CC BY
41
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2009. - Вип. 17, т. 1. - С. 70-79. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2009. - Vol. 17, N 1. - P. 70-79.
УДК 574[64+24]:597.551.2
А. А. Жиденко
Черниговский государственный педагогический университет им. Т. Г. Шевченко
РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ФОРМИРОВАНИИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ К ГЕРБИЦИДАМ В ОРГАНИЗМЕ КАРПА (CYPRINUS CARPIO)
Показано вплив зенкору та раундапу на зміну концентрації катіонів кальцію в органах Cyprinus carpio L., а також можливість корекції обміну речовин і формування адаптації в цих умовах за допомогою Са2+. Зміни вмісту Са2+ в органах коропа залежать від структурних ушкоджень органів, на ступінь важкості яких впливає природа гербіциду (складність хімічного складу та розчинність у воді). Корекція обміну речовин у дволіток коропа в умовах гербіцидного навантаження можлива за рахунок катіонів кальцію, які необхідно додавати у воду при контролі її pH.
A. A. Zhidenko
T. G. Shevchenko Chernigiv State Pedagogical University
ROLE OF CALCIUM CATIONS IN THE FORMATION OF ADAPTIVE REACTIONS TO HERBICIDES OF THE CARP (CYPRINUS CARPIO)
The influence of zenkore and round-up on changes of the calcium cations concentration in the Cypri-nus carpio L., and the possibility of metabolism correction and adaptation under such condition due to Са2+ are presented. Changes of the Са2+ content in the carps’ organs depend on the structural damages of the organs. The herbicides’ characteristics (chemical structury and water solubility) influence on the intensity of damage. Са2+ can correct the metabolism of carps of two years age under the herbicides load. So, the Са2+ should be added into the water with simultaneous pH control.
Введение
В результате применения пестицидов возможны следующие пути их накопления: аккумуляция в живых организмах, почве, перенесение воздушным потоком и попадание в открытые водоемы [3]. Создается опасность для существования гидробион-тов. Достаточно быстро на действие токсических веществ реагируют электролиты крови водных организмов, в частности ионы кальция и фосфора. Известно их участие во многих биохимических и физиологических процессах: кальций участвует в регуляции проницаемости клеточных мембран, электрогенезе нервной, мышечной и железистой тканей, процессах синаптической передачи, молекулярном механизме мышечного сокращения, развитии секреторного и инкреторного процессов пищеварительных и эндокринных желез, энергетическом обмене [12]. Кроме того, кальций является внутриклеточным посредником (вторичным мессенджером) ряда клеточных реакций: оказывает влияние на структурное состояние белков мембранного каркаса и на асимметричное распределение липидов в эритроцитарных мембранах [8]. При гипоксии, как было показано [9], происходит массивный вход Са2+ в цитоплазму за счет активации плазма-лемных кальциевых каналов. Высокая концентрация Са2+ оказывает на клетку цитото-ксическое действие, при меньших концентрациях возможен защитный эффект: вклю-
© А. А. Жиденко, 2009 70
чение разных антиоксидантных комплексов и стимуляция продукции АТР [9]. Исходя из этого, для рыбы катионы кальция могут быть или протектором при токсических воздействиях, или, наоборот, усугублять действие антропогенных факторов в зависимости от своей концентрации и условий окружающей среды.
Цель нашей работы - оценить изменение содержания катионов кальция в органах двулеток карпа под действием зенкора и раундапа, а также выявить роль Са2+ в формировании адаптации.
