CC BY
112
с 1 га составляет соответственно 0,78; 0,73 и 0,68 т/га. а выход обменной энергии с урожаем - на 17,3...22,6 %.
Для количественной и качественной оценки кор- При этом наиболее целесообразно сочетание подсол-
ма используется кормопротеиновая единица - пока- нечника с викой и овсом. Рентабельность выращивания
затель, отражающий степень обеспеченности корма таких смесей равна 122,6 %, а коэффициент энергети-
белком. Сравнение вариантов опыта по этому пара- ческой эффективности - 1,56.
метру подтверждает выявленные ранее закономер- Выводы. По результатам исследований можно сде-ности. В ценозах с подсолнечником наибольший вы- лать заключение, что возделывание подсолнечника на
ход кормопротеиновых единиц (5,05 тыс./га) отме- силос совместно с амарантом, мальвой или донником
чен в смеси смеси с викой и овсом. однолетним позволяет существенно обогатить фитомас-
Экономическая и агроэнергетическая оценка пока- су смесей кормовым белком. Однако наиболее каче-
зала, что формирование сложных агрофитоценозов по- ственный урожай с концентрацией 119 г переваримого
зволяет повысить условно чистый доход, по сравнению с протеина на 1 корм. ед. в условиях лесостепи Самарско-
одновидовыми посевами подсолнечника, в 1,21-1,49 раз, го Заволжья формирует его смесь с викой и овсом.
Литература.
1. Пути совершенствования кормопроизводства в Самарской области / В.Г. Васин, Н.Н. Ельчанинова, А.В. Васин, С.Н. Зудилин // Известия Самарской ГСХА. - Самара, 2006. - С. 3-7.
2. Михайличенко Б.П. и др. Концепция развития кормопроизводства в Российской Федерации. - Москва, 1999. - 69 с.
3. Петрушкина А.С., Тюрин А.С. Однолетние кормовые культуры в чистых и смешанных посевах с бобовыми культурами // Кормовая база: сб. науч. трудов. - Куйбышев, 1989. - С. 67-77.
4. Сайфуллин Ф.А. Кормопроизводству научную основу // Кормопроизводство. - 1997. - №3. - С.7-8.
5. Домрачев Н.И. Амарант - забытая культура инков // Земледелие. - 1991. - № 8. - С. 13-14.
6. Кшникаткина А.Н., Гущина В.А. Новые кормовые растения. - Саратов, 1992. - 39 с.
7. Масалимов Т.М. Донник. - Уфа: Башкирское кн. изд - во, 1991. - 176 с.
8. Методические указания по проведению опытов с кормовыми культурами / Всесоюзный НИИ кормов им. В.Р. Вильямса (из - ние 2-е). - М., 1987. - 198 с.
Методические указания по проведению полевых опытов с кормовыми культурами /Россельхозакадемия. - М., 1997. - 156 с.
SUNFLOWER FOR SILAGE IN THE MIXTURE WITH HIGH-PROTEIN CROPS
V.B. Trots
Summary. This article presents information about the reasonability of seeding sunflower for silage with vetch and oats. Such grass, unlike monocultural sunflower phytocenosises, allow under production condition to increase biomass yield by 7.6 %, and yield of digestible protein - 1.6 times without significant material expenses.
Key words: sunflower, digestible protein, genotype, preserved forage, agrophytocenosises, seedlings, line-height, amaranth, malva, annual melilot, concentration of fodder protein, productivity, silage.
УДК 577 218-575 162-597 554 3
ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ РЕПОРТЕРНЫХ ГЕНОВ ТРАНСГЕННЫХ ЭМБРИОНОВ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ И РЫБ*
Л.В. КОЗИКОВA, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных
С.И. PОСОХAЦКИЙ, доктор биологических наук, профессор
A.М. ДУШЕВС^, доктор биологических наук Институт генетики и разведения животных (Польша, Ястжембец)
Л.Е. AHДPEEВA, кандидат биологических наук, ученый секретарь
Институт молекулярной генетики PAH E-mail: larkozik@list.ru
Резюме. Методом микроиъекции репортерных генов LacZ и GFP с различными промоторами получены трансгенные эмбрионы кроликов, коров и рыб. У большинства из них выявлен мозаичный паттерн экспрессии в раннем эмбриогенезе. Экспрессию GFP
*Работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований ОФИ_Ц - №09-04-13558. Достижения науки и техники АПК, №05-2010 __
и LacZ генов можно использовать для повышения эффективности трансгенеза. Кроме того, трансгенные эмбрионы могут служить генофондом для получения трансгенных клонированных животных.
