CC BY
75
Новицкий Вячеслав Викторович, д-р мед. наук, профессор, академик Российской академии наук, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ, стар. науч. сотр. лаборатории моделирования физических процессов в биологии и медицине физического факультета ТГУ. E-mail: patfizssmu@yandex.ru Уразова Ольга Ивановна, д-р мед. наук, профессор, профессор кафедры патофизиологии СибГМУ. E-mail: urazova72@yandex.ru Колобовникова Юлия Владимировна, д-р мед. наук, ассистент кафедры патофизиологии СибГМУ. E-mail:
kolobovnikova.julia@mail.ru Область научных интересов: изучение молекулярных основ нарушения гомеостаза клеток крови при социально значимых заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы с целью разработки новых технологических основ этиотропной и патогенетической терапии; исследование молекулярно-генетических и клеточных механизмов развития заболеваний, сопровождающихся эозинофи-лией (гемобластозы, описторхоз, туберкулез легких); изучение структурных и функциональных особенностей эозинофильных гранулоцитов в норме и при патологии, установление роли эо-зинофилии в иммунопатогенезе актуальных заболеваний. Чурина Елена Георгиевна, д-р мед. наук, доцент кафедры патофизиологии СибГМУ. E-mail: lena1236@yandex.ru Область научных интересов: иммунология, клиническая иммунология и аллергология, молекулярная биология.
УДК 615.37:616.24-002.5
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ С ЭОЗИНОФИЛИЕЙ
Ю.В. Колобовникова1, О.И. Уразова1, В.В. Новицкий1,2, Е.Г. Чурина1
1 Сибирский государственный медицинский университет (СибГМУ ), г. Томск 2 Томский государственный университет
Туберкулез легких, сопровождающийся эозинофилией, характеризуется дисбалансом иммунного ответа с превалированием гуморальных иммунных реакций. Целью исследования явилась оценка механизмов Treg-опосредованной супрессии иммунного ответа у больных туберкулезом легких с эозинофилией. Исследование выполнено на лимфоцитах, выделенных из периферической крови 64 пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких, сопровождающимся эозинофилией и без нее. С применением методов проточной цитометрии и иммуноферментного анализа изучены содержание регуляторных Т-клеток по экспрессии поверхностных молекул (CD4, CD25) и внутриклеточного маркера Foxp3, и секреция иммуносупрессорных цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов in vitro. В результате исследования установлено, что у больных туберкулезом легких с эозинофилией возрастает количество регуляторных Т-клеток в периферической крови. При этом установлен дисбаланс секреции in vitro Treg-ассоциированных цитокинов, характеризующийся гиперпродукцией TGFp и IL-10 (при индукции клеток BCG).
Ключевые слова:
Эозинофилия, регуляторные Т-клетки, цитокины, туберкулез легких.
Одним из механизмов супрессии Th1-зависимого иммунного ответа при туберкулезе легких (ТЛ) является увеличение в периферической крови регуляторных Т-клеток (Treg), реализующих свои функции путем контактного взаимодействия и за счет секреции цитокинов-ингибиторов (интерлейкин (IL) - 10 и трансформирующий фактор роста (TGF) в) [1-3]. В исследованиях, проведенных нами ранее, было показано, что у больных ТЛ увеличение численности Treg в периферической крови сопряжено с повышением количества эозинофильных гранулоцитов [4].
В связи с этим целью исследования явилось изучение факторов Treg-опосредованной супрессии иммунного ответа у больных туберкулезом легких с эозинофи-лией крови.
Под наблюдением находилось 64 пациента с впервые выявленным распространенным деструктивным ТЛ (инфильтративным - ИТЛ, диссеминированным -ДТЛ, лекарственно-чувствительным - ЛЧТЛ, лекарственно-устойчивым - ЛУТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет.
В зависимости от абсолютного и относительного количества эозинофилов в периферической крови были сформированы две основные группы исследования: первую группу составили 35 пациентов с ТЛ, сопровождающимся эозинофилией (абсолютное количество эозинофилов соответствовало (0,966 ± 0,110)*109/л, относительное - (8,790 ± 0,250) %); во вторую группу вошли 29 больных ТЛ без эозинофилии (абсолютное число эозинофилов - (0,249 ± 0,010)х109/л, относительное - (2,572 ± 1,190) %).
