой ткани выросло в среднем в 11 раз. Такой усиленной инфильтрации опухоли потенциально цитотоксическими клетками не наблюдалось ни при монотерапии чекпойнт-блокато-рами, ни при перепрограммировании миелоидных клеток TLR4-агонистом. В случае монотерапии указанными агентами была видна лишь тенденция к повышенной инфильтрации опухоли Т- и НК-клетками. Комбинированное воздействие двумя типами иммунотропных препаратов вызывало синергический ответ в виде агрессивной атаки опухоли инфильтрирующими Т- и НК-клетками.
Исследование фенотипа Т-клеток доказывает, что при комботерапии доминантной являлась инфильтрация опухоли CD8+-Т-клетками (р = 0,0377). Увеличение количества инфильтрирующих CD4+-Т-клеток тоже наблюдалось, но не достигало достоверных значений из-за индивидуальных разбросов (рис. 5). Повышенная инфильтрация ткани опухоли у5-Т-клетками тоже была на уровне тенденций, причем не только при использовании комботерапии, но и при монотерапии как чекпойнт-блокаторами, так и агонистом TLR4.
Из каждой индивидуальной опухоли мы выделили очищенные популяции CD3+-Т-клеток и миелоидных CD11b+-клеток методом сортировки на проточном цито-флуориметре-сортировщике (рис. 6). Функциональные свойства выделенных клеточных популяций оценивали по уровню экспрессии функционально значимых генов (рис. 7-9).
По экспрессии мРНК ИФН-у (ген можно заключить, что инфильтрирующие опухоль CD3+-T-клетки были поляризованы в направлении ТЫ-ответа, что хорошо коррелирует с накоплением в инфильтрате CD8+-Т- и НК-клеток. Повышенная экспрессия ИФН-у наблюдалась во всех трех группах мышей, получавших иммунотерапию - при лечении чекпойнт-блокирую-щими антителами, агонистом TLR4 или комбинацией чекпойнт-блокаторов с TLR4-агонистом (рис. 7).
Сортировка CDS+'Т-клеток и миелоидных CD11Ь+-клеток
Ткань опухоли
Меланома B16F0
CD3 -Т-клетки
Миелоидные CD11b+-клетки
ПЦР
в реальном времени
" 100 100 100 100 100
Экспрессия мРНК гена xyz
p=0,0406
^ 0,02-
Ш
K TLR4 МкАт [МхАт+МД]
Рис. 6. Схема экспериментов по анализу экспрессии мРНК в очищенных популяциях СБ3+-Т-клеток и миелоидных CD11b+-клеток, выделенных из индивидуальных опухолей
Анализ экспрессии гранзима А (ген Gzma) позволяет оценить накопление функциональных цитотоксических Т- и НК-клеток (рис. 7). Достоверное повышение экспрессии мРНК гена Gzma произошло в опухолях мышей, получивших комбинированную терапию (МкАт +
ТЬЯ4). Монотерапия МкАт и монотерапия ТЬЯ4, примененные по отдельности, не приводили к усилению экспрессии гена гранзима А.
Экспрессия генов и ¥охр3 в Т-клетках опухолей, полученных после проведения иммунотерапии
p=0,0014
CD3 -T-клетки опухоли
Gzma
ns
p = 0,0494
p = 0,05 1
0,03 -i
S 0,02-
c 0,01 -
1
" m é н
0,00 J—^—^—1—I——L
K TLR4 МкАт [Мк
TLR4 МкАт [МкАт+TLR4] Tgfbl
1
г
1
0,4 -|
К 0,3 i Р
о 0,2-
% 0,1 -Э
0,0
1Г
K
TLR4 МкАт [МкАт+TLR4]
0,04 п
к 0,03 H Р
0,10 -I
Й 0,08-из
Р
« 0,06-S
с
| 0,04 -п ск
m 0,02 H
0,00
Ifng
p = 0,0406
p = 0,0014
Г
p = 0,0059'
1
Ö 0,02° "в"
<U T
a
b- JL
0,00 —
s
K
TLR4 МкАт [МкАт+TLR4] Foxp3
1
Г
1
Il
K
TLR4 МкАт [МкАт+TLR4]
Рис. 7. Экспрессия факторов, определяющих функциональную поляризацию, в Т-клетках, очищенных сортировкой из индивидуальных опухолей В16Б0 у мышей С57ВЬ/61
Здесь и на рис. 8, 9: К - мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % ИаС1. ТЬЯ4 - монотерапия агонистом ТЬЯ4; МкЛт - терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1; [МкАт + ТЬК4] - комбинированная терапия МкАт к СТЬЛ-4 и РБ-1 совместно с агонистом ТЬЯ4.
Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ЛИОУЛ с использованием критерия Брауна-Форсайта. На графиках представлены медианы и интерквартильный размах.
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0,8 и
К
и 0,6 H
Рч
s «
8 0,41
I 0,2-
0,0
Cox2
p = 0,0081
Г
p = 0,0198
p = 0,0498
Д ffi
~~I
TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
Миелоидные клетки опухоли Tnfa
ns
0,5 -i
Й 0,4-| К
Рч
« 0,3-
£ 0,2н
я
о
к
m 0,1 Ч
0,0
TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
2,5 -1
Й 2,0-| К а.
« 1,5 i я
0
1 1,0 H =
о
к
m 0,5-
0,0
Illb
p = 0,0041
Г
p = 0,0096
fe. m
TLR4 МкАт [МкАт +TLR4]
Рис. 8. Экспрессия провоспалительных факторов в миелоидных клетках, очищенных сортировкой из индивидуальных опухолей B16F0 у мышей C57BL/6J
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
чекпойнт-блокирующими МкАт, агонистом TLR4 или комбинацией этих двух видов лечения, оставалась на низком, фоновом, уровне (рис. 7). Это указывает на отсутствие заметного нарастания содержания Т-клеток-регуляторов в опухолевом микроокружении в результате проведенного противоопухолевого лечения.
Очищенные сортировкой миелоидные клетки, выделенные из индивидуальных опухолей, оценивали по экспрессии двух групп генов. Одна группа генов отражала провоспалительную активность миелоидных клеток опухоли - это гены, кодирующие фермент цикло-оксигеназу-2 (ген Cox2) и цитокины ИЛ-lß, ФНОа
0,03 -|
К
£
1 0,02-
я 0,01 H
m
0,00
0,20 -i
К
33 0,15
Рч
«
ч 0,10 ч
£ 0,05 -0,00
Миелоидные клетки опухоли
Inos
p = 0,0001
p = 0,0082
Г
p = 0,0047
I-:-1
~~1
TLR4 МкАт ^^+TLR4] Tgfbl
ns
Jl
НГ
I
1*1 д.
TLR4 МкАт ^^+TLR4]
0,06 -1
К
£
1 0,04-
я 0,02 -I
£D
0,00
0,20 -i
К
зз 0,15
Рч
«
ч 0,10 Ч
« 0,050,00
Argl
ns
TLR4 МкАт [МкАт+^4]
Il10
ns
1
Г
1
и г
~~1
TLR4 МкАт [МкАт+^4]
Рис. 9. Экспрессия факторов, определяющих функциональную поляризацию, в миелоидных клетках, очищенных сортировкой из индивидуальных опухолей Б1^0 у мышей C57BL/6J
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
K
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
K
K
(гены 111Ь и Тп/а, соответственно, рис. 8). Другая группа генов кодирует факторы, по экспрессии которых можно судить о поляризации макрофагов в состояния М1 и М2, а дендритных клеток - в состояния Б1 и Б2. Это гены 1по&\ Лт^1,1110, Т^1, кодирующие, соответственно, ин-дуцибельную МО-синтазу, аргиназу-1, цитокины ИЛ-10 и ТФРР (рис. 9).
