CC BY
66
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 2
УДК 636.52/.58:573.6.086.83:636.082
ИНТЕГРАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРНЫХ
ГЕНОВ В ЭМБРИОНАХ КУР ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
РЕТРОВИРУСНЫХ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ВЕКТОРОВ*
Н.А. ВОЛКОВА1, Л.А. ВОЛКОВА1, И.К. ФОМИН1, Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, Л.Ш. ГОРЕЛИК2, Н.С. ЛОЦМАНОВА3
Изучена эффективность переноса экзогенной ДНК в эмбрионы кур in vivo с использованием ретровирусных векторов. Генные конструкции содержали маркерный ген GFP под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека CMV IE (конструкция pLNCgfp) или промотора вируса лейкемии мышей Молони Mo-MuLV (конструкция pLgfpSN). Для доставки ретровирусных векторов использовали две пакующие линии — GP + envAM12 и PT67. Установлена высокая эффективность трансформации эмбрионов при использовании генной конструкции pLNCgfp (до 18,8 %). Показана экспрессия маркерного гена в клетках 5- и 15-суточных эмбрионов кур.
Ключевые слова: клеточная инженерия, трансгенез, ретровирусные векторы, куры.
Keywords: cell engineering, transgenesis, retrovirus vectors, chicken.
Изучение биологических основ создания трансгенных форм остается актуальной задачей современной науки. Трансгенез признается неотъемлемой частью биотехнологий будущего, сориентированныгх на решение широкого спектра задач фундаментального и прикладного характера. Одно из перспективныж направлений в этой области — получение трансгенных кур-биореакторов (1-6).
Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими обусловливают явное преимущество использования первых в качестве продуктивной платформы при производстве рекомбинантных белков со сложной структурой: птицы иммуноустойчивы к потенциальным терапевтическим протеинам (например, к эритропоэтину человека), экспрессия которых может негативно влиять на состояние здоровья трансген-ныгх млекопитающих, продуцирующих подобные лекарства на коммерческом уровне. К тому же при применении трансгенной птицы в качестве продуктивной платформы значительно снижается стоимость получаемых протеинов по сравнению с таковой при микробиологической ферментации Escherichia coli, дрожжей или культивировании клеток млекопитающих (7).
Вместе с тем, традиционный метод получения трансгенныгх живот-ныгх (микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот) при трансгенезе птицы малоэффективен, что требует поиска и разработки альтернативных приемов переноса экзогенной ДНК, к числу которых относится использование генных конструкций на основе рекомбинантныгх ретровирусов. Возможность адресной доставки экзогенных генов в делящиеся клетки делает применение подобныгх векторов особенно актуальным в случае трансформации эм-бриональныгх клеток птицы, в частности кур, так как к снесению яйца эмбрион уже находится на стадии 50-60 тыс. клеток.
В этой связи целью нашей работы было изучение эффективности переноса рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур in vivo с использованием различныгх ретровирусных экспрессирующих векторов в рамках поэтапной разработки и оптимизации технологии создания трансгенной птицы.
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.412-000-2021-009. При проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Методика. Для трансформации эмбрионов кур использовали две генные конструкции — pLgfpSN и pLNCgfp, полученные соответственно на основе векторов pLXSN и pLNCX (8). Конструкции содержали следующие цис-действующие элемены ретровирусного генома: 5'- и 3'-LTR (U3-R-U5); сайт связывания т-РНК затравки (PBS, primer binding site, сайт инициации синтеза минус-цепи ДНК); у-область, а также часть гена gag (последовательности, ответственные за упаковку и димеризацию вирусных РНК); sd (splice donor, донорный сайт сплайсинга); полипуриновый тракт (PPT, polypurine tract, сайт инициации синтеза плюс-цепи ДНК). Для селективного введения в клетки пакующей линии в конструкции был интегрирован ген устойчивости к химическому аналогу неомицина G418 (neo), контроль транскрипции которого осуществлялся либо с ретровирусного LTR (pLNCgfp), либо с промотора ранних генов вируса SV40 (pLgfpSN). В генной конструкции pLgfpSN маркерный ген GFP был поставлен под контроль промотора Mo-MuLV, в конструкции pLNCgfp — под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV-IE). Для упаковки ретровирусных векторов применяли две пакующие линии — GP + envAM12 и PT67 (9, 10). Обе линии были получены на базе мышиных фибробластов NIH 3T3 и различались типом продуцируемых env-белков, ответственных за распознавание поверхностных рецепторов на клетках-мишенях.
