CC BY
7
23B
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, СТАБИЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ
В.С. Усатова1, М.А. Берестовой1,
Н.М. Мишина2, A.B. Иваненко3, Д. Джэппи1,
А.В. Розов1, В.В. Белоусов1, 2
1 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА, Москва, Россия
2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН, Москва, Россия
3 Центр высокоточного редактирования
и генетических технологий для биомедицины, РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
e-mail: usatova.v@fccps.ru
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры.
В данной работе был разработан подход для исследования внутриклеточных окислительно-восстановительных процессов в течение нейральной дифференциров-ки, а также на модели ишемической патологии нервной системы. Для этого с помощью CRISPR/Cas9 системы было создано несколько линий ИПСК человека, стабильно экспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры HyPer7 [2], SoNar [3] и SypHer3s [4], детектирующие ключевые показатели окислительно-восстановительных процессов — H2O2, соотношение NAD+/NADH и pH соответственно.
В данном исследовании была осуществлена полная дифференцировка линии ИПСК-HyPe^ в нейральном направлении до получения функционально зрелых нейронов. В процессе дифференцировки проводились прижизненные наблюдения за изменением внутриклеточных окислительно-восстановительных параметров с помощью флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что на стадии получения нейральных предшественников происходит значительное повышение уровня продукции Н2О2 в цитоплазме большинства клеток по сравнению с клетками на предшествующих и последующих стадиях дифференцировки.
Далее была исследована возможность применения линии ИПСК-HyPe^ в экспериментах по моделированию ишемической патологии нервной системы, на примере нейроглиальных органоидов человека. Моделью ишемии-реперфузии являлась кислородно-глюкозная депривация, с последующей реоксигенацией и восстановлением контрольного уровня глюкозы в среде. Реализацию требуемых условий осуществляли на экспериментальной установке [5], которая позволяет точно и быстро контролировать изменения уровня кислорода в среде в процессе флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что падение уровня кислорода в среде сопровождается изменением уровня Н2О2 в цитоплазме клеток в составе органоидов.
Литература:
1. Kostyuk A.I., Demidovich A.D., Kotova D.A. et al. International Journal of Molecular Sciences. 2019. V. 20. 4200.
2. Pak V.V., Ezerina D., Lyublinskaya O.G. et al. Cell metabolism. 2020. V. 31, № 3. P.642-653.
3. Zhao Y., Hu Q., Cheng F. et al. Cell metabolism. 2015. V. 21, № 5. P. 777-789.
4. Ermakova Y.G., Pak V.V., Bogdanova Y.A. et al. Chemical Communications. 2018. V. 54, № 23. P. 2898-290.
5. Kelmanson I.V., Shokhina A.G., Kotova D.A. et al. Redox Biology. 2021. V.48. 102178
ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗ И ФОСФОЛИПАЗ
В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК
В.А. Усачёв1, М.В. Воронцова2, К.Ю. Кулебякин1, 2,
П.А. Тюрин-Кузьмин1, И.В. Зубарев1
1 Факультет фундаментальной медицины, ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт Регенеративной Медицины, Медицинский научно-образовательный центр, ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: usachjov-vova@mail.ru
Ключевые слова: паратиреоидный гормон, аденилатцикла-
за, фосфолипаза, МСК, дифференцировка.
Мутации, происходящие в рецепторе или Ga-субъединице G-белка, нарушает передачу внутриклеточного сигнала и вызывают различные физиологические нарушения. Так, например, мутация в Gsa, связанного с PTH-рецептором, вызывает псевдогипопа-ратиреоз с наследственной остеодистрофией Олбрайта. Заболевание вызвано нарушает процессы дифференцировки клеток, обрывая передачу сигнала паратиреоидно-го гормона [1]. При подобных нарушениях, мишенью для фармокологических препаратов может служить следующее звено GPCR-сигнального пути — аденилатциклазы и фосфолипазы Cß.