Ключевые слова: трансгенные эмбрионы, мозаичный паттерн экспрессии, репортерные гены.
При введении чужеродной генетической информации непосредственно в геном эукариотов важно получение устойчивой интеграции и функционирования экзогенного материала в геноме реципиента с появлением новых признаков, наследуемых в ряду поколений. Необходимо отметить, что не все интегрированные рекомбинантные молекулы ДНК способны к экспрессии чужеродного генного продукта.
В предыдущих наших исследованиях было показано [1], что после микроинъекции генных конструкций в ранние эмбрионы животных и последующей их трансплантации большая часть эмбрионов погибает в пренатальном развитии, поэтому цель представленной работы -определение начала активации эмбрионального генома, жизнеспособности трансгенных эмбрионов и характера экспрессии генов в процессе эмбриогенеза.
Условия, материалы и методы. Для изучения экспрессии на разных этапах онтогенеза удобно использовать репортерные гены, индукцию экспрессии которых можно вызвать либо методами гистохимии, либо под влиянием ультрафиолета с определенной длиной волны. При работе с эмбрионами кроликов и коров мы использовали следующие генетические конструкции: рСМУ-LacZ, в которой последовательности гена LacZ кодировали белок В-галактозидазу, под контролем промотора цитомегаловируса; плазмиду рСН110 (фирма Pharmacia Biotech), в которой ген LacZ находился под контролем промотора SV-40. Профессор М. Okabe (Университет г. Осака, Япония) любезно предоставил генетическую конструкцию рСХ-eGFP, в которой кроме последовательностей гена GFP, кодирующего флуоресцентный зеленый белок, находится В-актиновый промотор цыпленка, энхансер цитомегаловируса и поли-А сигнал В-гло-бина кролика. Эмбрионам вьюнов в область бластодиска была инъецирована плазмида рСЕЕGFP, содержащая репортерный ген GFP под контролем фактора элонгации человека и энхансера цитомегалови-руса человека.
Трансгенные эмбрионы кроликов и коров получали методом микроинъекции репортерных генов преимущественно в мужской пронуклеус зигот при помощи микроманипулятора [2]. Гистохимическую активность В-галактозидазы определяли с помощью субстрата Х-Gal по методу [3]. Эмбрионы кроликов фиксировали и окрашивали Х-gal через 24, 48, 72 и 96 часов. Экспрессию GFP гена изучали у эмбрионов коров, полученных in vitro из ооцит кумулюсных комплексов (ОКК) через 48 и 168 часов культивирования, используя флуоресцентный микроскоп Fluover FS и стандартный фильтр FITC по общепринятой методике [4].
Существует несколько ограничений в трансгене-зе домашних животных:
низкая эффективность интеграции и экспрессии трансгенов;
потребность в большом количестве доноров и реципиентов, находящихся в эстральном цикле;
необходимость большого количества одноклеточных эмбрионов.
Именно поэтому процесс получения трансгенных коров, достаточно сложнен и дорог. Отбор трансгенных эмбрионов перед трансплантацией суро-гатным реципиентам - один из путей удешевления получения трансгенных коров.
Этой цели можно достичь при использовании репортерной генной технологии.
Один из самых распространенных репортерных генов - ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который служит хорошей прижизненной детекторной системой для трансгенных клеток и организмов. Для повышения уровня экспрессии используют модифицированный вариант GFP, в котором проводят замену кодонов на более характерные для млекопитающих [5].
Для визуализации пронуклеусов проводили центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток. Мик-
роинъекцию трансгенной конструкции рСХ-EGFP (3 нг/мкл) проводили в пронукулеус с использованием микроманипулятора Leitz. Эмбрионы контрольной и микроинъецированных групп культивировали на монослое клеток Vero/Brl в 40 мкмл среды Менезо В-2 с добавлением 10 %-ной фетальной сыворотки.
В исследованиях с трансгенными животными противоречивые данные получены о преимуществах интеграции рекомбинантных молекул ДНК в кольцевой форме и линейном варианте. Так, при введении ДНК в пронуклеусы зигот мыши интеграция в случае кольцевой формы составляла до 8 %, а в линейном варианте возрастала до 24.31% [6]. В то же время, результаты, полученные в опытах, как на мышах, так и на крысах [7], показали, что частота интеграции гена hGH не зависела от формы плазмиды с этим геном.