Результаты, представленные на рис. 8, свидетельствуют, что миелоидные клетки в микроокружении опухоли В16Б0 после проведения иммунотерапии чек-пойнт-блокирующими МкАт производят повышенное количество циклооксигеназы-2.Этот фермент участвует в синтезе простагландинов и является несомненным признаком провоспалительной активности миелоидных клеток. Лечение агонистом ТЬЯ4 не приводило к активной экспрессии гена Сох2. В опухолях мышей, получавших комбинированную терапию (МкАт + ТЬЯ4), экспрессия циклооксигеназы-2 активировалась примерно до того же уровня, как и при монотерапии чекпойнт-блокаторами.
Экспрессия провоспалительных цитокинов ФНОа и ИЛ-1Р в миелоидных клетках опухоли тоже повышалась в результате лечения чекпойнт-блокаторами или их комбинацией с агонистом ТЬЯ4 (рис. 8). Монотерпия ТЬЯ4-агонистом такого провоспалительного эффекта не оказывала.
Исследование экспрессии генов, кодирующих инду-цибельную МО-синтазу, аргиназу-1, цитокины ИЛ-10 и ТФРр, со всей очевидностью показало, что комбинированная терапия (МкАт + ТЬЯ4) способствует перепрограммированию миелоидных клеток опухолевого микроокружения из промоторов опухолевого роста в клетки, обладающие противоопухолевой активностью. Происходит функциональная поляризация миелоидных клеток в противоопухолевое состояние, характерное для макрофагов М1 и дендритных клеток Б1 (рис. 9). Достоверно более высокий уровень экспрессии инду-цибельной МО-синтазы при использовании комбинированной иммунотерапии (МкАт + ТЬЯ4) свидетельствует о более высокой противоопухолевой эффективности комбинированного лечения по сравнению с монотерапией отдельно МкАт к РБ-1/СТЬА-4 или ТЬЯ4-агонистом.
Обсуждение
Рецепторы СТЬА-4 и РБ-1 экспонируются на поверхности активированных Т-клеток для естественной остановки процесса их размножения [28-29]. Бесконечная пролиферация опасна и потому недопустима. СТЬА-4 и РБ-1 - это своего рода молекулярные клавиши, посредством которых происходит торможение Т-клеточной реакции. При воздействии на эти рецепторы соответствующими лигандами пролиферация Т-клеток прекращается, функциональная активность этих клеток снижается или полностью затухает и даже может включаться процесс их самоликвидации - клеточная смерть. Злокачественная опухоль может использовать в своих интересах этот естественный механизм
регуляции делений Т-клеток. На злокачественных клетках и на миелоидных клетках опухолевого микроокружения экспонируется избыток лигандов CTLA-4 и PD-1 [30-32]. Это позволяет злокачественным клеткам опухоли эффективно защищаться от атаки Т-клеток. Пришедшие в опухоль Т-клетки, потенциально способные распознать опухолевые антигены и элиминировать му-тантные злокачественные клетки, подвергаются инги-бированию и апоптозу.
Идея чекпойнт-ингибирующей терапии состоит в блокировании рецепторов CTLA-4 и/или PD-1 на поверхности Т-клеток или их лигандов на поверхности злокачественных и миелоидных клеток опухоли. Блокирование достигается с помощью терапевтических антител, специфично распознающих чекпойнт-инги-бирующий рецептор или его лиганд на поверхности соответствующих клеток [33]. Практическое применение терапевтических антител к CTLA-4, PD-1, PD-L1/2 в течение прошедшего десятилетия показало, что идея чекпойнт-блокады работает, хотя и не всегда (см. табл. 1).
В результате чекпойнт-блокирующей терапии часть пациентов полностью исцеляется от злокачественного новообразования, и это само по себе экстраординарное достижение. У другой части пациентов наблюдается частичное, временное, улучшение. Рост опухоли приостанавливается на несколько недель или даже месяцев, а затем возобновляется с новой силой. Довольно большой процент пациентов со злокачественными новообразованиями вообще не отвечает на чекпойнт-блокиру-ющую терапию. Причина, по-видимому, в том, что для ухода от иммунного контроля опухоли используют не только лиганды CTLA-4 и PD-1, но и множество других молекулярных механизмов. Блокирование лишь одного механизма из этого множества далеко не всегда позволяет добиться желанного результата - элиминации опухоли. Лишь у некоторых пациентов, в опухоли которых экспрессия лигандов CTLA-4 и PD-1 является главным механизмом защиты от иммунитета, разблокирование активности Т-клеток приводит к эффективной Т-клеточной атаке.
В остальных случаях, несмотря на реактивацию Т-клеток, опухоль использует другие механизмы защиты, которые Т-клетки преодолеть не могут. В ряду таких механизмов особое место занимают растворимые факторы, подавляющие иммунные реакции. Такие факторы производятся всеми типами клеток опухоли: злокачественными клетками, тканевыми макрофагами, дендритными клетками, миофибробластами, эндоте-лиальными клетками, тучными клетками и перицитами, а также клетками-мигрантами, пришедшими из крови в ткань опухоли, в частности моноцитами, нейтрофилами, регуляторными Т-клетками, миелоид-ными клетками-супрессорами. Многочисленные продукты этих клеток, такие как ТФРр, ИЛ-10, проста-гландины, IDO и другие, создают в опухолевой ткани среду, в которой иммунная атака против опухоли невозможна [34-36]. В такой иммуносупрессивной среде
реактивированные с помощью чекпойнт-блокирую-щих антител Т-клетки не способны выполнить свою функцию.
Как преодолеть проблему, как изменить среду внутри опухоли таким образом, чтобы Т-клетки могли выполнить свою задачу - ликвидировать опухоль? Новый терапевтический подход состоит в транскрипционном перепрограммировании миелоидных клеток опухолевого микроокружения - резидентных макрофагов и дендритных клеток опухоли, а также пришедших в опухоль миелоидных клеток инфильтрата [26]. Цель перепрограммирования состоит в конвертации многочисленных клеточных участников микроокружения опухоли из пособников прогрессивного роста опухоли в ее убийц. При таком перепрограммировании миелоидные клетки прекращают выделять иммуносупрессивные субстанции и, напротив, производят иммуностимулирующие цитокины и хемокины, а также цитостатические факторы, ингибирующие размножение, и цитотоксические вещества, убивающие злокачественные клетки [37-42].
В данной статье мы представили результаты комбинированного воздействия, в котором использованы два варианта противоопухолевой иммунотерапии - реактивация Т-клеток с помощью чекпойнт-блокирующих антител и перепрограммирование миелоидных клеток опухоли с помощью агониста TLR4. В экспериментальной модели злокачественной меланомы у лабораторных мышей мы показали, что такая комбинация двух вариантов иммунотерапии имеет значительные преимущества по сравнению с каждым из этих вариантов, использованных самостоятельно.
Примененная нами комбинированная иммунотерапия индуцировала значительно более мощную противоопухолевую иммунную атаку, чем при монотерапии чекпойнт-блокаторами. По сравнению с ложным лечением в контрольной группе (физраствор) после комбинированной иммунотерапии чекпойнт-блокаторами и TLR4-агонистом инфильтрация опухоли клетками иммунной системы увеличивалась более чем на порядок. В результате комбинированной терапии (МкАт + TLR4) количество CD8+-Т-клеток и НК-клеток в расчете на 1 мг опухолевой ткани возрастало в 11 раз. По сравнению с монотерапией чекпойнт-блокаторами комбинированное лечение привлекало в опухоль в 3-5 раз больше CD8+-Т-клеток и НК-клеток (см. рис. 5).