Группу сравнения (контроль) составили 32 здоровых донора (абсолютное число эозинофилов - (0,196 ± 0,010)*109/л, относительное - (3,530 ± 1,300) %), сопоставимых по полу и возрасту.
При проведении иммуноферментного анализа у всех обследованных лиц диагностически значимых титров антител (иммуноглобулинов класса G) к антигенам гельминтов в сыворотке крови не обнаруживалось; отсутствие паразитоза подтверждалось копроовоскопически.
Все исследования у больных ТЛ проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии.
Материалом исследования служила венозная кровь. Исследования проводили на мо-нонуклеарных лейкоцитах, предварительно выделенных на прерывистом градиенте плотности фиколла (p = 1077 г/л) («БиолоТ», Россия). Определение содержания регуляторных Т-клеток по экспрессии поверхностных молекул CD4, CD25 и внутриклеточного маркера Foxp3 в лимфоцитах периферической крови осуществляли методом проточной цитометрии («Becton Dickinson (BD)», США). Количественное определение цитокинов осуществляли в суперна-тантах культуральных суспензий с применением твердофазного иммуноферментного «сэн-двичевого» метода (ELISA). Процедуру иммуноферментного анализа выполняли согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Biosource», США; «Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Для индукции цитокин-секреторной активности клеток в пробы вносили вакцинный штамм BCG в дозе 50 мкг/мл (ФГУП «НПО Микроген»). Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0.
Туберкулез легких (ТЛ) в сочетании с эозинофилией крови характеризуется снижением концентрации ключевых цитокинов противотуберкулезного иммунитета в сочетании с повышением содержания В-лимфоцитов в периферической крови [5]. Выявленные изменения указывают на превалирование специфического №2-зависимого иммунного ответа, выполняющего скорее вспомогательную роль в механизмах защиты макроорганизма от M. tuberculosis. По мнению исследователей, снижение интенсивности протективного иммунного ответа при ТЛ может быть обусловлено избыточной активностью регуляторных Т-клеток [2, 3, 6].
В настоящем исследовании мы оценили содержание регуляторных Т-клеток (Treg), экспрессирующих внутриклеточный транскрипционный фактор Foxp3, у больных ТЛ в зависимости от числа эозинофилов в периферической крови. В результате исследования установлено достоверное повышение количества CD4 CD25 Foxp3 Treg у всех пациентов с ТЛ, тогда как содержание CD25-негативных Treg-лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточный маркер Foxp3, возрастало только у больных c лекарственно-устойчивым вариантом ДТЛ без эозинофилии. Обращало на себя внимание достоверное увеличение численности Т-лимфоцитов с фенотипом CD4 CD25 Foxр3 при ТЛ, сопровождающимся эозинофилией (6,28 (4,02-9,00) % у больных ИТЛ и 6,72 (3,92-11,56) % у больных ДТЛ), при этом более выраженные изменения количества Treg были обнаружены при лекарственно-устойчивом варианте заболевания (7,04 (6,78-11,48) %, р4 < 0,05).
Известно, что реализация супрессорного потенциала Treg может происходить путем конкурентного CTLA4/B7 взаимодействия или за счет секреции IL-10 и TGFß [7, 8].
В ходе исследования в условиях in vitro нами было зарегистрировано увеличение уровня спонтанной и BCG-индуцированной секреции IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при лекарственно-чувствительном варианте ИТЛ без эозинофилии (табл. 1).