Целью данной работы являлось выявление изменения профиля экспрессии различных изоформ аденилат-циклаз и фосфолипаз Cß в процессе дифференцировки МСК из разных источников. Методом real-time PCR был определен уровень экспрессии аденилатциклаз и фос-фолипаз Cß на 5, 10 и 15 сутки адипогенной и остеоген-ной дифференцировок МСК, полученных у здоровых доноров из жировой ткани и надкостницы.
В результате было показано, что в процессе дифференцировки МСК в адипогенном и остеогенном направлениях происходит изменение экспрессии некоторых изоформ аденилатциклаз и фосфолипаз Cß. Так адени-латциклаза 1 растет при остеогенной дифференцировке в МСК из жировой ткани, но падает в МСК из надкостницы и растет при адипогенной дифференцировке в обеих популяциях МСК. Аденилатциклаза 3 в МСК из надкостницы возрастает при остеогенной дифференцировке и МСК из жировой ткани при адипогенной дифференцировке. Экспрессия аденилатциклазы 6 падает при остеогенной дифференцировке в МСК из жировой ткани, но растет в МСК из надкостницы и растет при адипогенной диффе-ренцировке в обеих популяциях МСК. Аденилатциклаза 7 падает во всех источниках и дифференцировках по сравнению с контролем. Аденилатциклаза 8 растет при остеогенной дифференцировке МСК из жировой ткани и снижается в МСК из надкостницы.
Фосфолипазы Cß 1 и 3 ведут себя схожим образом. В МСК надкостницы они снижают свою экспрессию при адипогенной дифференцировке и незначительно возрастает при остеогенной. В МСК жировой ткани наблюдается различия во времени ответа: при адипогенной дифференцировке максимальный уровень экспрессии наблюдается на 5 сутки дифференцировки и постепенно снижается. В то время как их экспрессия при остеогенной
Гены & Клетки XVII, №3, 2G22
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
237
дифференцировке постепенно растет, достигая максимума к 15 суткам.
Таким образом, наши результаты впервые описывают феномен переключения экспрессии различных типов аденилатциклаз и фосфолипаз Cß при дифференцировке МСК. Подобное переключение вероятно необходимо для регуляции направления и эффективности дифференцировки.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ (№ 1975-30007, Фундаментальные проблемы регенеративной медицины: регуляция обновления и репарации тканей человека).
Литература:
1. Thiele S., Mantovani G., Barlier A. et al. Eur J Endocrinol. 2016.
V. 175. P. 1-17.
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ИММУННОЛОГИЧЕСКИЙ И СЕКРЕТОРНЫЙ ПРОФИЛЬ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Д.Ю. Усупжанова, Т.А. Астрелина, И.В. Кобзева, Ю.Б. Сучкова, В.А. Брунчуков, А.А. Расторгуева, В.А. Никитина, Т.Ф. Маливанова, Е.Е. Ломоносова, А.А. Самойлов
ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им.А.И. Бурназяна, Москва, Россия
e-mail: usupzhanova94@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, малые дозы радиации, рентгеновское излучение, иммунологический профиль, секреторный профиль.
На протяжении жизни человек неизбежно подвергается воздействию малых доз (от 10 до 100 мГр [1]) ионизирующего излучения (ИИ) [2]. Учитывая неизбежно растущее количество источников малых доз ИИ в современном мире, можно сказать, что точная оценка рисков, связанных с облучением в малых дозах, является важной задачей общественного здравоохранения [2]. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК), являющиеся регенеративным резервом взрослого организма, выступают перспективной моделью для изучения эффектов облучения. Благодаря своей способности к самоподдержанию, МСК находятся в организме человека длительный период времени и могут подвергаться нескольким раундам облучения, накапливая в себе произошедшие изменения и передавая их следующим поколениям клеток, поскольку обладают потенциями к дифференциров-ке. В конечном счете, изменения, произошедшие в МСК, отражаются на организме человека в целом [3].