При комбинированной терапии (МкАт + TLR4) происходила не просто усиленная инфильтрация опухоли CD8+-Т-клетками. Очень важно, что Т-клетки инфильтрата имели высокий уровень экспрессии мРНК ИФН-у и гранзима А (см. рис. 7). Это означает, что комбинированное лечение привлекает в опухоль большое количество функционально активных Т-клеток с повышенной цитотоксической активностью и поляризацией Т-клеточной реакции по ТЫ-типу, что является наиболее эффективным типом противоопухолевой защиты. В дополнение к этим, оптимальным, характеристикам иммунной атаки заслуживает внимания низкий уровень экспрессии генов цитокина ТФРр и транскрипци-
онного фактора FoxP3, характерных для регуляторных Т-клеток [43]. Следовательно, комбинированная терапия (МкАт + TLR4) индуцировала мощную атаку опухоли цитотоксическими Т-клетками и НК-клетками без усиления иммуносупрессивного механизма в виде Т-регуляторов.
Усиленная инфильтрация опухоли Т-клетками и НК-клетками, индуцированная комбинированной терапией (МкАт + TLR4), также сопровождалась повышенной инфильтрацией моноцитами и гранулоцитами. По сравнению с контрольной группой в результате комботе-рапии содержание моноцитов в опухоли возрастало в ~3 раза, а нейтрофильных гранулоцитов - в 8,5 раз. Следовательно, комбинированная терапия индуцировала в ткани опухоли воспалительную реакцию, в основе которой активация эндотелия кровеносных капилляров и посткапиллярных венул в опухолевой ткани, экспрессия на эндотелии рецепторов адгезии для рекрутирования из кровотока всех типов клеток, содержание которых в опухоли существенно возросло, а именно нейтрофилов, моноцитов, НК-клеток и Т-клеток. В этом ряду мы расположили типы клеток в такой последовательности, в какой они мигрируют из кровотока в ткань при классическом воспалении [44].
Подробно динамику миграции разных типов клеток в ткань опухоли B16F0 в результате комботерапии мы не исследовали. Можем только констатировать сам факт усиленной воспалительной клеточной инфильтрации и состав инфильтрата на 16-й день комботерапии. В воспалительном инфильтрате опухоли к этому сроку комбинированной терапии содержалось приблизительно 2500 гранулоцитов, 3500 моноцитов, 750 CD4+-T-клеток, 1500 CD8+-T-клеток, 35 у5-Т-клеток и 400 НК-клеток в расчете на 1 мг ткани опухоли (см. рис. 3).
Исследование экспрессии ключевых генов в очищенной популяции миелоидных клеток доказывает, что под влиянием комбинированной терапии (МкАт + TLR4) мигрирующие в опухоль моноциты и нейтрофильные гранулоциты были поляризованы в противоопухолевое состояние. Оказавшиеся в ткани моноциты принято называть воспалительными моноцитами опухоли, но по сути это новые макрофаги [45]. Усиленная экспрессия в этих клетках гена и отсутствие активной экспрессии гена однозначно указывают на поляризацию этих клеток в состояние М1, для которого характерна продукция цитотоксических противоопухолевых субстанций, в частности активных форм кислорода, перекисей, N0, пероксинитрита и других [46-48]. Аналогично, усиленная экспрессия гена в нейтрофилах свидетельствует об их поляризации в противоопухолевое состояние, которое обозначают N1 [49-51].
Следовательно, не только Т-клетки, но и миело-идные клетки, усиленно инфильтрирующие опухоль B16F0 в результате комбинированной терапии чек-пойнт-блокирующими антителами и агонистом TLR4, поляризованы в противоопухолевое состояние и обладают самыми агрессивными противоопухолевыми молекулярными механизмами. Неудивительно, что такой
результат комбинированной иммунотерапии привел к значительному уменьшению размеров злокачественной меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J (рис. 2).
Заключение
Основываясь на понимании механизмов, препятствующих эффективной иммунотерапии чекпойнт-блокирующими антителами, мы совместили чекпойнт-блокаду с перепрограммированием миелоидных клеток опухоли. Комбинированная терапия меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J МкАт, блокирующими CTLA-4
и PD-1, совместно с перепрограммированием миелоидных клеток с помощью агониста TLR4 оказалась гораздо более эффективной по сравнению с чекпойнт-блокадой и использованнием TLR4-агониста по отдельности в виде монотерапии. Комбинированная иммунотерапия (МкАт + TLR4) индуцирует значительное подавление роста опухоли, в основе которого лежит мощная инфильтрация опухолевой ткани цитотоксическими CD8+-T-клетками, НК-клетками, а также моноцитами и нейтро-филами с профилем экспрессии генов, характерным для противоопухолевого состояния этих клеток.
■ Литература
1. Freeman G.J., Long A.J., Iwai Y., Bourque K., Chernova T., Nishimura H., Fitz L.J., Malenkovich N., Okazaki T., Byrne M.C., Horton H.F., Fouser L., Carter L., Ling V., Bowman M.R., Carreno B.M., Collins M., Wood C.R., Honjo T. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med. 2000; 192 (7): 1027-34. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.192.7.1027 PMID: 11015443.
2. Leach D.R., Krummel M.F., Allison J.P. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science. 1996; 271 (5256): 1734-6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.271.5256.1734 PMID: 8596936.
3. Pauken K.E., Sammons M.A., Odorizzi P.M., Manne S., Godec J., Khan O., Drake A.M., Chen Z., Sen D.R., Kurachi M., Barnitz R.A., Bartman C., Bengsch B., Huang A.C., Schenkel J.M., Vahedi G., Hai-ning W.N., Berger S.L., Wherry E.J. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science. 2016; 354 (6316): 1160-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaf2807.
4. Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubben-horst B., D'Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amaravadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathan-son K.L., Wolchok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079 PMID: 28397821.
5. Paterson A.M., Brown K.E., Keir M.E., Vanguri V.K., Riella L.V., Chandraker A., Sayegh M.H., Blazar B.R., Freeman G.J., Sharpe A.H. The programmed death-1 ligand 1:B7-1 pathway restrains diabetogenic effector T cells in vivo. J. Immunol. 2011; 187 (3): 1097-105. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.1003496 PMID: 21697456.
6. Schadendorf D., Hodi F.S., Robert C., Weber J.S., Margolin K., Hamid O., Patt D., Chen T.T., Berman D.M., Wolchok J.D. Pooled analysis of long-term survival data from phase II and phase III trials of ipilimumab in unresectable or metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2015; 33 (17): 1889-94. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.2014.56.2736.
7. O'Mahony D., Morris J.C., Quinn C., Gao W., Wilson W.H., Gause B., Pittaluga S., Neelapu S., Brown M., Fleisher T.A., Gulley J.L., Schlom J., Nussenblatt R., Albert P., Davis T.A., Lowy I., Petrus M., Waldmann T.A., Janik J.E. A pilot study of CTLA-4 blockade after cancer vaccine failure in patients with advanced malignancy. Clin. Cancer Res. 2007; 13 (3): 958-64. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-06-1974 PMID: 17289891.
8. Fong L., Kwek S.S., O'Brien S., Kavanagh B., McNeel D.G., Weinberg V., Lin A.M., Rosenberg J., Ryan C.J., Rini B.I., Small E.J. Potentiating endogenous antitumor immunity to prostate cancer through combination immunotherapy with CTLA4 blockade and GM-CSF. Cancer Res. 2009; 69 (2): 609-15. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-3529 PMID: 19147575.
9. Sharma P., Pachynski R.K., Narayan V., Flechon A., Gravis G., Galsky M.D., Mahammedi H., Patnaik A., Subudhi S.K., Ciprotti M., Simsek B., Saci A., Hu Y., Han G.C., Fizazi K. Nivolumab plus ipilimumab for metastatic castration-resistant prostate cancer: preliminary analysis of patients in the checkmate 650 trial. Cancer Cell. 2020; 38 (4): 489-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.08.007 PMID: 32916128.
