CC BY
81
2013
Известия ТИНРО
Том 175
УДК 597-12:597.554.3
Н.Н. Матвиенко1, М.С. Козий2*
1 Институт рыбного хозяйства НААН Украины,
03164, г. Киев, ул. Обуховская, 135;
2 Херсонский аграрный университет, 73006, г. Херсон, ул. Р. Люксембург, 23
патологические изменения в органах сеголеток украинского чешуйчатого карпа (CYPR1NUS CARPIO), экспериментально инфицированных вирусом весенней вИРЕМИИ карпа (SVC)
Представлена информация о патологических изменениях в органах и тканях украинского чешуйчатого карпа под влиянием вируса весенней виремии. Экспериментально показано, что при развитии вирусной инфекции в организме карпа происходят функциональные и морфологические изменения регуляции кровообращения, в свою очередь провоцирующие нарушение механизмов обменных процессов.
Ключевые слова: вирус, патология, карп, гистология, органы, ткани.
Matvienko N.N., Koziy M.S. Pathological changes in organs of yearlings of the carp Cyprinus carpio experimentally infected with the virus of spring viraemia of carp (SVC) //
Izv. TINRO. — 2013. — Vol. 175. — P. 270-276.
Pathological changes in organs and tissues of the carp Cyprinus carpio under effect of spring viraemia virus are reported. Functional and morphological changes in regulation of its blood circulation under this viral infection are experimentally shown; these changes provoke abnormality of metabolic processes.
Key words: virus, pathology, carp, histology, organ, tissue.
введение
Весенняя виремия карпа (ВВК, SVC) — остропротекающая высококонтагиозная вирусная болезнь рыб, характеризующаяся развитием септического процесса и массовой гибелью рыб (Wolf, 1988; Shchelkunov, Shchelkunova, 1989; Fijan, 1999). По классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) SVC относится к категории особо опасных («декларируемых») болезней рыб**. SVC в настоящее время классифицируется как представитель рода Vesiculovirus семейства Rhabdoviridae (Ahne et al., 2002). К сожалению, до сих пор нет клинических и патологических признаков, характерных только для данного заболевания. Признаки поражения органов могут отсутствовать даже при молниеносной форме заболевания. В литературе описаны только некоторые макроскопические патологии в организме карпа (Головина, Бауер, 2007).
* Матвиенко Наталия Николаевна, кандидат биологических наук, заведующая отделом, е-mail: [email protected]; Козий Михаил Степанович, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, е-mail: [email protected].
Matvienko Nataliya N., Ph.D., head of department, е-mail: [email protected]; Koziy Mihail S., Ph.D., associate professor, e-mail: [email protected] е-mail.
** Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. 3th Edition. — Paris : Word Organization for Animal Heatch (Chapter 2.3.8): OIE, 2009.
Понимание и изучение патологических изменений, вызванных высоковирулентными вирусами рыб в органах и тканях, является важным инструментом для быстрой и ранней диагностики вирусных болезней рыб.
Цель наших исследований — изучение изменений в тонких тканевых структурах и возникающие внутриклеточные перестройки в организме карпа, экспериментально инфицированного вирусом весенней виремии.
Материалы и методы
Для воспроизведения экспериментальной инфекции проводили биопробу. В эксперименте использовали сеголеток украинского чешуйчатого карпа (Cyprinus carpio L.), выращенных на экспериментальной базе ИРХ НААН. Рыба тестирована на наличие инфекционных заболеваний. Опыты по искусственному заражению рыб проводились в лабораторных условиях ИРХ НААН в ваннах объемом 40 дм3. Температура воды — 18 оС. Для биопробы сформировали две группы сеголеток карпа — опытную и контрольную — по 10 экз. в каждой (масса рыбы 30 г). После первичной адаптации рыбы проводили ее заражение вирусом весенней виремии (штамм IMB ВВК-IV) методом внутрибрюшинной инъекции. В качестве источника вируса использовали вируссодержащую жидкость зараженной вирусом SVC культуры клеток EPC (epidermal neoplasm of carp — эпидермальная папилома карпа), которая имела признаки ярко выраженного цитопатогенного действия (поражение 75-100 % монослоя, титр вируса не ниже 108 ТЦД50/мл). Доза введения — 0,5 мл. Контрольным рыбам вводили такое же количество культуральной жидкости, не зараженной вирусом культуры клеток. После заражения проводили ежедневное наблюдение за рыбой. Каждый день регистрировали отклонения в поведении рыбы, при развитии заболевания — клинические, патолого-анатомические изменения и суточную смертность рыб. Материал для гистологических исследований отбирали от рыбы с ярко выраженными клиническими проявлениями на 12-й день после заражения. Материал для гистологического анализа отбирали в медиальной части печени и селезенки.