В качестве источника генных конструкций использовали вирусный препарат с титром 9Х105 КОЕ/мл. Конструкции вводили в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов кур (2 мкл на эмбрион) при помощи капиллярной микропипетки Transferpetor («Sigma», США). Эффективность введения ретровирусных векторов изучали на 5- и 15-суточных эмбрионах. Результативность трансформации эмбрионов кур определяли по наличию и экспрессии гена GFP. Наличие гена GFP выявляли методом полимеразной цепной реакции с использованием ДНК, выделенной из эмбрионов солевым методом (11). Экспрессию GFP оценивали на криостатных срезах тканей, полученных от эмбрионов, по наличию специфической флуоресценции (микроскоп фирмы «Nikon», Япония; фильтр 480-490 нм). Крио-статные срезы готовили по общепринятой методике (12).
Результаты. Эффективность трансформации эмбрионов варьировала в зависимости от используемой генной конструкции и пакующей линии клеток. Минимальное влияние на эмбриогенез кур было установлено в вариантах с генными конструкциями, помещенными в пакующую линию рТ67: развитие эмбрионов наблюдалось в 70-73 % случаев. При введении в эмбрионы кур генных конструкций, упакованных в клеточную линию GP + envAM12, эмбриональная смертность оказалась на 3-13 % выше (табл. 1). Значительных различий по влиянию на эмбриогенез кур в зависимости от используемой генной конструкции мы не установили.
1. Эффективность введения ретровирусных векторов pLNCgfp и pLgfpSN в эмбрионы кур in vivo при использовании разных линий клеток-упаковщиц
Линия пакующих клеток
Показатель GP + envAM12 рТ67
pLNCgfp | pLgfpSN pLNCgfp | pLgfpSN
Проинъецировано эмбрионов, п 78 72 81 85
5-е сут эмбрионального развития
Исследовано яиц, шт. 30 30 30 30
Развилось эмбрионов, п (%) 20 (67) 17 (57) 21 (70) 22 (73)
В том числе трансгенных, п 14 10 10 9
Частота интеграции, % 70,0 58,9 47,7 40,9
Эффективность трансгенеза, % 46,7 33,4 33,4 30,0
15-е сут эмбрионального развития
Исследовано яиц, шт. 48 42 51 55
Развилось эмбрионов, п (%) 14 (29) 10 (24) 20 (39) 24 (44)
В том числе трансгенных, п 9 5 6 5
Частота интеграции, % 64,3 50,0 30,0 20,9
Эффективность трансгенеза, % 18,8 11,9 11,8 9,1
Примечание. Метод введения вирусного препарата, содержащего конструкцию, — в дорсальную аорту. Частоту интеграции (%) определяли как отношение числа полученных трансгенных эмбрионов к числу развившихся, эффективность трансгенеза (%) — как отношение числа полученных эмбрионов к числу инъецированных.
Высокую результативность генетической трансформации эмбрионов кур выявили при использовании генной конструкции рЬ^^Гр: доля трансформированных эмбрионов от общего числа инъецированных достигала 46,7 %. В варианте с генной конструкции pLgfpSN этот показатель был на 13,3-37,6 % ниже и варьировал от 9,1 до 33,4 %.
Использование пакующей линии ОР + еиуЛМ12 позволило повысить частоту интеграции рекомбинантной ДНК и эффективность трансгенеза на 2,8-13,3 % по сравнению с показателем в случае линии рТ67.
Оценивая эффективность переноса рекомбинантной ДНК в эмбрионы кур на 5-е и 15-е сут развития, следует отметить снижение доли трансгенных эмбрионов с увеличением срока инкубации. Так, при введении генной конструкции pLNCgfp процент трансгенных эмбрионов от общего числа проинъецированных составил на 5-е сут 46,7 %, на 15-е сут — 18,8 %. Аналогичную тенденцию отмечали и при использовании генной конструкции pLgfpSN: к 15-м сут по сравнению с 5-ми сут анализируемый показатель сократился на 20,9-21,5 % в зависимости от используемой линии клеток-упаковщиц. Снижение доли трансгенных эмбрионов с увеличением срока инкубации свидетельствует о влиянии экспрессии трансгена на эмбриогенез.
Топографический анализ паттернов интеграции показал, что наибольший процент трансформированных органов и тканей наблюдался при введении в эмбрионы кур генной конструкции pLNCgfp и пакующей линии ОР + еиуЛМ12 — 42 % (табл. 2). Экспрессия репортерного белка была выявлена преимущественно в клетках печени, сердца и в мышечной ткани. При использовании генной конструкции pLgfpSN и пакующей линии рТ67 результативность трансформации органов и тканей оказалась на 11 % ниже и равнялась 31 %.