10. Ferris R.L., Blumenschein G. Jr., Fayette J., Guigay J., Colevas A.D., Licitra L., Harrington K., Kasper S., Vokes E.E., Even C., Worden F., Saba N.F., Iglesias Docampo L.C., Haddad R., Rordorf T., Kiyota N., Tahara M., Monga M., Lynch M., Geese W.J., Kopit J.,
Shaw J.W., Gillison M.L. Nivolumab for recurrent squamous-cell carcinoma of the head and neck. N. Engl. J. Med. 2016; 375 (19): 1856-67. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1602252 PMID: 27718784.
11. Sharma P., Retz M., Siefker-Radtke A., Baron A., Necchi A., Bedke J., Plimack E.R., Vaena D., Grimm M.O., Bracarda S., Arranz J.A., Pal S., Ohyama C., Saci A., Qu X., Lambert A., Krishnan S., Azrilevich A., Galsky M.D. Nivolumab in metastatic urothelial carcinoma after platinum therapy (CheckMate 275): a multicentre, single-arm, phase 2 trial. Lancet Oncol. 2017; 18 (3): 312-22. DOI: https://doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30065-7 PMID: 28131785.
12. Motzer R.J., Escudier B., McDermott D.F., George S., Hammers H.J., Srinivas S., Tykodi S.S., Sosman J.A., Procopio G., Plimack E.R., Castellano D., Choueiri T.K., Gurney H., Donskov F., Bono P., Wagstaff J., Gauler T.C., Ueda T., Tomita Y., Schutz F.A., Kollmanns-berger C., Larkin J., Ravaud A., Simon J.S., Xu L.A., Waxman I.M., Sharma P. CheckMate 025 Investigators. Nivolumab versus everolimus in advanced renal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 2015; 373 (19): 1803-13. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1510665 PMID: 26406148.
13. El-Khoueiry A.B., Sangro B., Yau T., Crocenzi T.S., Kudo M., Hsu C., Kim T.Y., Choo S.P., Trojan J., Welling T.H. Rd., Meyer T., Kang Y.K., Yeo W., Chopra A., Anderson J., Dela Cruz C., Lang L., Neely J., Tang H., Dastani H.B., Melero I. Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): an open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial. Lancet. 2017; 389 (10 088): 2492-502. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31046-2 PMID: 28434648.
14. Overman M.J., McDermott R., Leach J.L., Lonardi S., Lenz H.J., Morse M.A., Desai J., Hill A., Axelson M., Moss R.A., Goldberg M.V., Cao Z.A., Ledeine J.M., Maglinte G.A., Kopetz S., André T. Nivolumab in patients with metastatic DNA mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high colorectal cancer (CheckMate 142): an open-label, multicentre, phase 2 study. Lancet Oncol. 2017; 18 (9): 1182-91. DOI: https://doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30422-9 PMID: 28734759.
15. Ansell S.M., Lesokhin A.M., Borrello I., Halwani A., Scott E.C., Gutierrez M., Schuster S.J., Millenson M.M., Cattry D., Freeman G.J., Rodig S.J., Chapuy B., Ligon A.H., Zhu L., Grosso J.F., Kim S.Y., Timmerman J.M., Shipp M.A., Armand P. PD-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med. 2015; 372 (4): 311-9. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1411087.
16. Herbst R.S., Soria J.C., Kowanetz M., Fine G.D., Hamid O., Gordon M.S., Sosman J.A., McDermott D.F., Powderly J.D., Gettinger S.N., Kohrt H.E., Horn L., Lawrence D.P., Rost S., Leabman M., Xiao Y., Mokatrin A., Koeppen H., Hegde P.S., Mellman I., Chen D.S., Hodi F.S. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014; 515 (7528): 563-7. DOI: https://doi. org/10.1038/nature14011 PMID: 25428504.
17. Schmid P., Adams S., Rugo H.S., Schneeweiss A., Barrios C.H., Iwata H., Diéras V., Hegg R., Im S.A., Shaw Wright G., Henschel V., Molinero L., Chui S.Y., Funke R., Husain A., Winer E.P., Loi S., Emens L.A. IMpassion130 Trial Investigators. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. N. Engl. J. Med. 2018; 379 (22): 2108-21. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1809615.
18. Martens A., Wistuba-Hamprecht K., Geukes Foppen M., Yuan J., Postow M.A., Wong P., Romano E., Khammari A., Dreno B., Capone M., Ascierto P.A., Di Giacomo A.M., Maio M., Schilling B., Sucker A., Schadendorf D., Hassel J.C., Eigentler T.K., Martus P., Wolchok J.D., Blank C., Pawelec G., Garbe C., Weide B. Baseline peripheral blood biomarkers associated with clinical outcome of advanced melanoma
patients treated with ipilimumab. Clin. Cancer Res. 2016; 22 (12): 2908-18. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-15-2412 PMID: 26787752.
19. Jacquelot N., Roberti M.P., Enot D.P., Rusakiewicz S., Ternes N., Jegou S., Woods D.M., Sodre A.L., Hansen M., Meirow Y., Sade-Feldman M., Burra A., Kwek S.S., Flament C., Messaoudene M., Duong C.P.M., Chen L., Kwon B.S., Anderson A.C., Kuchroo V.K., Weide B., Aubin F., Borg C., Dalle S., Beatrix O., Ayyoub M., Balme B., Tomasic G., Di Giacomo A.M., Maio M., Schadendorf D., Melero I., Dreno B., Khammari A., Dummer R., Levesque M., Koguchi Y., Fong L., Lotem M., Baniyash M., Schmidt H., Svane I.M., Kroemer G., Marabelle A., Michiels S., Cavalcanti A., Smyth M.J., Weber J.S., Eggermont A.M., Zitvogel L. Predictors of responses to immune checkpoint blockade in advanced melanoma. Nat. Commun. 2017; 8 (1): 592. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-017-00608-2 PMID: 28928380.
20. Passaro A., Mancuso P., Gandini S., Spitaleri G., Labanca V., Guerini-Rocco E., Barberis M., Catania C., Del Signore E., de Marinis F., Bertolini F. Gr-MDSC-linked asset as a potential immune biomarker in pretreated NSCLC receiving nivolumab as second-line therapy. Clin. Transl. Oncol. 2020; 22 (4): 603-11. DOI: https://doi.org/10.1007/s12094-019-02166-z PMID: 31254252.
21. Santegoets S.J., Stam A.G., Lougheed S.M., Gall H., Schol-ten P.E., Reijm M., Jooss K., Sacks N., Hege K., Lowy I., Cuillerot J.M., von Blomberg B.M., Scheper R.J., van den Eertwegh A.J., Ger-ritsen W.R., de Gruijl T.D. T cell profiling reveals high CD4+CTLA-4 + T cell frequency as dominant predictor for survival after prostate GVAX/ ipilimumab treatment. Cancer Immunol. Immunother. 2013; 62 (2): 24556. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-012-1330-5 PMID: 22878899.