Камеральную обработку гистологических проб осуществляли в условиях лаборатории ихтиопатологии ИРХ НААН согласно рекомендациям и при помощи специально разработанного оборудования (Лесников, Чимарева, 1987; Козий, 2009).
Светооптические исследования клеток и тканей проводили в проходящем свете на оборудовании «Biolar-RU PZO» (Польша) с помощью галогенного осветителя «Linvatec-2» (США) номинальной мощностью 100-240 Вт.
Контрастирование микропрепаратов выполняли с помощью мультиформно-го фильтра «ФГПМ-2,5Х», а также корректирующего фильтра «Monochrom 2,5х» (Россия).
Общие морфометрические исследования тканевых структур выполнены при помощи встроенного окуляра-микрометра. Коэффициент сжатия ткани при гистологической обработке составлял для селезенки 15 %, а для печени и почек — 14 %. Количество подсчитанных клеточных структур для каждой ткани у каждой рыбы составляло 100 кл. с каждого органа.
Микрофотографирование гистологических срезов выполняли цифровой камерой «Nikon D-60» (Австрия) с применением тринокулярной насадки 1,6х (Россия) и компьютерного определителя экспозиции съемки «Minolta-EK» (Япония).
Корректирующая обработка полученных микроснимков была проведена с помощью компьютерных программ «Adobe Photochop CS2», «Microsoft Office Picture Manager», «FS Viewer».
Биометрические исследования тканей выполнены согласно общепринятым методикам (Автандилов, 1980).
Полученный материал обрабатывали методом вариационной статистики с акцентом на ошибки средних величин, а также при помощи пакета прикладных программ «Microsoft Excel».
Результаты и их обсуждение
Исследованиями, проведенными в лаборатории ихтиопатологии Института рыбного хозяйства НААН, установлено, что при экспериментальном заражении сеголеток чешуйчатого карпа (Cyprinus carpio) вирусом весенней виремии карпа происходят функциональные и морфологические изменения регуляции кровообращения, в свою очередь провоцирующие нарушение механизмов обменных процессов. Наблюдения показывают, что патоморфологические изменения в органах-мишенях могут проявляться как в форме незначительных отклонений, так и в виде существенных нарушений, искажающих гистологическую картину.
Установлено, что в результате непродолжительного действия вируса в паренхиме печени исследованных особей наблюдаются умеренное полнокровие и застойные явления в сосудах (рис. 1).
Рис. 1. Застой крови в сосудах печени чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом SVC. Гематоксилин Бёмера, эозин «Y». Х10. Ок. 20*об. 10: a — гепатоциты; b — сосуды
Fig. 1. Blood congestion in hepatic vessels of the carp after experimental infection with SVC virus. Bemers hematoxylin, eosin Y. Х10 20*vol. 10: a — hepatocytes; b — vessels
Как видно на рис. 1, переполняются кровью преимущественно сосуды микроцир-куляторного русла, реже — вены среднего размера. Клетки печени в гиперемированном участке сравнительно с нормальными несколько уменьшены в объёме. Трансформации в химическом составе, физико-химических свойствах гепатоцитов связаны с нарушением клеточного метаболизма. Наблюдаемое уменьшение количества гликогеновых включений в гепатоцитах маргинальной зоны свидетельствует об определённых отклонениях в углеводном обмене и однозначно демонстрирует смещение клеточной функции в направлении липостаза. В дальнейшем дистрофические явления могут проявляться в форме избыточного накопления жира в поражённых вирусом клетках, что свидетельствует о повреждении целостности белково-липоидных комплексов цитоплазмы. При тотальной жировой дистрофии в отдельных гепатоцитах отмечается пикноз, что указывает на первые признаки некробиотического состояния. В состояниях, граничащих с наиболее тяжёлыми вариантами поражения органа, могут наблюдаться локальные разрастания волокнистой соединительной ткани, при этом паренхима имеет плотную консистенцию. Указанное явление сопровождается субмилиарным некрозом гепатоцитов, что сочетается с излиянием серозного эксудата (рис. 2).