Материал и методы исследований
Исследование влияния гербицидов проведены на двулетках (150-300 г) карпа (Cyprinus carpio Ь), выращенных в ОАО «Черниговрыбхоз». Опыты по изучению влияния гербицидов проводили в 200-литровых аквариумах, в которые рыбу размещали из расчета один экземпляр на 40 л воды. Длительность эксперимента - 14 суток. Замену воды проводили каждые 2-3 дня. Во всех случаях осуществляли контроль и поддерживали постоянный гидрохимический режим воды. Концентрацию исследуемых гербицидов, которая отвечала 2 ПДК, создавали путем внесения рассчитанных количеств 70 % порошка зенкора (0,2 мг/дм3) и 36 % водного раствора раундапа (0,04 мг/дм3). Кровь у рыб отбирали путем пункции сердца [5] на 7-е и 14-е сутки эксперимента. В сыворотке крови определяли содержание катионов кальция методом де Ваарда [13]. Для изучения структурных изменений в тканях карпа под влиянием гербицидов использовали метод гистологического исследования [6], для чего на 4-е, 7-е и 14-е сутки проводили патологоанатомический разрез рыбы и брали биопробы из органов - жабр и кишечника. Структурные изменения на гистопрепаратах фотографировали Web-камерой. Достоверное различие между средними арифметическими величинами определяли с помощью ^-критерия Стьюден-та. Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Нами ранее показано [7], что поведенческие реакции сеголеток и двулеток карпа соответствуют изменению содержания фосфора в сыворотке крови. Кроме того, под действием гербицидов происходит разрушение структуры органов двулеток карпа и изменение содержания общих белков и их фракций в этих органах. Для проверки гипотезы о возможности коррекции обмена веществ у двулеток карпа, находившихся в условиях гербицидной нагрузки, за счет увеличения содержания кальция в воде и тем самым изменения концентрации катионов кальция в крови и органах были проведены исследования по определению содержания этого электролита. На рисунке 1 показаны изменения содержания катионов кальция в сыворотке крови контрольных рыб и рыб, находящихся в условиях гербицидной нагрузки.
На 7-е сутки эксперимента концентрация Са2+ в сыворотке крови двулеток карпа под действием зенкора уменьшилась на 7,3 %, под действием раундапа увеличилась на 82,0 % по сравнению с контролем. Известно, что у пресноводных рыб вода и многие неорганические ионы, в том числе Са2+, абсорбируясь аппаратом жабр, сразу поступают в общий кровоток, в то время как у морских рыб и наземных позвоночных в артериальной крови они появляются только после прохождения через печень. Исследуя утилизацию кальция из воды годовиками карпа, Н. П. Богоявленская установила [1], что 68-88 % меченого кальция проникает в организм через жабры и 12-32 % - через кожу. У рыб, имеющих чешуйчатый покров, через кожу утилизируется 12 %, а через жабры - 88 %.
Уже на 4-е сутки пребывания рыбы под воздействием зенкора (рис. 2) отмечаются изменения формы респираторных ламелл жабр (выраженное колбообразное набуха-
ние, расширение дистальных участков жаберных филаментов и значительное увеличение объема клеток). Это способствует увеличению дистанции «кровь - среда» и уменьшению поступления токсического вещества, ослабляя прямое воздействие токсиканта. Поэтому и поступление катионов кальция из воды в организм рыб также снижается. Водопроводная вода в г. Чернигов относится к жесткой, в ней содержится 12 мг экв./л или 240 мг % солей кальция и магния (установлено санэпидстанцией и подтверждено нашими исследованиями). Под действием раундапа структурные изменения в жабрах проявляются лишь на 14-е сутки опыта (см. рис. 2), и они не столь значительны. Возможным объяснением является структура и свойства гербицида: зенкор - это метрибу-зин (4-амино-6-третбутил-3(метилтио)-1,2,4-триазин-5(4Н)-он), плохо растворимый в воде и хорошо - в метаноле, этаноле, ацетоне. Поэтому проникновение его в ткань жабр затруднено. Раундап - глифосат, фосулен (К-фосфонометилглицин) - наоборот, хорошо растворим в воде и плохо - в большинстве органических растворителей. Таким образом, поступление катионов кальция в организм рыб из воды возможно и содержание катионов кальция в крови карпа в условиях воздействия раундапа в 2 раза больше, чем под действием зенкора.