В исследовании иммунологического профиля было показано, что экспрессия поверхностных антигенов МСК слизистой ткани десны человека (CD90, CD73, CD105, CD44) изменяется под влиянием ИИ в дозах 50, 100 и 250 мГр в ранние сроки культивирования после облучения (до 16 дней). Наблюдаемые эффекты указывают на изменения важнейших функциональных характеристик МСК (в частности, степени стволовости и потенций к дифференцировке), а сами поверхностные антигены представляются перспективным критерием оценки последствий воздействия ИИ.
В исследовании секреторного профиля клеток было показано, что малые и средние дозы ИИ приводят к развитию противоположных воспалительных реакций в ранние
сроки культивирования после облучения (48 часов): облучение малыми дозами 50 и 100 мГр приводит к повышению концентрации ИЛ-6 и снижению концентрации ИЛ-8 в кондиционированных средах клеток, в то время как для средних доз 250 и 1000 мГр наблюдается обратная ситуация. В отдаленные сроки культивирования после облучения (43 и 64 день) для всех исследуемых облученных групп МСК показано снижение концентраций ИЛ-6 и ИЛ-8, свидетельствующее об угнетении их функциональной иммуномодулирующей активности.
Обобщая полученные результаты, был сделан вывод о влиянии малых доз рентгеновского излучения на функциональные характеристики МСК, в частности, в отдаленные сроки культивирования после облучения эффекты малых доз сопоставимы с эффектами средних доз ИИ и, в целом, свидетельствуют об угнетении функциональной активности клеток.
Литература:
1. The 2007 Recommendations of the ICRP. ICRP publication 103. 2007. V. 37 (2-4). P. 1-332.
2. Fazel R, Krumholz H, Wang Y. J Vasc Sung. 2009. V. 50 (6). P. 1526-1527.
3. Squillano T, Galano G, De Rosa R. et al. Stem Cells. 2018. V. 36 (8). P. 1146-1153.
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ/ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ В РАЗЛИЧНЫХ ОЧАГАХ ИНФЕКЦИИ ИЗ ЛЕГКИХ ПАЦИЕНТОВ, БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ
Е.Г. Уфимцева1, Н.И. Еремеева2, 3
1 НИИ биохимии ФИЦ ФТМ, Новосибирск, Россия
2 Институтдезинфектологии ФБУН ФНЦГ
им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора, Москва, Россия
3 УНИИФ - филиал ФГБУ НМИЦ ФПИ Минздрава России, Екатеринбург, Россия
e-mail: ufim1@ngs.ru
Ключевые слова: пациенты с туберкулезом легких, очаги инфекции, мезенхимные стволовые/стромальные клетки, регенерация альвеол.
Туберкулез (ТБ) — заболевание, вызываемое Mycobacterium tuberculosis (Mtb), с образованием широкого спектра патологических очагов в легких пациентов с локальным или обширным ремоделированием альвеолярных тканей, известное как фиброз. Одной из актуальных проблем регенеративной медицины в современной фтизиатрической практике является восстановление структурной и функциональной целостности поврежденных ТБ тканей легких пациентов. Предполагается, при ТБ легких мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК) способны участвовать и в снижении воспалительной/иммунной реакций, дифференцируясь в фибробла-сты, и в регенерации альвеол путем трансдифференци-ровки в клетки легочного эпителия [1 ]. Однако, участие МСК в этих процессах у пациентов, больных ТБ, до сих пор не было исследовано, делая актуальным изучение их роли в патогенезе ТБ инфекции в легких человека.
Для исследования клеток, инфильтрующих ткани легких пациентов, больных ТБ, нами была разработана методика получения ex vivo культур клеток из операционного материала пациентов из стенок каверн/туберкулем и, параллельно, районов, удаленных от макро-ТБ очагов [2]. На 16-18 часах ex vivo культивирования первичные
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