Рис. 2. Некробиоз паренхимы печени чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом весенней виремии карпа. Реактив Цинзерлинга в модификации. Ок. 10*об. 10: а — гепатоциты; b — зерна гемосидерина
Fig. 2. Necrobiosis of hepatic parenchyma of the carp after experimental infection with SVC virus. Zinserling reagent modified, 10*vol. 10: а — hepatocytes; b — hemosiderin granules
У рыб, подверженных воздействию вируса, морфофункциональные изменения наблюдаются также в гепатопанкреасе. Чаще всего они выражаются в виде местного диапедеза и декапсуляции панкреатических структур. В наиболее динамичных случаях протекания заболевания в экзокринной части гепатопанкреаса наблюдается картина волны митотических делений (рис. 3).
Рис. 3. Гиперплазия экзокринного компонента гепатопанкреаса чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом SVC. Гематоксилин Бёмера, фукселин Харта в модификации. Ок. 20хоб. 8 .а — экзокриноциты; b — цитоплазма
Fig. 3. Hyperplasia of exocrine component in the carp hepatopancreas after experimental infection with SVC virus. Bemer hematoxylin, Hart fuxelin modified, 20*vol. 8: а — exocrinocytes; b — cytoplasm
При этом экзокриноциты теряют характерную веретеновидную форму и «пенистость» цитоплазмы. Отмечено, что клеточная пролиферация может наблюдаться также в панкреатических включениях пульпы селезёнки, гораздо реже — в очагах, локализованных в жировой ткани складок среднего отдела кишечника.
При определении степени влияния вируса на организм рыб гистологический тест органов мочевыделения является важным звеном в биомониторинге состояния здоровья. Установлено, что в условиях экспериментального инфицирования морфология проксимальных извитых канальцев конволюты мезонефроса чешуйчатого карпа может быть представлена двумя вариантами: низким эпителием (3,7-4,8 мк) в сочетании с широким и округлым просветом канальца или высоким эпителием (9,1-12,2 мк) при узком просвете.
Колебание состояний определённо указывает на сдвиг в функциональной активности эпителиоцитов, что дополнительно подтверждается растяжением просвета канальца клубочковым фильтратом. Исследования мезонефроса инфицированных рыб, проведенные на светооптическом уровне, показали, что площадь почечных телец была увеличена в среднем на 25 %, объём мочевого пространства в ряде случаев был незначительным или отсутствовал. Эпителий проксимального отдела нефрона отёчный, цитоплазма клеток мутная. Именно в этом отделе было зафиксировано отслоение эпителиоцитов от базальной мембраны.
Дистрофические изменения нефрона сопровождаются разнообразными сосудистыми расстройствами, преимущественно в виде резкого расширения приносящих артериол.
Практически повсеместно наблюдается увеличение доли лимфоретикуломиелоид-ной ткани, что нетипично для мезонефроса представителей пресноводной ихтиофауны. В данном случае дегенеративные признаки усматриваются в положительном сдвиге численности клеток с эозинофильной зернистостью в цитоплазме, а также клеток лимфоидного ряда. Трансформации почечных телец характеризуются патологически резким растяжением капиллярных петель и возникновением спаек между сосудами (рис. 4).
Рис. 4. Изменение почечного тельца мезонефроса чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом SVC. Реактив Цинзерлинга в модификации. Ок. 20хоб. 20: а — стенки капсулы Боумена-Шумлянского; b — зерна гемосидерина
Fig. 4. Change of mesonephros renal body of the carp after experimental infection with SVC virus. Zinserling reagent modified, 20/yol. 20: a — walls of Bowman-Shumlansky capsule; b — hemosiderin granules
Обнаруживаются разрушение стенок капсулы Боумена-Шумлянского, многочисленные кровоизлияния в межканальцевую ткань, что сопровождается отложением зёрен гемосидерина.
Таким образом, основой реакции почек инфицированных рыб являются структурная гетерохронность нефронов и возможность перестроек клеток почечных телец и канальцев. Пнкнотическне ядра, зернистая структура цитоплазмы эпителиоцитов, поступательное увеличение числа и размера вакуолей в клетках свидетельствуют о наличии патологии. Установлено, что в результате действия вируса в мезонефросе рыб развивается белковая дистрофия эпителия. Патология фиксируется преимущественно в проксимальных извитых канальцах (рис. 5).
Рис. 5. Белковая дистрофия (зернистый тип) мезонефроса чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом SVC. Реактив Цинзерлинга в модификации. Ок. 20*об. 10: а — белковые зерна; b — цитоплазма
Fig. 5. Protein dystrophy (granular type) of the carp mesonephros after experimental infection with SVC virus. Zinserling reagent modified, 20*vol. 10: а — protein granules; b — cytoplasm
Морфологические изменения, характеризующие данную патологию, заключаются в появлении в цитоплазме большого количества мелких белковых зерен. Тело эпителиоцита при этом несколько увеличивается в объёме, цитоплазма становится мутной. Ядро в дальнейшем подвергается лизису и скрывается, в результате чего клетка гибнет.