22. Karzai F., VanderWeele D., Madan R.A., Owens H., Cordes L.M., Hankin A., Couvillon A., Nichols E., Bilusic M., Beshiri M.L., Kelly K., Krishnasamy V., Lee S., Lee M.J., Yuno A., Trepel J.B., Merino M.J., Dittamore R., Marte J., Donahue R.N., Schlom J., Killian K.J., Meltzer P.S., Steinberg S.M., Gulley J.L., Lee J.M., Dahut W.L. Activity of durvalumab plus olaparib in metastatic castration-resistant prostate cancer in men with and without DNA damage repair mutations. J. Immunother. Cancer. 2018; 6 (1): 141. DOI: https://doi.org/10.1186/ s40425-018-0463-2 PMID: 30514390
23. Chalfin H.J., Pramparo T., Mortazavi A., Niglio S.A., Schon-hoft J.D., Jendrisak A., Chu Y.L., Richardson R., Krupa R., Anderson A.K.L., Wang Y., Dittamore R., Pal S.K., Lara P.N., Stein M.N., Quinn D.I., Steinberg S.M., Cordes L.M., Ley L., Mallek M., Sierra Ortiz O., Costello R., Cadena J., Diaz C., Gulley J.L., Dahut W.L., Streicher H., Wright J.J., Trepel J.B., Bottaro D.P., Apolo A.B. Circulating tumor cell subtypes and T-cell populations as prognostic biomarkers to combination immunotherapy in patients with metastatic genitourinary cancer. Clin. Cancer Res. 2021; 27 (5): 1391-8. DOI: https://doi. org/10.1158/1078-0432.CCR-20-2891 PMID: 33262136.
24. Terranova-Barberio M., Pawlowska N., Dhawan M., Moas-ser M., Chien A.J., Melisko M.E., Rugo H., Rahimi R., Deal T., Daud A., Rosenblum M.D., Thomas S., Munster P.N. Exhausted T cell signature predicts immunotherapy response in ER-positive breast cancer. Nat. Commun. 2020; 11 (1): 3584. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17414-y PMID: 32681091.
25. Jeyakumar G., Kim S., Bumma N., Landry C., Silski C., Suisham S., Dickow B., Heath E., Fontana J., Vaishampayan U. Neutrophil lymphocyte ratio and duration of prior anti-angiogenic therapy as biomarkers in metastatic RCC receiving immune checkpoint inhibitor therapy. J. Immunother. Cancer. 2017; 5 (1): 82. DOI: https://doi.org/10.1186/ s40425-017-0287-5 PMID: 29041991.
26. Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Аль Худур С.А, Пичугин А.В., Лебедева Е.С. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения - новый подход в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388
27. Атауллаханов Р.М., Пичугин А.В., Мельникова Т.М., Хаитов Р.М. Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученное этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе. Патент РФ 2195308, приоритет от 16.11.2001, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 27.12.2002.
28. Agata Y., Kawasaki A., Nishimura H., Ishida Y., Tsubata T., Yagita H., Honjo T. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. Int. Immunol. 1996; 8 (5): 76572. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/8.5.765 PMID: 8671665.
29. Masteller E.L., Chuang E., Mullen A.C., Reiner S.L., Thompson C.B. Structural analysis of CTLA-4 function in vivo. J. Immunol. 2000; 164 (10): 5319-27. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.10.5319.
30. Li J., Jie H.B., Lei Y., Gildener-Leapman N., Trivedi S., Green T., Kane L.P., Ferris R.L. PD-1/SHP-2 inhibits Tc1/Th1 phenotypic responses and the activation of T cells in the tumor microenvironment. Cancer Res. 2015; 75 (3): 508-18. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-1215 PMID: 25480946.
31. Contardi E., Palmisano G.L., Tazzari P.L., Martelli A.M., Fala F., Fabbi M., Kato T., Lucarelli E., Donati D., Polito L., Bolognesi A., Ricci F., Salvi S., Gargaglione V., Mantero S., Alberghini M., Ferrara G.B., Pistillo M.P. CTLA-4 is constitutively expressed on tumor cells and can trigger apoptosis upon ligand interaction. Int. J. Cancer. 2005; 117 (4): 538-50. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.21155 PMID: 15912538.
32. Pentcheva-Hoang T., Egen J.G., Wojnoonski K., Allison J.P. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity. 2004; 21 (3): 401-13. DOI: https://doi.org/10.1016/j. immuni.2004.06.017 PMID: 15357951.
33. Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Sharpe A.H. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 2008; 26: 677704. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.26.021607.090331.
34. Batlle E., Massague J. Transforming growth factor-p signaling in immunity and cancer. Immunity. 2019; 50 (4): 924-40. DOI: https://doi. org/10.1016/j.immuni.2019.03.024 PMID: 30995507.
35. Brencicova E., Jagger A.L., Evans H.G., Georgouli M., Laios A., Attard Montalto S., Mehra G., Spencer J., Ahmed A.A., Raju-Kankipati S., Taams L.S., Diebold S.S. Interleukin-10 and prostaglandin E2 have complementary but distinct suppressive effects on Toll-like receptor-mediated dendritic cell activation in ovarian carcinoma. PLoS One. 2017; 12 (4): e0175712. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175712.
36. Zhai L., Bell A., Ladomersky E., Lauing K.L., Bollu L., Sosman J.A., Zhang B., Wu J.D., Miller S.D., Meeks J.J., Lukas R.V., Wyatt E., Doglio L., Schiltz G.E., McCusker R.H., Wainwright D.A. Immunosuppressive IDO in cancer: mechanisms of action, animal models, and targeting strategies. Front. Immunol. 2020; 11: 1185. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.01185 PMID: 32612606.
37. Bagaev A., Pichugin A., Nelson E.L., Agadjanyan M.G., Ghochikyan A., Ataullakhanov R.I. Anticancer mechanisms in two murine bone marrow-derived dendritic cell subsets activated with TLR4 agonists. J. Immunol. 2018; 200 (8): 2656-69. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1701126
38. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11
39. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakhanov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: http://dx.doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x PMID: 30055563.
40. Никонова А.А., Пичугин А.В., Чулкина М.М., Лебедева Е.С., Гайсина А.Р., Шиловский И. П, Атауллаханов Р.И., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. Иммуномакс - агонист TLR4 - влияет на фенотип легочных макрофагов при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у мышей. Acta Naturae. 2018; 10 (4): 95-9. PMID: 30713767.
41. Пичугин А.В., Багаев А.В., Чулкина М.М., Бержицкая Д.А., Шишкова Н.М. Атауллаханов Р.И. Иммуномодулятор «Иммуномакс» активирует дендритные клетки. Иммунология. 2015; 36 (4): 200-5.
42. Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Багаев А.В., Пичугин А.В., Ата-уллаханов Р.И. Комбинированная иммунотерапия метастатической карциномы у лабораторных мышей путем резекции первичного опухолевого узла и последующего перепрограммирования макрофагов и дендритных клеток с помощью агониста TLR4. Иммунология. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501
43. Nedoszytko B., Lange M., Sokolowska-Wojdylo M., Renke J., Trzonkowski P., Sobjanek M., Szczerkowska-Dobosz A., Niedoszytko M., Gorska A., Romantowski J., Skokowski J., Kalinowski L., Nowicki R. The role of regulatory T cells and genes involved in their differentiation in pathogenesis of selected inflammatory and neoplastic skin diseases. Part I: Treg properties and functions. Postepy Dermatol. Alergol. 2017; 34 (4): 285-94. DOI: https://doi.org/10.5114/ada.2017.69305 PMID: 28951701.
44. Sokol C.L., Luster A.D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2015; 7 (5): a016303. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016303 PMID: 25635046
45. Kiss M., Caro A.A., Raes G., Laoui D. Systemic reprogramming of monocytes in cancer. Front. Oncol. 2020; 10: 1399. DOI: https://doi. org/10.3389/fonc.2020.01399 PMID: 33042791.
46. Lisi L., Ciotti G.M.P., Braun D., Kalinin S., Curro D., Dello Russo C., Coli A., Mangiola A., Anile C., Feinstein D.L., Navarra P.