16 -14 -12 -10 -8 -6 4 2 0
контроль
зенкор
раундап
□ 7 суток □ 14 суток
Рис. 1. Содержание Са2+ (М ± т, п = 5) в сыворот ке крови двулеток карпа в условиях гербицидной нагрузки (2 ПДК)
Кроме того, имеет место второй путь увеличения содержания С^+ в крови карпа. Нами установлено [7], что одним из признаков воздействия раундапа на органы двулеток карпа является увеличение мягкости и гибкости костей рыб, просветление черепа. Известно, что содержание кальция в костях карпа существенно не отличается от его содержания в костях млекопитающих [14], поэтому резорбция костей черепа рыб приводит к тем же последствиям, что и у млекопитающих (увеличению содержания катионов кальция в крови). Благодаря интенсивному ионному обмену костная ткань является не только депо минеральных веществ, но и своеобразным буферным органом, участвующем в регуляции солевого гомеостаза кальция.
На 14-е сутки эксперимента (см. рис. 1) количество ионов кальция в сыворотке крови уменьшается под действием зенкора на 80,7 %, а под действием раундапа - на
51,5 % по сравнению с контролем. Объяснением может быть прогрессирующая гипертрофия дистальных участков филаментов, межклеточный отек, с выраженной деструкцией в респираторных ламеллах (зенкор, рис. 3) и нахождение в просвете кишечника камней карбоната кальция белого цвета (раундап, рис. 6). Кроме того, адсорбция кати-
*
онов из воды и их экскреция осуществляется у рыб специальными клетками, расположенными в жабрах. Доказано, что ионы кальция также могут не только абсорбироваться жабрами из воды, но и выделяться их железистыми клетками [19]. Нами был определен уровень ионов кальция в воде, где находились рыбы на 14-е сутки по окончании эксперимента. Необходимо учитывать, что вода в аквариумах постоянно обновлялась, и поэтому фактически в этой воде рыбы находились трое суток, то есть пополнение организма карпа С^+ возможно через водопроводную воду.
Рис. 2. Гистологические изменения в жабрах карпа под влиянием зенкора: а - контроль, б - 4-е сутки (х 40, гематоксилин-эозин)
Наименьшее количество ионов кальция (40 мг/л) было в воде, где содержались контрольные рыбы, жабры которых нормально функционировали и не имели морфологических повреждений (рис. 4). В опытах на золотой рыбке показано, что даже с увеличением количества усвоенного из пищи кальция заметно не уменьшается его поступление в результате прямой абсорбции из водной среды [15]. Поступающие из воды ионы кальция у водных животных уже в течение часа распределяются по всем органам и тканям. Наибольшее количество кальция обнаруживается в чешуе, костях жаберных крышек, осевом скелете рыб. Сравнительно меньшее его количество депонируется в мягких тканях. Значительное содержание кальция наблюдается в жаберных лепестках, то есть структурах, участвующих в его утилизации из воды [12]. Нами определено со-
73
держание Са2+ в печени и мышцах двулеток карпа. В печени двулеток карпа под действием раундапа (2 ПДК) после 14 суток эксперимента уровень ионов кальция возрастает на 8 %, а в мышцах - снижается на 78,5 %.
Рис. 3. Гистологические изменения в жабрах карпа под влиянием зенкора (а) и раундапа (б) на 14-е сутки (х 40, гематоксилин-эозин)
контроль зенкор раундап
Рис. 4. Содержание С^+ в воде, где находилась рыба в условиях гербицидной нагрузки (М ± т, п = 5)
в
О
е
s
ІЗ
й
а
о
l4
l2
lO
6
4
2
□ контроль Праундап
печень мышцы
Рис. 5. Содержание Са2+ (М ± т, n = 5) в органах двулеток карпа под действием раундапа (2 ПДК)
Как показано нами [7], в гистопрепаратах скелетных мышц двулеток карпа, находившихся под воздействием раундапа, отмечается изменение структуры мышечных волокон, отсутствие поперечной полосатости, которая определяется белками Z-диска в некоторых их участках. Известно, что кальпаины гидролизуют белки миофибрилл или цитоскелета [2]. Кальпаины являются Са2+-зависимыми цистеиновыми протеазами с рН оптимумом 7,2-8,2. Кальпаины и их ингибитор - кальпастатин локализуются исключительно внутри клеток и преимущественно связаны с субклеточными органеллами, такими как миофибриллы скелетных мышц, везикулы аппарата Гольджи и эндоплаз-матического ретикулума, плазматической мембраны. В общем, деградация внутриклеточных белков может идти по двум путям: лизосомальному и нелизосомальному.