Таблица 1. Содержание 1Ь-10 и ТОБР в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови (пг/мл) у больных туберкулезом легких, Ме
Группы исследования 1Ь-10 ТОБР
Базальная 25,29 (13,50-33,56) 1108,75 (929,80-1487,20)
здоровые доноры ВСО- 26,21 1087,80
индуцированная (22,74-60,22) (500,00-1412,60)
Больные туберкулезом Лекарственно- Лекарственно- Лекарственно- Лекарственно-
легких чувствительный устойчпвьш чувствительный устойчивый
ч ё 1 & 20,91 (14,07-29,24) 22,56 (13,70-29,89) 1299,03 1001,60
Базальная (840,59-1327,78) р1 < 0,05 (630,74-1103,00) р4 < 0,05
43,17 42,98 (31,63-63,15) р1 < 0,05 627,50 652,10
53 и ь ВСО-индуцированная (32,73-61,28) р1 < 0,05 р5 < 0,05 (553,50-731,71) р1 < 0,05 р5 < 0,05 (545,91-743,06) р1 < 0,05 р5 < 0,05
| й в о 1421,31 (769,45-2140,73) р1 < 0,05 1632,12
о ^ о о Базальная 19,00 (16,740-24,71) 20,37 (17,29-25,12) (774,90-2005,78) р1 < 0,05 р3 < 0,05 р4 < 0,05
О р3 < 0,05
1 46,81 (23,90-70,52) р1 < 0,05 р5 < 0,05 1267,83 (771,45-1663,00) р1 < 0,05 р5 < 0,05 1365,48
ме о с а ВСО-индуцированная 44,93 (25,18-69,30) р1 < 0,05 (829,40-1748,22) р1 < 0,05 р3 < 0,05 р5 < 0,05
44,92 (18,75-57,64) р1 < 0,05 р2 < 0,05 578,02
1 ё тива & ь Базальная 27,51 (24,18-42,71) р4 < 0,05 1062,91 (792,24-1613,57) р2 < 0,05 (315,29-781,46) р1 < 0,05 р2 < 0,05 р4 < 0,05
55,49 24,51 (25,62-53,21) р2 < 0,05 р4 < 0,05 752,17
Е ВСО-индуцированная (32,22-65,28) р1 < 0,05 р2 < 0,05 рз < 0,05 1125,92 (875,16-1215,07) р2 < 0,05 (495,32-991,45) р1 < 0,05 р4 < 0,05 р5 < 0,05
о из о о з е Б 24,11 (9,54-50,72) р2 < 0,05 р3 < 0,05 923,62 1072,33
| на и Базальная 20,07 (18,22-21,13) (728,24-1427,19) р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 (915,61-2452,27) р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05
1986,58
ме о с а ВСО-индуцированная 33,52 (20,64-66,17) р3 < 0,05 р5 < 0,05 26,52 (23,57-35,24) р2 < 0,05 873,18 (571,11-1031,92) р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 (792,53-3009,68) р1 < 0,05 р2 < 0,05 р3 < 0,05 р4 < 0,05 р5 < 0,05
Примечание: р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; р2 - у больных туберкулезом легких с эозинофилией; р3 - у больных инфильтративным туберкулезом легких; р4 - у больных лекарственно-чувствительным туберкулезом легких; р5 - по сравнению с интактной культурой клеток внутри одной группы обследованных.
Установлена отрицательная корреляция между повышенной концентрацией 1Ь-10 в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов и содержанием 1Ь-5 в крови у пациентов данной группы (г = -0,67, р < 0,05) [9], что подтверждает супрессорные свойства цитокина, способного подавлять продукцию цитокинов ТЬ2--лимфоцитами. У больных ТЛ, сопровождающимся эози-нофилией, независимо от формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя к ПТП базальная секреция 1Ь-10 соответствовала контрольным значениям, а уровень ВСО-индуцированной секреции этого медиатора достоверно превышал таковой у здоровых лиц (табл. 1).
Следует отметить, что при ТЛ с эозинофилией нормальный уровень секреции IL-10 in vitro сочетался с высоким числом CD4+CD25+Foxр3+ Т-лимфоцитов в крови. Учитывая, что IL-10 - это не единственный антагонист цитокинов клеточного звена иммунитета и активатор супрессорных механизмов, установленное нами несоответствие можно объяснить включением в регуляцию 1Ы/гГЬ2-баланса при туберкулезной инфекции с эозинофилией других цитокинов, в частности TGFß, главным свойством которого является супрессия всех типов иммунного ответа [10, 11].
Согласно результатам, полученным в настоящем исследовании, уровень базальной продукции TGFß в культуре мононуклеарных лейкоцитов у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, достоверно превышал контрольные значения и параметры спонтанной секреции медиатора при ТЛ без эозинофилии (табл. 1). Максимальный уровень базальной и индуцированной in vitro продукции TGFß регистрировался при ЛУ ДТЛ с эозинофилией (1632,12 (774,90-2005,78) пг/мл, р4 < 0,05). Профицит секреции TGFß у больных ТЛ в сочетании с эози-нофилией, по всей видимости, является проявлением гиперфункции основных клеток-продуцентов этого цитокина. Учитывая, что TGFß является цитокином, опосредующим пролиферацию, дифференцировку ^eg и одновременно реализацию ими иммуносупрессорных свойств, избыточные концентрации медиатора при ТЛ могут, с одной стороны, быть причиной увеличения численности субпопуляции ^eg, а с другой - следствием избыточного содержания последних в крови. Вместе с тем эозинофильные гранулоциты сами являются источником TGFß, особенно при заболеваниях, сопровождающихся эозинофилией [12, 13].