Expression of iNOS, CD163 and ARG-1 taken as Ml and M2 markers of microglial polarization in human glioblastoma and the surrounding normal parenchyma. Neurosci. Lett. 2017; 645: 106-12. DOI: https://doi. org/10.1016/j.neulet.2017.02.076
47. Lu G., Zhang R., Geng S., Peng L., Jayaraman P., Chen C., Xu F., Yang J., Li Q., Zheng H., Shen K., Wang J., Liu X., Wang W., Zheng Z., Qi C.F., Si C., He J.C., Liu K., Lira S.A., Sikora A.G., Li L., Xiong H. Myeloid cell-derived inducible nitric oxide synthase suppresses M1 macrophage polarization. Nat. Commun. 2015; 6: 6676. DOI: https://doi. org/10.1038/ncomms7676 PMID: 25813085.
48. Rhee I. Diverse macrophages polarization in tumor microenvironment. Arch. Pharm. Res. 2016; 39 (11): 1588-96. DOI: https://doi.org/10.1007/s12272-016-0820-y PMID: 27562774.
49. Masucci M.T., Minopoli M., Carriero M.V. Tumor associated neutrophils. their role in tumorigenesis, metastasis, prognosis and therapy. Front. Oncol. 2019; 9: 1146. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2019.01146.
50. Fridlender Z.G., Sun J., Kim S., Kapoor V., Cheng G., Ling L., Worthen G.S., Albelda S.M. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: «N1» versus «N2» TAN. Cancer Cell. 2009; 16 (3): 183-94. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.ccr.2009.06.017 PMID: 19732719.
51. Finisguerra V., Di Conza G., Di Matteo M., Serneels J., Costa S., Thompson A.A., Wauters E., Walmsley S., Prenen H., Granot Z., Casaz-za A., Mazzone M. MET is required for the recruitment of anti-tumoural neutrophils. Nature. 2015; 522 (7556): 349-53. DOI: https://doi. org/10.1038/nature14407 PMID: 25985180.
■ References
1. Freeman G.J., Long A.J., Iwai Y., Bourque K., Chernova T., Nishimura H., Fitz L.J., Malenkovich N., Okazaki T., Byrne M.C., Horton H.F., Fouser L., Carter L., Ling V., Bowman M.R., Car-reno B.M., Collins M., Wood C.R., Honjo T. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med. 2000; 192 (7): 1027-34. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.192.7.1027 PMID: 11015443.
2. Leach D.R., Krummel M.F., Allison J.P. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science. 1996; 271 (5256): 1734-6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.271.5256.1734 PMID: 8596936.
3. Pauken K.E., Sammons M.A., Odorizzi P.M., Manne S., Godec J., Khan O., Drake A.M., Chen Z., Sen D.R., Kurachi M., Barnitz R.A., Bartman C., Bengsch B., Huang A.C., Schenkel J.M., Vahedi G., Hai-ning W.N., Berger S.L., Wherry E.J. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science. 2016; 354 (6316): 1160-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaf2807.
4. Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubbenhorst B., D'Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amara-vadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathanson K.L., Wolchok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079 PMID: 28397821.
5. Paterson A.M., Brown K.E., Keir M.E., Vanguri V.K., Riella L.V., Chandraker A., Sayegh M.H., Blazar B.R., Freeman G.J., Sharpe A.H. The programmed death-1 ligand 1:B7-1 pathway restrains diabetogenic effector T cells in vivo. J. Immunol. 2011; 187 (3): 1097-105. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.1003496 PMID: 21697456.
6. Schadendorf D., Hodi F.S., Robert C., Weber J.S., Margolin K., Hamid O., Patt D., Chen T.T., Berman D.M., Wolchok J.D. Pooled analysis of long-term survival data from phase II and phase III trials of ipilimumab in unresectable or metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2015; 33 (17): 1889-94. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.2014.56.2736.
7. O'MahonyD., Morris J.C., Quinn C., Gao W., Wilson W.H., Gause B., Pittaluga S., Neelapu S., Brown M., Fleisher T.A., Gulley J.L., Schlom J., Nussenblatt R., Albert P., Davis T.A., Lowy I., Petrus M., Waldmann T.A., Janik J.E. A pilot study of CTLA-4 blockade after cancer vaccine failure in patients with advanced malignancy. Clin. Cancer Res. 2007; 13 (3): 95864. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-06-1974.
8. Fong L., Kwek S.S., O'Brien S., Kavanagh B., McNeel D.G., Weinberg V., Lin A.M., Rosenberg J., Ryan C.J., Rini B.I., Small E.J. Potentiating endogenous antitumor immunity to prostate cancer through combination immunotherapy with CTLA4 blockade and GM-CSF. Cancer Res. 2009; 69 (2): 609-15. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-3529 PMID: 19147575.
9. Sharma P., Pachynski R.K., Narayan V., Flechon A., Gravis G., Galsky M.D., Mahammedi H., Patnaik A., Subudhi S.K., Ciprotti M., Simsek B., Saci A., Hu Y., Han G.C., Fizazi K. Nivolumab plus ipilimumab for metastatic castration-resistant prostate cancer: preliminary analysis of patients in the checkmate 650 trial. Cancer Cell. 2020; 38 (4): 489-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.08.007 PMID: 32916128.
10. Ferris R.L., Blumenschein G. Jr., Fayette J., Guigay J., ColevasA.D., Licitra L., Harrington K., Kasper S., Vokes E.E., Even C., Worden F., Saba N.F., Iglesias Docampo L.C., Haddad R., Rordorf T., Kiyota N., Tahara M., Monga M., Lynch M., Geese W.J., Kopit J., Shaw J.W., Gillison M.L. Nivolumab for recurrent squamous-cell carcinoma of the head and neck. N. Engl. J. Med. 2016; 375 (19): 1856-67. DOI: https://doi. org/10.1056/NEJMoa1602252 PMID: 27718784.
11. Sharma P., Retz M., Siefker-Radtke A., Baron A., Necchi A., Bedke J., Plimack E.R., Vaena D., Grimm M.O., Bracarda S., Arranz J.A., Pal S., Ohyama C., Saci A., Qu X., Lambert A., Krishnan S., Azrilevich A., Galsky M.D. Nivolumab in metastatic urothelial carcinoma after platinum therapy (CheckMate 275): a multicentre, single-arm, phase 2 trial. Lancet Oncol. 2017; 18 (3): 312-22. DOI: https://doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30065-7 PMID: 28131785.
12. Motzer R.J., Escudier B., McDermott D.F., George S., Hammers H.J., Srinivas S., Tykodi S.S., Sosman J.A., Procopio G., Pli-mack E.R., Castellano D., Choueiri T.K., Gurney H., Donskov F., Bono P., Wagstaff J., Gauler T.C., Ueda T., Tomita Y., Schutz F.A., Kollmannsber-ger C., Larkin J., Ravaud A., Simon J.S., Xu L.A., Waxman I.M., Sharma P. CheckMate 025 Investigators. Nivolumab versus everolimus in advanced renal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 2015; 373 (19): 1803-13. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1510665 PMID: 26406148.
13. El-Khoueiry A.B., Sangro B., Yau T., Crocenzi T.S., Kudo M., Hsu C., Kim T.Y., Choo S.P., Trojan J., Welling T.H. Rd., Meyer T., Kang Y.K., Yeo W., Chopra A., Anderson J., Dela Cruz C., Lang L., Neely J., Tang H., Dastani H.B., Melero I. Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040): an open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial. Lancet. 2017; 389 (10 088): 2492-502. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31046-2 PMID: 28434648.
14. Overman M.J., McDermott R., Leach J.L., Lonardi S., Lenz H.J., Morse M.A., Desai J., Hill A., Axelson M., Moss R.A., Goldberg M.V., Cao Z.A., Ledeine J.M., Maglinte G.A., Kopetz S., André T. Nivolumab in patients with metastatic DNA mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high colorectal cancer (CheckMate 142): an open-label, multicentre, phase 2 study. Lancet Oncol. 2017; 18 (9): 1182-91. DOI: https://doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30422-9 PMID: 28734759.