Лизосомальный протеолиз в большей степени неселективен и отвечает в клетке за деградацию белкового материала трех категорий [10]. К нему относятся: а) экзогенные белки, поступающие в клетку из окружающей среды; б) эндогенные белки, являющиеся частью самой клетки; в) белковые гранулы, синтезируемые клеткой, но предназначенные для экскреции.
Нелизосомальные протеолитические системы включают: 1) АТР- и убиквитин-зависимую протеолитическую систему, основным действующим элементом которой является мультисубъединичный белковый комплекс; 2) кальпаиновую систему или Са2+
-зависимые протеазы и их эндогенный ингибитор кальпастатин [20]; 3) АТР-независимые протеазы.
В эксперименте in vitro была протестирована способность различных двух- и трехвалентных катионов активировать кальпаины рыб: морского окуня и карпа. Показано, что
Са2+
является наиболее эффективным активатором (его эффективность принята за 100 %) [18]. В [7] нами показано уменьшение содержания общих белков и особенно нерастворимых, но увеличение водорастворимых по сравнению с контролем. Увеличение содержания эндогенного кальция приводит к активации кальпаинов, что, в свою очередь, способствует размягчению мышц и изменению качества рыбных продуктов [16]. При увеличении содержания внутриклеточного Са2+ в пораженных мышцах происходит активация кальпаинов. Они инициируют деградацию миофибрилл, разрушают белки миофибрилл на фрагменты, которые поглощаются лизосомами и в них подвергаются дальнейшему расщеплению с участием катепсинов [11]. Снижение содержания катионов кальция в белых мышцах двулеток карпа на 14-е сутки нашего эксперимента объясняется активным вымыванием его из мышц в кровь, а затем отложением в виде камней карбоната кальция в кишечнике (рис. 66).
8
O
Рис. 6. Гистологический срез кишечника карпа (а - контроль), желчные конкременты и образования карбоната кальция в просвете кишечника карпа под влиянием раундапа (б) на 14-е сутки (х 40, гематоксилин-эозин)
Печень у рыб играет исключительно важную роль в регуляции кальциевого обмена [12], возможно, поэтому содержание Са2+ в этом органе по сравнению с мышечной тканью под действием раундапа находится практически на одном уровне с контролем, хотя, как показано [7], в результате распространения процесса вакуольнокапельной дистрофии отмечается некроз гепатоцитов.
Поражение печени токсикантами различной природы сопровождается образованием очагов некроза, при этом из поврежденных гепатоцитов кальпаин «вытекает» и гидролизует белки плазматической мембраны соседних клеток, что приводит к прогрессии повреждения [17]. Подтверждением вышесказанного является уменьшение содержания общего белка в печени опытных рыб [7].
При увеличении гербицидной нагрузки до 4 ПДК тенденция изменений содержания катионов кальция та же, но количественные показатели выше на 33 % под действием зенкора и на 20 % - под действием раундапа (рис. 7).
Эксперимент по определению влияния раундапа для 2 ПДК на двулеток карпа проходил в октябре, а для 4 ПДК - в декабре. Возможно, поэтому так отличается содержание катионов кальция в печени контрольных рыб (рис. 8).
