CC BY
53
11 мм. Выполнены рентгенологические исследования с помощью аппарата ЯиМ-20 на рентгеновской пленке РМ-2, формата 24x32 см. Через желудочный зонд в желудок вводили водную взвесь сернокислого бария. После удаления зонда собака переводилась в положение Тренделенбурга для исследования замыка-тельной функции пищеводно-желудочного перехода. Наличие рефлюкса изучалось по регистрации заброса бариевой взвеси из желудка в пищевод. Для проведения исследований животное вводили в наркоз инъекцией кетамина в дозе 5мг/кг.
Результаты и их обсуждение. Данных за стеноз, рефлюкс-эзофагит не было выявлено ни в одном случае. У всех животных пищевод был свободен от слизи и желудочного содержимого. Слизистая оболочка пищевода была бледно-розового цвета, складки продольные, не расширены. При удалении эндоскопа из желудка сформированная складка, выполняющая роль кардиального клапана смыкалась (рис. 4).
Выполненные рентгенологические исследования продемонстрировали, что вновь сформированный пищеводно-желудочный переход обладает значительными арефлюксными свойствами (рис. 5).
Выводы:
1. Слияние пищевода с желудком происходит ниже диафрагмы под острым углом, на вершине которого в просвет желудка вдается вновь сформированная складка, выполняющая роль кардиального клапана.
2. Этот клапан в содружестве с НПС создает препятствие регургитации содержимого желудка.
Литература
1. Функциональные результаты хирургического лечения
грыж пищеводного отверстия диафрагмы / Г.К. Жерлов [и др.] // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2006.-№ 3.- С. 44-50.
2. Результаты хирургического лечения больных гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью и некоторые аспекты выбора метода фундопликации и профилактики послеоперационной дисфа-гии / К.В. Пучков [и др.] // Герниология.- 2004.- №1.- С. 20-27.
3. Выбор метода оперативного вмешательства при грыжах пищеводного отверстия диафрагмы и рефлюкс-эзофагите / К.В. Пучков [и др.]// Московский хирургический журнал.- 2008.-№3.- С.20-27.
4. Способ создания модели грыжи пищеводного отверстия диафрагмы / В.К. Татьянченко [и др.] // Пат. 2137210, Россия: МКИ 7А61 В 17/00.- Приоритет от 25.03.1997.-Опубл.10.09.1999.
5. Шмакова, Е.А. Эзофагогастральные дисфункции у больных после фундопликации / Е.А. Шмакова, В.В. Анищенко // Эксперим. клин, гастроэнтерол.- 2005.- № 5.- С. 93-97.
6. Черноусов, А.Ф. Хирургия пищевода / А.Ф. Черноусов, П.М. Богопольский, Ф.С Курбанов // Руководство для врачей.-Медицина.- 2000.- 320 с.
7. Combined multichannel intraluminal impedance-pH monitoring to select patients with persistent gastro-oesophageal reflux for laparoscopic Nissen fundoplication / I. Mainie [et al.] // Br J Surg.-2006.- 93.- P. 1483-1487.
8. Tutgat, G. Esophageal disorders / G. Tutgat // Cur. Opin. Gastroenterol.- 2000.- Vol. 16.- P. 349-350.
УДК 616-006.68:612.57-092.9
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЩЕЙ
ГИПЕРТЕРМИИ
А. В. ЕФРЕМОВ, К. В. МОЛОКОВ, Е.В.ОВСЯНКО
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Красный проспект, 52, г. Новосибирск, 630091
Аннотация: проведено изучение патоморфологических особенностей карциносаркомы Walker 256 у 75 крыс линии Wistar после воздействия общей гипертермии. Установлено, что однократная гипертермия запускает процессы апоптотической гибели в клетках опухоли, о чем свидетельствует превалирование апоптотического индекса над митотическим. К 14 суткам эксперимента наблюдается дальнейший инфильтративный рост опухоли с повышением митотического индекса в периваскулярных и межфасциальных зонах роста. К 21 суткам отмечалось снижение митотического индекса, тенденция к увеличению апоптотического индекса, что является одним из важных критериев степени выраженности повреждения опухоли.
Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, управляемая гипертермия.
PATHOMORPHOLOGICAL CHANGES of the INTERTWINED WALKER 256 CARCINOSARCOMA after GENERAL HYPERTHERMIC
EFFECT
A.V. EFREMOV, K.V. MOLOKOV, Е. V. OVSYANKO
Novosibirsk State Medical University
Abstract: the study of morphological features of Walker tumour 256 in the 75 rats Wistar after guided hyperthermic effect is carried out. It is established that the single hyperthermia starts processes of apoptosis death in tumor cells to what the prevalence of an apoptosis index over the mitotic index. To 14 days of experiment it was observed the growth of a tumor with increase of a mitotic index. To 21 days the decrease in a mitotic index, a tendency to increase of apoptosis index as one of important criteria of degree of expressiveness of damage of a tumor were noted.
Key words: tumor, Walker 256, guided hyperthermia.
Опухолевая ткань характеризуется интенсивной пролиферацией клеточных элементов, синтезом ДНК, и именно в стадии синтеза ДНК опухолевые клетки наиболее чувствительны к перегреванию. Наиболее чувствительными к гипертермии являются клетки, находящиеся в митозе, причем это наблюдается при температуре до 43,5°С. При более высоких температурах различия сглаживаются, при 47°С разница в чувствительности по фазам отсутствует [3]. Под воздействием перегрева происходит активация лизосом, инги-биция тканевого дыхания, торможение синтеза белка, снижение рН тканей, модификация митотического цикла, улучшение трансмембранного переноса, сенсибилизация опухолевых клеток к химиопрепаратам, повышение иммунного ответа организма [3,4,5]. Многочисленные измерения температуры во время гипертермии пока-
зывают, что многие опухоли селективно по сравнению с нормальными тканями накапливают тепловую энергию из-за того, что их новообразованные сосуды не реагируют физиологически на тепловой стресс и кровоток в них не регулируется и не усиливается. При температуре выше 45-50°С в опухоли отмечается распространенный тромбоз сосудов. Перевиваемые опухоли являются незаменимой моделью для экспериментальных исследований [7,8,9,10]. Получение перевиваемых опухолей заключается в трансплантации спонтанной или индуцированной опухоли подопытным животным (мышам, крысам, кроликам, собакам) с последующими многократными пассажами клеток опухоли от одного животного к другому. Примером перевиваемой опухоли может служить карциносаркома Walker, впервые описанная профессором G.Walker как спонтанно
возникшая опухоль в регионе молочной железы беременной крысы альбиноса - Rattus norvegicus, страдающей аденокарциномой молочной железы.
Цель исследования — изучение патоморфологических особенностей карциносаркомы Walker 256 после воздействия общей гипертермии.
Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали крыс - самцов линии Wistar, массой 180-200 г. Выбор данного вида животных в качестве объекта исследования определен их всеядностью и широким диапазоном существования, что обусловливает схожесть реакций различных органов и систем крыс с таковыми у человека [2]. Животных содержали в условиях вивария при температуре воздуха 20-22°С при стандартном рационе и свободном доступе к воде. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили животным в мышцу задней части бедра в дозе 1*106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl [6,7]. Общая гипертермия животных воспроизводилась в соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [1]. Предлагаемый способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных предполагает разогревание объекта исследования в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С в водной бане, при погружении в горячую воду до уровня шеи. Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя подбирался экспериментально и составил 45°С. Уровень общей гипертермии, при котором прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара).
В группу исследования включили 75 крыс с перевиваемой опухолью Walker256 - после общей гипертермии. Исследования проводили в зависимости от сроков с момента перегревания: на 1,
3, 7, 14 и 21 сут. Материал забирали под эфирным наркозом после декапитации животных. На светооптическом уровне исследовали образцы опухоли Walker 256. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе MICROM («Карл Цейс» Германия). Заливку в парафиновые блоки проводили на станции АР 280 (для заливки в блоки использовали гистопласт с t° плавления 58°). Срезы толщиной 4 мкм окрашены гематоксилином и эозином, исследованы методом световой микроскопии в проходящем свете на микроскопе Axioskop 40.