Значительно реже наблюдается жировая дистрофия, в отдельных случаях сопровождаемая некрозом прикапсулярного пространства.
В то же время в почках инфицированных рыб интенсивно происходит регенерация эпителия канальцев и клубочкового аппарата. Обратимые изменения фиксируются в виде увеличения размеров сохранившихся телец, что, по-видимому, обеспечивает компенсацию утраченных функций органа.
В отношении реакции селезенки чешуйчатого карпа на поражение вирусом становится очевидным, что изменение кровенаполнения органа и отёчность клеток являются общим проявлением интоксикации (рис. 6).
Вблизи меланомакрофагиальных центров органа фиксируются умеренное накопление бурого пигмента (гемосидерина), а также очаговая делимфатизация пульпы.
Отметим, что характерная для инфекций бактериального происхождения картина скопления клеток с эозинофильной зернистостью, лимфоидных клеток с нетипичной окраской, в особенности появления «голых», лишённых ободка цитоплазмы ядер лимфоцитов, не наблюдается при поражении карпа вирусом весенней виремии.
Быводы
Гистологическими исследованиями установлены патологические изменения в органах и тканях украинского чешуйчатого карпа под влиянием вируса весенней виремии.
Рис. 6. Последствия нарушения гемодинамики селезёнки чешуйчатого карпа. Экспериментальное инфицирование вирусом SVC. Гематоксилин Бёмера, фукселин Харта в модификации. Ок. 20*об. 20: а — зерна гемосидерина; b — меланомакрофагиальные центры
Fig. 6. Consequences of spleen hemodynamics abnormality for the carp after experimental infection with SVC virus. Bemer hematoxylin, Hart fuxelin modified, 20*vol. 20: а — hemosiderin granules; b — melanomacrophages centers
Экспериментально показано, что при развитии вирусной инфекции в организме карпа происходят функциональные и морфологические изменения регуляции кровообращения, в свою очередь провоцирующие нарушение механизмов обменных процессов.
Изменения в тканях и клетках печени однозначно свидетельствуют о негативном воздействии вирусной инфекции. При этом дистрофические явления проявляются в форме избыточного накопления жира в поражённых вирусом клетках, что свидетельствует о повреждении целостности белково-липоидных комплексов цитоплазмы.
Установлены морфофункциональные изменения в гепатопанкреасе, которые выражались в виде местного диапедеза и декапсуляции панкреатических структур.
В почках инфицированных рыб фиксировали патологию, которая проявлялась в структурной гетерохронности нефронов и перестройке клеток почечных телец и канальцев. В мезонефросе рыб развивалась белковая дистрофия эпителия.
В селезенке чешуйчатого карпа, инфицированного вирусом SVC, выявляли изменение кровенаполнения органа и отёчность клеток.
Список литературы
Автандилов Г.Г. Введение в количественную и гистологическую морфометрию : монография. — М. : Медицина, 1980. — 227 с.
Головина Н.А., Бауер О.Н. Ихтиопатология : монография. — М. : Мир, 2007. — 448 с.
Козий М.С. Оценка современного состояния гистологической техники и пути усовершенствования изучения ихтиофауны : монография. — Херсон : Олди-плюс, 2009. — 310 с.
Лесников в.А., Чимарева Т.в. Патолого-гистологический анализ состояния рыб при полевых и экспериментальных токсикологических исследованиях // Методы ихтиол. исслед.
— М. : Наука, 1987. — С. 80-81.
Ahne W., Bjorklund H.V., Essbauer S. et al. Spring viremia of carp (SVC) // Diseases of Aquatic Organisms. — 2002. — Vol. 52, № 3. — P. 261-272.
Fijan N. Spring viremia of carp and other diseases and agents of warm-water fish // Fish diseases and disorders / P.T.K. Woo, D.W. Bruno (eds.). — Oxon UK : CAB International, 1999. — Vol. 3. — Р. 177-244.
Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I. Rhabdovirus carpio in herbivorous fishes: isolation, pathology and comparative susceptibility of fishes // Viruses of Lower Vertebrates / W. Ahne, E. Kurstak (eds.). — Berlin, Heidelberg : Springer-Verlag, 1989. - P. 333-348.
Wolf K. Fish viruses and fish Viral diseases. — Cornell Univ. Press, Ithaca, N.Y., USA, 1988.
— 476 p.
Поступила в редакцию 1.10.13 г.