15. Ansell S.M., Lesokhin A.M., Borrello I., Halwani A., Scott E.C., Gutierrez M., Schuster S.J., Millenson M.M., Cattry D., Freeman G.J., Rodig S.J., Chapuy B., Ligon A.H., Zhu L., Grosso J.F., Kim S.Y., Timmerman J.M., Shipp M.A., Armand P. PD-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med. 2015; 372 (4): 311-9. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1411087.
16. Herbst R.S., Soria J.C., Kowanetz M., Fine G.D., Hamid O., Gordon M.S., Sosman J.A., McDermott D.F., Powderly J.D., Get-tinger S.N., Kohrt H.E., Horn L., Lawrence D.P., Rost S., Leabman M., Xiao Y., Mokatrin A., Koeppen H., Hegde P.S., Mellman I., Chen D.S., Hodi F.S. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 2014; 515 (7528): 563-7. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14011 PMID: 25428504.
17. Schmid P., Adams S., Rugo H.S., Schneeweiss A., Barrios C.H., Iwata H., Diéras V., Hegg R., Im S.A., Shaw Wright G., Henschel V, Molinero L., Chui S.Y., Funke R., Husain A., Winer E.P., Loi S., Emens L.A. IMpassion130 Trial Investigators. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. N. Engl. J. Med. 2018; 379 (22): 2108-21. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1809615.
18. Martens A., Wistuba-Hamprecht K., Geukes Foppen M., Yuan J., Postow M.A., Wong P., Romano E., Khammari A., Dreno B., Capone M., Ascierto P.A., Di Giacomo A.M., Maio M., Schilling B., Sucker A., Schadendorf D., Hassel J.C., Eigentler T.K., Martus P., Wolchok J.D., Blank C., Pawelec G., Garbe C., Weide B. Baseline peripheral blood biomarkers associated with clinical outcome of advanced melanoma patients treated with ipilimumab. Clin. Cancer Res. 2016; 22 (12): 2908-18. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-15-2412 PMID: 26787752.
19. Jacquelot N., Roberti M.P., Enot D.P., Rusakiewicz S., Ternès N., Jegou S., Woods D.M., Sodré A.L., Hansen M., Meirow Y., Sade-Feld-man M., Burra A., Kwek S.S., Flament C., Messaoudene M.,
Duong C.P.M., Chen L., Kwon B.S., Anderson A.C., Kuchroo V.K., Weide B., Aubin F., Borg C., Dalle S., Beatrix O., Ayyoub M., Balme B., Tomasic G., Di Giacomo A.M., Maio M., Schadendorf D., Melero I., Dréno B., Khammari A., Dummer R., Levesque M., Koguchi Y., Fong L., Lotem M., Baniyash M., Schmidt H., Svane I.M., Kroemer G., Marabelle A., Michiels S., Cavalcanti A., Smyth M.J., Weber J.S., Eggermont A.M., Zitvogel L. Predictors of responses to immune checkpoint blockade in advanced melanoma. Nat. Commun. 2017; 8 (1): 592. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-017-00608-2 PMID: 28928380.
20. Passaro A., Mancuso P., Gandini S., Spitaleri G., Labanca V., Guerini-Rocco E., Barberis M., Catania C., Del Signore E., de Marinis F., Bertolini F. Gr-MDSC-linked asset as a potential immune biomarker in pretreated NSCLC receiving nivolumab as second-line therapy. Clin. Transl. Oncol. 2020; 22 (4): 603-11. DOI: https://doi.org/10.1007/s12094-019-02166-z PMID: 31254252.
21. Santegoets S.J., Stam A.G., Lougheed S.M., Gall H., Scholten P.E., Reijm M., Jooss K., Sacks N., Hege K., Lowy I., Cuillerot J.M., von Blomberg B.M., Scheper R.J., van den Eertwegh A.J., Gerritsen W.R., de Gruijl T.D. T cell profiling reveals high CD4+CTLA-4 + T cell frequency as dominant predictor for survival after prostate GVAX/ ipilimumab treatment. Cancer Immunol. Immunother. 2013; 62 (2): 24556. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-012-1330-5 PMID: 22878899.
22. Karzai F., VanderWeele D., Madan R.A., Owens H., Cordes L.M., Hankin A., Couvillon A., Nichols E., Bilusic M., Beshiri M.L., Kelly K., Krishnasamy V., Lee S., Lee M.J., Yuno A., Trepel J.B., Merino M.J., Dittamore R., Marté J., Donahue R.N., Schlom J., Killian K.J., Meltzer P.S., Steinberg S.M., Gulley J.L., Lee J.M., Dahut W.L. Activity of durvalumab plus olaparib in metastatic castration-resistant prostate cancer in men with and without DNA damage repair mutations. J. Immunother. Cancer. 2018; 6 (1): 141. DOI: https://doi.org/10.1186/ s40425-018-0463-2 PMID: 30514390
23. Chalfin H.J., Pramparo T., Mortazavi A., Niglio S.A., Schon-hoft J.D., Jendrisak A., Chu Y.L., Richardson R., Krupa R., Anderson A.K.L., Wang Y., Dittamore R., Pal S.K., Lara P.N., Stein M.N., Quinn D.I., Steinberg S.M., Cordes L.M., Ley L., Mallek M., Sierra Ortiz O., Costello R., Cadena J., Diaz C., Gulley J.L., Dahut W.L., Streicher H., Wright J.J., Trepel J.B., Bottaro D.P., Apolo A.B. Circulating tumor cell subtypes and T-cell populations as prognostic biomarkers to combination immunotherapy in patients with metastatic genitourinary cancer. Clin. Cancer Res. 2021; 27 (5): 1391-8. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-20-2891 PMID: 33262136.
24. Terranova-Barberio M., Pawlowska N., Dhawan M., Moasser M., Chien A.J., Melisko M.E., Rugo H., Rahimi R., Deal T., Daud A., Rosenblum M.D., Thomas S., Munster P.N. Exhausted T cell signature predicts immunotherapy response in ER-positive breast cancer. Nat. Commun. 2020; 11 (1): 3584. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17414-y PMID: 32681091.
25. Jeyakumar G., Kim S., Bumma N., Landry C., Silski C., Suisham S., Dickow B., Heath E., Fontana J., Vaishampayan U. Neutrophil lymphocyte ratio and duration of prior anti-angiogenic therapy as biomarkers in metastatic RCC receiving immune checkpoint inhibitor therapy. J. Immunother. Cancer. 2017; 5 (1): 82. DOI: https://doi.org/10.1186/ s40425-017-0287-5 PMID: 29041991.
26. Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Al' Khudhur S., Pichu-gin A.V., Lebedeva E.S. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment - a new approach in the immunotherapy of malignant neoplasms. Immunologiya. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388 (in Russian)
27. Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V., Mel'nikova T.M., Khai-tov R.M. A method of producing a substance with immunostimulating, antiviral and, antimicrobial activity, a substance produced by this method and its pharmaceutical compositions. Russian Patent Application RU 2195308, priority date: November 11, 2001. (in Russian)
28. Agata Y., Kawasaki A., Nishimura H., Ishida Y., Tsubata T., Yagita H., Honjo T. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. Int. Immunol. 1996; 8 (5): 765-72. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/8.5.765 PMID: 8671665.
29. Masteller E.L., Chuang E., Mullen A.C., Reiner S.L., Thompson C.B. Structural analysis of CTLA-4 function in vivo. J. Immunol. 2000; 164 (10): 5319-27. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.10.5319.