Из общегистологических методов применяли окраску гематоксилином Майера и эозином и азуром-2 - эозином, препараты заключали в канадский бальзам. Для объективной оценки изменений, происходящих с карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермии определяли: 1. Митотический индекс -число опухолевых клеток, находящихся на различных стадиях митотического деления. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Учтено не менее 2 тыс. клеток.
2. Апоптотический индекс - число опухолевых клеток, находящихся в состоянии апоптотической гибели. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Учтено не менее 2 тыс. клеток.
Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Leica DFC320 и компьютерной программы Leica.QWinV3.
Математические расчеты выполнены c помощью пакета статистического анализа Microsoft Excel. Вычисляли среднее арифметическое значение (М) и ошибку среднего (m). Оценка значимости изменений средних арифметических значений определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считались результаты при уровне значимости р<0,05.
Результаты и их обсуждение. Первые сутки после воздействия общей гипертермии - карциносаркома Walker - смешанная опухоль, образована саркоматозным и эпителиоидным компонентом. Эпителиоидные клетки локазовались в толще мышечной ткани, в виде пластов и тяжей, распространялись по межфасциальным и периваскулярным пространствам (рис. 1), полностью нарушая архитектонику и кровоснабжение мышечной ткани. Опухолевая ткань характеризовалась выраженным клеточным и ядерным по-
лиморфизмом. Клетки опухоли различной величины и формы -округлые, полигональные, крупные и мелкие, одно и многоядерные находились в активном митотическом делении (рис. 2). Митотический и апоптотический индексы на 1 сутки эксперимента практически не отличались и составили 8,3±0,5%о и 9,2±1,23%о, соответственно. Саркоматозный компонент опухоли образован плотной соединительной тканью, клетками веретенообразной и звездчатой формы с гиперхромными ядрами (рис. 3). Сосудистая сеть капиллярного типа с периваскулярными муфтами из эпителиоидных клеток с гиперхромными ядрами. Мелкие очаги апоптотической гибели и некрозов с кровоизлияниями локализовались преимущественно в толще эпителиоидной части опухоли.
На 3 сутки после гипертермии наблюдалась дальнейшая прогрессия процессов распада опухолевой ткани. Мелкоочаговые некрозы выявлялись по всей поверхности среза опухоли. По периферии некрозов и в толще эпителиоидной части опухоли регистрировались множественные очаги апоптотической гибели опухолевых клеток, инфильтрированные полиморфноядерными лейкоцитами (рис. 7), с выраженным межуточным отеком и кровоизлияниями. Митотическая активность сохранялась в зонах роста по периферии опухолевой ткани. Митотический индекс по сравнению с 1 сутками эксперимента снизился на 49,8% (4,25±0,4%о) (р<0,05), апоптотический индекс - увеличился на 441,8% (40,65±2,4%о) (р<0,001).
Рис. 1. 1 сутки после гипертермии. Инфильтративный рост опухоли по межфасциальным пространствам, межуточный отек. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200
На 7 сутки эксперимента очаги некроза и апоптотической гибели опухолевых клеток увеличивались в размерах. Некрозы имели крупноочаговый, сливной характер, с преимущественной локализацией в центральной части опухоли с ярко выраженным отеком и кровоизлияниями от диапедезных до обширных. Сосудистая сеть сохранялась в стромальной части опухоли. Митотическая активность клеток наблюдалась только по периферии опухолевого узла и в межфасциальных тяжах опухоли. В стро-мальной части опухоли появляется большое количество сидеро-фагов с пигментом коричневого цвета в цитоплазме. По сравнению с 1 сутками зарегистрировано максимальное снижение митотической активности на 72,3% (2,3±0,3%о) (р< 0,001), и максимальное увеличение апоптотического индекса - на 447,3% (41,15±1,2%о) (р<0,001).
На 14 сутки эксперимента на фоне выраженных процессов распада опухоли наблюдался дальнейший инфильтративный рост карциноматозной части опухоли в межфасциальных тяжах и пе-риваскулярно (рис. 6). По сравнению с 7 сутками в периваску-лярных муфтах и по периферии опухоли митотический индекс увеличился в 2,4 раза (5,45±0,8%о) (р<0,05) и незначительно уменьшился апоптотический индекс (33,95±1,5%о). Возможно, это связано с включением некоторых опухолевых потенций, а также тем, что поврежденные клетки еще не успевают полностью элиминировать из опухоли.