2,5
2,0
О4
<3
и
я
я
8 7
Й 6
£ " 5 2 4
ей 3 * 3 Л
О о
ч 2 о
° 1 0
о4
а
(и
о
О
1,5
1,0
о
О
0,5
0,0
20
15
контроль зенкор раундап
Рис. 7. Содержание Са2+ (М ± m, п = 5) в печени двулеток карпа в условиях гербицидной нагрузки (4 ПДК)
- т □ контроль □ раундап
- т Т"
-
2 ПДК
4 ПДК
25
10
5
Рис. 8. Содержание Са (М ± m, п = 5) в печени двулеток карпа в условиях гербицидной (2 ПДК, 4 ПДК) нагрузки
□ контроль □ зенкор □ раундап
2 ПДК
4 ПДК
Рис. 9. Содержание Са (М ± m, п = 5) в сыворот ке крови двулеток карпа в условиях гербицидной нагрузки (2 ПДК, 4 ПДК)
Известно, что количество Са+ в организме водных животных зависит от условий среды обитания. Сезонное увеличение (в нашем случае осенний период) содержания Са2+ в мышцах и гепатопанкреасе совпадает по времени с увеличением скоро-
*
0
сти роста и интенсивности питания рыб, так как температура воды в этот год была экстремально высокой +16...+18 °С. В сыворотке крови опытных рыб эта тенденция не соблюдается. При увеличении дозы токсического вещества в воде до 4 ПДК в сыворотке крови двулеток карпа изменяется содержание катионов кальция в сторону увеличения. На 14-е сутки эксперимента концентрация С^+ в 3,2 раза больше в сыворотке крови при действии 4 ПДК раундапа по сравнению с 2 ПДК. Повышение содержания Са2+ в сыворотке крови двулеток карпа (20,2 мг %) на 14-е сутки эксперимента (4 ПДК) свидетельствует о незаконченности формирования долговременной адаптации. Таким образом, можно предположить, чем больше доза токсического вещества, тем дольше процесс адаптации.
Одним из важнейших условий, существенно влияющих на всасывание солей кальция, является их растворимость в воде и возможность быстрого перехода в ионизированную форму, облегчающую его транспорт через клеточную мембрану. Хлористый кальций, обладающий меньшей растворимостью, больше времени задерживается в организме, чем глюконат кальция. В водопроводной воде кальций и магний содержатся в виде бикарбонатов, кислых солей, хорошо растворимых в воде (карбонатная или временная жесткость). Кроме того, существует постоянная или некарбонатная жесткость, обусловленная присутствием хлоридов (растворимость в воде - 74,5 г) и сульфатов (0,176 г) кальция и магния в водопроводной воде [4].
Существование метаболической связи между интенсивностью дыхания и уровнем кальция в клеточных структурах предопределяет его влияние на биоэнергетические процессы в организме рыб. Известно его влияние [12] на аденозинтрифосфорную активность микросом мозга, ядер скелетных мышц, поэтому постоянное поступление этого катиона из окружающей водной среды в организм рыб способствует формированию долговременного этапа адаптации. При попадании гербицидов во внутренние водоемы необходимо немедленно проводить известкование прудов. При этом нужно учитывать величину почвенной кислотности дна пруда, которая определяется в хлор-калиевой вытяжке и обозначается символом рНс. Если рН грунта в солевой вытяжке ниже 6,0, то можно использовать негашеную известь (СаО), гашеную известь -Са(ОН)2, известняк - СаСО3, учитывая, что наибольшей скоростью действия обладает негашеная известь. Она нейтрализует также почвенную кислотность, из расчета 20 ц/га (при рН 4,0), гашеная известь имеет в 1,3, а известняк - в 1,8 раза меньшую нейтрализующую способность. Поэтому при рН 6,0 можно использовать 3 ц/га СаО, но лучше пользоваться пушонкой - тонкодисперсным порошком Са(ОН)2 - 3,5 ц/га. Если же рН выше 6,0, то лучше использовать известняк. В летнее время рекомендуется вносить известь по воде из расчета 2-3 ц/га. Катионы кальция, попадая из воды в организм рыб, создадут определенную концентрацию их в крови и органах.
Таким образом, благодаря увеличению содержания катионов кальция в органах рыб, возможно возрастание активности процессов окислительного фосфорилирования и синтеза макроэргических соединений для успешного формирования адаптации. Кроме того, повышение активности кальпаиновой системы приведет к быстрому лизиро-ванию поврежденной ткани.
Выводы
Изменение содержания катионов кальция в органах карпа зависит от структурных повреждений органов, на степень тяжести которых влияет природа гербицида (сложность химического состава и растворимость в воде). Коррекция обмена веществ у
двулеток карпа в условиях гербицидной нагрузки возможна за счет катионов кальция, которые необходимо добавлять в воду при контроле ее рН.