Оптимальным объектом для создания модели трансгенных эмбрионов, учитывающей не только паттерн экспрессии репортерных генов, но и динамику экспрессии единичных клеток на протяжении ряда генераций в эмбриогенезе - эмбрионы вьюна Misgurnus fossilis L. Плазмиду вводили в линейной и кольцевой формах. Инъекцию начинали через 20.80 мин после оплодотворения и вплоть до первого деления дробления.
Результаты и обсуждение. Введение двух репортерных генетических конструкций CMV-LacZ и SV-40-LacZ в геном кроликов сразу после оплодотворения позволило установить, что ген LacZ может служить маркером для изучения, как начальных этапов экспрессии генов, так и в процессе дальнейшего развития организма. Использование двух разных ге-терологичных промоторов не оказало значительного влияния на эффективность трансгенеза. У кроликов начало активации экспрессии гена Lac Z, под контролем CMV-промотора, выявлено на стадии 6-блас-томеров, а под контролем SV-40 промотора - на стадии 4-бластомеров. Мозаичный паттерн экспрессии был характерен для большинства эмбрионов, причем интенсивность экспрессии гетерогенна даже в пределах одного эмбриона.
В эксперименте с геном GFR на коровах к 48 часам культивирования количество поделившихся эмбрионов в контроле составило 90 %, а к 168 ча-
сам доля морул и бластоцист была равна 5Q %. После инъекции зигот средние величины этих показателей достигали 6Q,7 % и 37,7 % соответственно (табл. 1).
Очевидно, что на начальных стадиях культивирования, процесс микроинъекции оказывает негативное влияние на развитие эмбрионов коров, полученных из ОКК in vitro. Тем не менее, отсев не жизне-Достижения науки и техники АПК, №05-2010
Таблица 1. Развитие эмбрионов коров от зиготы до бластоцисты после микроинъекции гена GFP с учетом экспрессии
Число инъецированных зигот Число поделившихся эмбрионов 48 ч % Число морул и бластоцист (168 ч) % Число трансгенных эмбрионов
10 б 6O,O 4 4O,O
9 Б ББ,б 4 44,4
11 б Б4,Б З 2У,З
8 б УБ,0 4 50,0 2 Б.М.
11 У бЗ,б Б 4Б,4 1 М
12 У Бв,З З 2Б,0
Всего (61) ЗУ 2З З(4,9%)
В среднем 6O7 ЗУ,У
Контроль (10) 9 9O,O Б Б0,0
Примечание: М - морула; Б - бластоциста
способных эмбрионов, полученных in vitro при длительном культивировании, в экспериментальных группах отличается от контроля незначительно и составляет, приблизительно, третью часть от исходных величин.
Три эмбриона, среди которых два находились на стадии морулы и один - на стадии бластоцисты оказались трансгенными. У одной морулы была 100 %-ная экспрессия, то есть все клетки обладали зеленой флуоресценцией, а у другой морулы флуоресцировали только 50 % клеток. У бластоцисты отмечено четверть флуоресцирующих клеток (25 %). Следовательно, у двух последних эмбрионов отмечен мозаичный паттерн экспрессии.
Несмотря на то, что эмбрионы были подвергнуты воздействию центрифугирования (1200 g) и микроинъекции, повреждающий эффект был выявлен только на начальных стадиях развития и менее выражен на поздних стадиях развития (морула-бластоциста).
В целом доля трансгенных эмбрионов составила 4,9 % от общего числа инъецированных зигот.
В опытах с вьюнами гибель эмбрионов активно начиналась уже через сутки после оплодотворения (от 10 % при использовании кольцевой формы ДНК и 15 % - в варианте с линейной формой). Наряду с гибелью эмбрионов через 48 часов можно обнаружить зародышей с аномальными формами развития, доля которых составляла от 10 до 13 %. Очевидно, они быстро погибают, так как к 96 часам развития их количество снизилось до 3 %, а к 120 часам зародыши с явными морфологическими отклонениями практически не встречались.
Через 24 часа после микроинъекции гена GFP в среднем экспрессию наблюдали у 51 % эмбрионов вьюнов (табл. 2). Достоверные различия по количеству трансгенных эмбрионов отмечены на стадиях предличинки (120 часов развития). При использовании линейной формы плазмиды рСЕЕGFP оно было равно 91 %, а после введения кольцевой - 43,75 %.