30. Li J., Jie H.B., Lei Y., Gildener-Leapman N., Trivedi S., Green T., Kane L.P., Ferris R.L. PD-1/SHP-2 inhibits Tc1/Th1 phenotypic responses and the activation of T cells in the tumor microenvironment. Cancer Res. 2015; 75 (3): 508-18. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-1215 PMID: 25480946.
31. Contardi E., Palmisano G.L., Tazzari P.L., Martelli A.M., Falà F., Fabbi M., Kato T., Lucarelli E., Donati D., Polito L., Bolognesi A.,
Ricci F., Salvi S., Gargaglione V., Mantero S., Alberghini M., Ferrara G.B., Pistillo M.P. CTLA-4 is constitutively expressed on tumor cells and can trigger apoptosis upon ligand interaction. Int. J. Cancer. 2005; 117 (4): 538-50. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.21155 PMID: 15912538.
32. Pentcheva-Hoang T., Egen J.G., Wojnoonski K., Allison J.P. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity. 2004; 21 (3): 401-13. DOI: https://doi.org/10.1016/j. immuni.2004.06.017 PMID: 15357951.
33. Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Sharpe A.H. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 2008; 26: 677704. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.26.021607.090331.
34. Batlle E., Massague J. Transforming growth factor-ß signaling in immunity and cancer. Immunity. 2019; 50 (4): 924-40. DOI: https://doi. org/10.1016/j.immuni.2019.03.024 PMID: 30995507.
35. Brencicova E., Jagger A.L., Evans H.G., Georgouli M., Laios A., Attard Montalto S., Mehra G., Spencer J., Ahmed A.A., Raju-Kankipati S., Taams L.S., Diebold S.S. Interleukin-10 and prostaglandin E2 have complementary but distinct suppressive effects on Toll-like receptor-mediated dendritic cell activation in ovarian carcinoma. PLoS One. 2017; 12 (4): e0175712. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175712.
36. Zhai L., Bell A., Ladomersky E., Lauing K.L., Bollu L., Sosman J.A., Zhang B., Wu J.D., Miller S.D., Meeks J.J., Lukas R.V., Wyatt E., Doglio L., Schiltz G.E., McCusker R.H., Wainwright D.A. Immunosuppressive IDO in cancer: mechanisms of action, animal models, and targeting strategies. Front. Immunol. 2020; 11: 1185. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.01185 PMID: 32612606.
37. Bagaev A., Pichugin A., Nelson E.L., Agadjanyan M.G., Ghochikyan A., Ataullakhanov R.I. Anticancer mechanisms in two murine bone marrow-derived dendritic cell subsets activated with TLR4 agonists. J. Immunol. 2018; 200 (8): 2656-69. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.1701126
38. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Garaeva A.Y., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. The cooperative interaction of TLR4-, TLR9- and NOD2-signaling pathways in mouse macrophages. Immunologiya. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11 (in Russian)
39. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakha-nov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: http://dx.doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x PMID: 30055563.
40. Nikonova A., Pichugin A., Chulkina M., Lebedeva E., Gaysina A., Shilovsky I., Ataullakhanov R., Khaitov M., Khaitov R. The TLR4 agonist immunomax affects the phenotype of mouse lung macrophages during respiratory syncytial virus infection. Acta Naturae. 2018; 10 (4): 95-9. PMID: 30713767. (in Russian)
41. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Chulkina M. M., Berzhitskaya D. A., Shishkova N. M., Ataullakhanov R. I. Immunomodulator «Immunomax» activates dendritic cells. Immunologiya. 2015; 36 (4): 200-5. (in Russian)
42. Ushakova E.I., Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Combined immunotherapy of metastatic carcinoma by resection of the primary tumor and subsequent reprogramming of macrophages and dendritic cells using a TLR4 agonist in laboratory mice. Immunologiya. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501 (in Russian)
43. Nedoszytko B., Lange M., Sokolowska-Wojdylo M., Renke J., Trzonkowski P., Sobjanek M., Szczerkowska-Dobosz A., Niedoszytko M., Gorska A., Romantowski J., Skokowski J., Kalinowski L., Nowicki R. The role of regulatory T cells and genes involved in their differentiation in pathogenesis of selected inflammatory and neoplastic skin diseases. Part I: Treg properties and functions. Postepy Dermatol. Alergol. 2017; 34 (4): 285-94. DOI: https://doi.org/10.5114/ada.2017.69305.
44. Sokol C.L., Luster A.D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2015; 7 (5): a016303. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016303 PMID: 25635046
45. Kiss M., Caro A.A., Raes G., Laoui D. Systemic reprogramming of monocytes in cancer. Front. Oncol. 2020; 10: 1399. DOI: https://doi. org/10.3389/fonc.2020.01399 PMID: 33042791.
46. Lisi L., Ciotti G.M.P., Braun D., Kalinin S., Curro D., Dello Russo C., Coli A., Mangiola A., Anile C., Feinstein D.L., Navarra P. Expression of iNOS, CD163 and ARG-1 taken as M1 and M2 markers of microglial polarization in human glioblastoma and the surrounding normal parenchyma. Neurosci. Lett. 2017; 645: 106-12. DOI: https://doi. org/10.1016/j.neulet.2017.02.076
47. Lu G., Zhang R., Geng S., Peng L., Jayaraman P., Chen C., Xu F., Yang J., Li Q., Zheng H., Shen K., Wang J., Liu X., Wang W., Zheng Z., Qi C.F., Si C., He J.C., Liu K., Lira S.A., Sikora A.G., Li L., Xiong H. Myeloid cell-derived inducible nitric oxide synthase suppresses Ml macrophage polarization. Nat. Commun. 2015; 6: 6676. DOI: https://doi. org/10.1038/ncomms7676 PMID: 25813085.
48. Rhee I. Diverse macrophages polarization in tumor microenvironment. Arch. Pharm. Res. 2016; 39 (11): 1588-96. DOI: https://doi. org/10.1007/s12272-016-0820-y PMID: 27562774.
49. Masucci M.T., Minopoli M., Carriero M.V. Tumor associated neutrophils. their role in tumorigenesis, metastasis, prognosis and therapy.
Сведения об авторах
Пичугин Алексей Васильевич - канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Подсвирова Светлана Андреевна - студент каф. иммунологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: sveta2908@yandex.ru
Ушакова Екатерина Игоревна - мл. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Спирин Данил Максимович - студент каф. иммунологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: denspiry@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-6299-5494
Лебедева Екатерина Семеновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Атауллаханов Равшан Иноятович - д-р мед. наук, проф., руководитель отд. иммунной биотехнологии, зав. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Front. Oncol. 2019; 9: 1146. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2019. 01146.
50. Fridlender Z.G., Sun J., Kim S., Kapoor V., Cheng G., Ling L., Worthen G.S., Albelda S.M. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: «N1» versus «N2» TAN. Cancer Cell. 2009; 16 (3): 183-94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccr.2009.06.017.
51. Finisguerra V., Di Conza G., Di Matteo M., Serneels J., Costa S., Thompson A.A., Wauters E., Walmsley S., Prenen H., Granot Z., Casaz-za A., Mazzone M. MET is required for the recruitment of anti-tumoural neutrophils. Nature. 2015; 522 (7556): 349-53. DOI: https://doi. org/10.1038/nature14407 PMID: 25985180.
Authors' information
Alexey V. Pichugin - PhD, Leader Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Svetlana A. Podsvirova - Student of Immunology Chair, Biological Faculty of M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: sveta2908@yandex.ru
Ekaterina I. Ushakova - Junior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Danil M. Spirin - Student of Immunology Chair, Biological Faculty of M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation Moscow, Russian Federation E-mail: denspiry@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-6299-5494
Ekaterina S. Lebedeva - PhD, Senior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Ravshan I. Ataullakhanov - MD, PhD, Prof., Head of Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409