Таким образом, накопление Тreg-лимфоцитов в сочетании с высоким уровнем TGFß может быть механизмом иммуносупрессии при ТЛ (в частности, при ДТЛ), течение которого сопряжено с эозинофильной реакцией крови. В целом преобладание гуморального звена иммунного ответа в сочетании с активацией клеток-супрессоров при ТЛ с эозинофилией является неблагоприятным фактором, определяющим более тяжелое прогрессирующее течение заболевания.
Исследования проведены при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-4184.2014.7 «Молекулярные механизмы нарушения апоптоза, пролиферации, дифференцировки и коммуникации клеток крови при социально значимых заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы», руководитель - академик РАН В.В. Новицкий) и Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых - кандидатов медицинских наук (Договор № 14.124.13.3383-МК «Роль эозинофильной реакции крови в патогенезе инфекционного процесса», руководитель - Ю.В. Колобовникова).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Churina E.G., Urazova O.I., Novitskiy V.V. The role of ^oxpJ-expressing regulatory T-cells and T-helpers in immunopathogenesis of multi-drug resistant pulmonary tuberculosis // Hindawi Publishing Corporation, Tuberculosis Research and Treatment. - 2012. - V. 2012. - Article 931291, 9 pages, doi: 10.1155/2012/931291
2. Субпопуляциопная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу у больных туберкулезом легких / Е.Р. Черных, А.А. Останин, В.С. Кожевников и др. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2002. - № 7. - С. 43-47.
3. Иммуносупрессорные эффекты Т-регуляторных клеток при инфильтративном туберкулезе легких / Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 4. - С. 26-29.
4. Роль регуляторных Т-клеток и эозинофилов в механизмах модуляции иммунного ответа при туберкулезе легких / В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина, О.И. Уразова и др. // Иммунология. -2012.- № 4. - С. 184-188.
5. Показатели клеточного и гуморального иммунного ответа при туберкулезе легких, сопровождающемся эозинофилией / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2012. - № 1. - С. 39-45.
6. CD25+ natural regulatory T cells are critical in limiting innate and adaptive immunity and resolving disease following respiratory syncytial virus infection / D.C. Lee, J.A. Harker, J.S. Tregoning et al. // J. Virol. - 2010. - V. 84 (17). - P. 8790-8798.
7. Miyara M., Sakaguchi S. Natural regulatory T cells: mechanisms of suppression // J. Trends. Mol. Med. - 2007. - V. 13. - P. 108-116.
8. Miyara M., Sakaguchi S. Human FoxP3CD4+ regulatory T cells: their knowns and unknowns // J. Immunol. Cell Biol. - 2011. - V. 89 (3). - P. 346-351.
9. Молекулярные механизмы формирования эозинофилии крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Вестник РАМН. - 2012. - № 5. -С.58-62.
10. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3 // Иммунология. - 2006. - № 3. - С. 176-188.
11. Single cell analysis shows decreasing FoxP3 and TGFbeta1 coexpressing CD4+CD25+ regulatory T cells during autoimmune diabetes / S.M. Pop, C.P. Wong, D.A. Culton et al. // J. Exp. Med. -2005. - V. 201 (8). - P. 1333-1346.
12. Human eosinophils constitutively express multiple Th1, Th2, and immunoregulatory cytokines that are secreted rapidly and differentially / L.A. Spencer, C.T. Szela, S.A. Perez et al. // J. Leukoc Biol. - 2009. - V. 85. - P. 117-123.
13. Human eosinophils secrete preformed, granule-stored interleukin-4 through distinct vesicular compartments / R.C. Melo, L.A. Spencer, S.A. Perez et al. // J. Traffic. - 2005. - V. 6. - P. 1047-1057.
Поступила 11.11.2014.