На 21 сутки в исследуемом материале представлена стро-мальная часть опухоли с развитой сосудистой сетью капиллярного типа и эпителиоидная часть, прилегающая к стромальной, в виде тонкой полоски. По всему срезу наблюдаются массивные очаги распада опухолевой ткани. Значения митотического и апоптотического индексов вернулись к показателям, зарегистрированными на 7 сутки эксперимента - 2,5±0,5%о и 39,5±1,4%о, соответственно.
Рис.2. 1 сутки после гипертермии. Карциноматозная часть опухоли, дистрофия клеток, митозы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400
Рис. 3. 1 сутки после гипертермии. Саркоматозная часть опухоли. Митозы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 1000 с иммерсией
Рис.4. 3 сутки после гипертермии. Некроз и апоптоз в клетках опухоли. Межуточный отек ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 1000 с иммерсией
Рис.5. 7 сутки после гипертермии. Очаг некроза. Инфильтративный рост опухоли в межфасциальных пространствах. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400
Рис.6. 14 сутки после гипертермии. Периваскулярная зона роста опухоли Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400
Рис.7. 21 сутки после гипертермии. Крупный очаг распада опухоли.
Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200
Выводы:
1.Однократная гипертермия запускает процессы апоптоти-ческой гибели в клетках опухоли, о чем свидетельствует превалирование апоптотического индекса над митотическим.
2.К 14 суткам эксперимента наблюдается дальнейший ин-фильтративный рост опухоли с повышением митотического индекса в периваскулярных и межфасциальных зонах роста.
3.К 21 суткам отмечалось снижение митотического индекса, тенденция к увеличению апоптотического индекса, что является одним из важных критериев степени выраженности повреждения опухоли.
Литература
1. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / А.В. Ефремов [и др.]; опубл. 2001, Бюл. № 10.
2. Западнюк, И. П. Лабораторные животные / И.П. Западнюк.- Киев: Наука, 1974.- 303 с.
3. Карев, И.Д. Гипертермические методы в онкологической
клинике: Учеб.-метод. Пособие / И. Д. Карев, Т.В. Соколова, И.А. Королева, А.Г. Монахов.- Нижний Новгород: Изд-во
НГМА, 1999.- 30 с.
4. Экспериментальные основы применения гипертермии в онкологии/ О.К. Курпешев [и др.].- Ростов н/Д, 2005.- 164 с.
5. Пути практического использования интенсивного теплолечения / А.В. Сувернев [и др.].- Новосибирск: Академическое изд-во «Гео», 2009.- 109 с.
6. Динамика опухолевого роста у крыс линии Brattleboro и Wag при введении разных доз карциносаркомы Walker 256 / И.И. Хегай [и др.] // Бюл. экспер. биол. мед.- 2008.- Т. 145.- № 1.- С. 88-90.
7. Dopaminergic and somatostatinergic pathways decrease serum thyrotropin in rats bearing the 256-Walker mammary carcinoma / O. Monte [et al.]// Arq. Bras. Endocrinol. Metabol.- 2005.- Vol. 49.-№ 2.- P. 253-264.
8. Shah, S.A. Effects of hyperthermia and hyperglycemia on the metastases formation and on survival of rat bearing W256 carcinosarcoma / S.A. Shah, R.K. Jain, P.L. Finney // Adv. Exp. Med. Biol.-1982.- Vol. 15.- Р. 23-42.
9. Implications of increased tumor blood flow and oxygenation caused by mild temperature hyperthermia in tumor treatment / C.W. Song [et al.] // Int. J. Hyperthermia.- 2005.- Vol. 21.- N8.-P. 761-767.
10. Metabolic and morphological alterations induced by proteolysis-inducing factor from Walker tumour-bearing rats in C2C12 myotubes / C.L. Yano [et al.] // BMC Cancer.- 2008.- Vol. 8.- P. 24.