2. Топография генетической трансформации in vivo у 15-суточных эмбрионов кур при введении ретровирусных векторов pLNCgfp и pLgfpSN с использованием разных линий клеток-упаковщиц
Линия пакующих клеток
Показатель GP + envAM12 рТ67
pLNCgfp | pLgfpSN pLNCgfp | pLgfpSN
Трансгенных эмбрионов, п Исследовано органов, п Трансформированных органов в среднем по группе, % 9 5 5 5 42 40 6 5 5 5 34 31
Экспрессию гена GFP в органах и тканях у 5- и 15-суточных эмбрионов кур иллюстрирует рисунок (см. вклейку).
Таким образом, эксперименты по переносу рекомбинантной ДНК в эмбрионы in vivo показали перспективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации эмбриональных клеток кур и получения трансгенных особей. Высокая эффективность трансгенеза (18,8 %) установлена при использовании генной конструкции pLNCgfp и пакующей линии GP + envAM12.
1. Kamihira M., Nishijima K., Iijima S. Transgenic birds for the production of recombinant proteins. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2004, 91: 171-189.
2. Kamihira M., Ono K., Esaka K. et al. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector. J. Virol., 2005, 79: 10864-10874.
3. Kiies W.A., Niemann H. The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol., 2004, 22: 286-294.
4. Rapp J.C., Harvey A.J., Speksnijder G.L. et al. Biologically active human interferon alpha-2b produced in the egg white of transgenic hens. Transgenic Res., 2003, 12: 569-575.
5. Э р н с т Л.К., В о л к о в а Н.А., З и н о в ь е в а Н.А. Некоторые аспекты использования трансгенных технологий в животноводстве. Сельскохозяйственная биология,
2009, 2: 4-9.
6. Scott B.B., Velho T.A., Sim S., Lois C. Applications of avian transgenesis. ILAR J.,
2010, 51(4): 353-361.
7. I va rie R. Avian transgenesis: progress towards the promise. Trends Biotechnol., 2003, 21: 14-19.
8. Miller A.D., Rosman G.J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques, 1989, 7: 980-990.
9. Markowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use og a safe and efficient am-photropic packaging cell line. Virology, 1988, 167: 400-406.
10. Miller A.D., Chen F. Retrovirus packaging cells based on 10A1 murine leukemia virus for production of vectors that use multiple receptors for cell entry. Virology, 1996, 70: 5564-5571.
11. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998.
12. Микроскопическая техника: руководство /Под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М., 1996.
1ГНУ Всероссийский НИИ животноводства Поступила в редакцию
Россельхозакадемии, 19 января 2013 года
142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы, e-mail: [email protected];
2ФГБОУ ВПО Уральская государственная академия ветеринарной медицины,
457100 Челябинская обл., г. Троицк, ул. Гагарина, 13, e-mail: [email protected];
3ГБОУ СПО Медицинское училище № 15 Департамента здравоохранения г. Москвы,
109263 г. Москва, ул. Шкулева, 4а, e-mail: [email protected]
INTEGRATION AND EXPRESSION OF MARKER GENES IN CHICKEN EMBRYOS WITH THE USE OF RETROVIRAL VECTOR
N.A. Volkova1, L.A. Volkova1, I.K. Fomin1, N.A. Zinovieva1,
L.Sh. Gorelik2, N.S. Lotsmanova3
S u m m a r y
The efficiency was investigated of transfer of exogenous DNA to chicken embryos in vivo with the use of retroviral vectors. The gene construction involves a marker gene GFT under control of promoter of yearly genes of human cytomegalovirus CMV IE (pLNCgfp) or promoter of Moloney leukemia virus Mo-MuLV (pLgfpSN). Two packing lines GP + envAM12 and PT67 were used for the delivery of retroviral vectors. It was established the high efficiency of embryo transformation with the use of pLNCgfp gene construction (up to 18.8 %). The expression of marker gene was demonstrated in cells of 5- and 15-day age chicken embryos.
Эффективная междисциплинарная площадка для ученых, технологов и менеджеров производств и фирм.
Контакты и информация:
http://basm2013.science-
center.net,
Научные собрания
Биологически активные вещества и материалы:
фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения 27 мая -1 июня 2013, Новый Свет, АР Крым, Украина