Библиографические ссылки
1. Богоявленская М. П. Возможность использования Ca45 в качестве метки рыб // Рыбн. хоз-во. -1955. - № 11. - С. 50-51.
2. Бондарева Л. А. Внутриклеточная Со+зависимая протеолитическая система животных / Л. А. Бондарева, Н. Н. Немова, Е. И. Кяйвяряйнен. - М. : Наука, 2006. - 294 с.
3. Врочинский К. К. Гидробиологическая миграция пестицидов / К. К. Врочинский, М. М. Телитченко, А. И. Мережко. - М. : Изд-во Моск. ун-та, 1980. - 120 с.
4. Гороновский И. Т. Краткий справочник по химии / И. Т. Гороновский, Ю. П. Назаренко, Е. Ф. Некряч. - К. : Наукова думка, 1987. - 829 с.
5. Давыдов О. Н. Патология крови рыб / О. Н. Давыдов, Ю. Д. Темниханов, Л. Я. Куровская. -К. : Инкос, 2006. - 206 с.
6. Евгеньева Т. П. Гистологические методы в экспериментальной зоологии. - М. : Наука, 1983. - 40 с.
7. Жиденко А. А. Влияние гербицидов на структурный метаболизм карпа (Cyprinus carpio L.) разного возраста // Вісник Харківського національного ун-ту ім. В. Н. Каразіна. Серія біологія. -2008. - Вип. 6, № 788. - С. 86-92.
8. Костин Д. Г. Влияние ионов кальция на транспорт конъюгатов глутатиона в эритроцитах человека / Д. Г. Костин, Н. М. Козлова // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 4а. - С. 48.
9. Костюк П. Г. Ca2+ - один з основних регуляторів внутрішньоклітинних процесів // ЇХ Укра-їнськ. біохім. з’їзд: Тез. доп. - Х. : НАН України, 2006. - Т. 1. - С. 9-10.
10. Немова Н. Н. Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб : Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 1992. - 42 с.
11. Немова Н. Н. Биохимическая индикация состояния рыб / Н. Н. Немова, Р. У. Высоцкая. - М. : Наука, 2004. - 215 с.
12. Романенко В. Д. Кальций и фосфор в жизнедеятельности гидробионтов / В. Д. Романенко, О. М. Арсан, В. Д. Соломатина. - К. : Наукова думка, 1982. - 152 с.
13. Ронин В. С. Руководство к практическим занятиям по методике клинических лабораторных исследований / В. С. Ронин, Г. М. Старобинец, Н. Д. Утевский. - М. : Медицина, 1977. - 335 с.
14. Русанов В. В. Возрастные изменения содержания Ca в костях и чешуе карпа // Изв. НИИ озерн. и речн. рыб. хоз-ва. - 1974. - Т. 92. - С. 145-147.
15. Berg A. Studies on the metabolism of strontium in freshwater fish. II. Relative contribution of direct and intestinal absorbtion in growth conditions // Met. Ist. Ital. Idrobiol. - 1970. - Vol. 23, N 1. - P. 26.
16. Isolation and in vitro characterization of the calpains from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) muscle and their role in texture development / M. Salem, P. B. Kenney, J. Killefere, J. Nath // J. Muscle Foods. - 2004. - Vol. 15. - P. 245-255.
17. Mehendale H. M. Calpain: a death protein that mediates progresion of liver injury / H. M. Mehen-dale, P. B. Limaye // Trends Parmacol. Sci. - 2005. - Vol. 26, N 5. - P. 232-236.
18. Milli-calpain from sea bass (Dicentrarchus labrax) white muscle: purification, characterization of its fctivation in vitro / C. Latrat, V. Verrez-Bagnis, J. Noel, J. Freurence // Mar. Biotechnol. - 2002. -Vol. 4, N 1. - P. 51-62.
19. Rosenthal Y. L. Accumulation of strontium-90 and calcium-45 by fresh water fishes // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1960. - Vol. 104. - P. 88-91.
20. The calpain system / D. E. Goll, V. F. Thompson, H.Li et al. // Physiol. Rev. - 2003. - Vol. 83, N 3. - P. 731-801.
Hadiumna до pедколегiЇ 16.03.2009