Туловище предличинок было разделено для анализа паттерна экспрессии трансгена на 5 равных частей по длине. Отдельно был проведен учет интенсивности экспрессии в ядрах желточного синтиция.
Таблица 2. Количество эмбрионов вьюнов с экспрессией генов GFP, %
Время раз- Количество во трансгенных эмбрионов после введения рСЕЕGFP
вития линейной формы кольцевой формы
24 ч 59,09 43,75
48 ч 82,22 75.92
96ч 92,85 78,78
120ч 90,91* 67,71*
Через 96 и 120 часов развития экспрессия гена GFP в линейной или в кольцевой форме в среднем была достаточно равномерно выражена по длине туловища в эпителиальных клетках. Однако в миоцитах наиболее интенсивная экспрессия отмечена в области туловища, прилежащей к голове и к хвосту, а также в центральной части и области туловища.
Выводы. Таким образом, в результате исследования паттерна экспрессии репортерных генов, проведенного на эмбрионах кроликов, коров и рыб, была продемонстрирована активация генома на начальных этапах деления всех эмбрионов, выраженная в экспрессии чужеродных генов. Показан мозаичный паттерн экспрессии генов у большинства исследованных эмбрионов. В трансгенных мозаичных эмбрионах не все клетки содержат трансген. Это очень важная проблема при создании технологии трансгенных животных в животноводстве, тем не менее, при клонировании использовать мозаичные трансгенные эмбрионы можно. Экспрессию GFP гена можно использовать для селекции эмбрионов животных, особенно коров, что значительно повысит эффективность трансгенеза. Кроме того, трансгенные эмбрионы могут служить генофондом для получения трансгенных клонированных животных.
Статистически достоверных отличий в жизнеспособности трансгенных зародышей и в эффективности экспрессии трансгена в течение первых трех суток развития в зависимости от формы инъецируемой плазмиды (кольцевой или линейной) не обнаружено. Статистически достоверно установлена более высокая эффективность экспрессии трансгена у зародышей на стадии 120 ч развития после инъекции плазмиды в линейной форме.
Литература.
1. Козикова Л.В. Структурно-функциональная организация хромосом и изменение генома трансгенных сельскохозяйственных животных //Докт. дисс. Санкт-Петербург-Пушкин, 2005, - с.321
2. Gordon J., Ruddle. Gene transfer into mouse embryos: production of transgenic mice by pronuclear injection // Methods Enzymol. - 1983. - V.101. - P.411.
3. Thorey I.S., Meneses J.J., Neznanov N. et al., Embryonic expression of human 18 and K18-beta-galactosidase fusion genes in transgenic mice // Dev. Biol. - 1993. - V.160. - P.519-534.
4. . Duszewska A.M., Reclewski Z., Pienkowski M., Karasiewicz J., Modlinski J.A. Development of bovine embryos on Vero/ BRL cell monolayers (mixed co-culture). // Thereogenology. - 2000. - V.54 - P.1239-1247.
5. Zolotukhin S. Humanized green fluorescent protein genes and methods. Пат. США, МПК6. C12Q G01N 33/5-3. The Univ. Of Florida Res. 09.10.98. Опубл. 19.10.99. НПК 465/1.
6. Ward K., Franclin I., Murray J et al. The direct transfer of DNA by embryo microinjection. // 3rd World congress on genetics applied to livestock production. - 1986. - V.XII. - P.6-21.
7. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Трансгенные млекопетающие: изучение фенотипических эффектов гормона роста человека, интродуцированного животным. // Биотехнология. - 1987. - Т. 3. - № 3. - С. 352-357
THE PATTERN OF REPORTER GGENES EXPRESSION IN TRANGENIC EMBRYOS OF DOMESTIC
ANIMALS AND FISHES L.V. Kozikova, S.I. Rosochacki, A.M. Duszewska, L.E. Andreeva
Summary. The transgenic rabbit, cow and fish embryos were obtained by method of microinjection of reporter genes LacZ and GFP with different promoters. Mainly mosaic type of expression of GFP and LacZ genes was detected during early embryogenesis. The GFP gene pattern expression can be used for higher level of transgenesis. The transgenic embryos can be served for obtaining of transgenic, cloned animals.
Key words: transgenic embryos, mosaic pattern of expression, reporter genes.
Достижения науки и техники АПК, №05-2010 ________________________________________________________ 57
