CC BY
27
REFERENCES
1. Vorsanova SG, Yurov YuB, Chernyshov VN. [Medical cytogenetics (manual)]. Moskow: Medpraktika-M; 2006. Russian.
2. Zerova-Lyubimova TE. [Cytogenetic researches of chromosomes of the person: methodical recommendations]. Kyiv; 2003. Ukrainian.
3. Andreeva SV, Drozdova VD, Ponochevnaya EV, Kavardakova NV. [Reorganizations of chromosome 9 in various hematologic neoplaziyakh]. Tsitologiya i ge-netika. 2008;5:72-79. Russian.
4. Pui CH, Schrappe M, Ribeiro RC, Niemeyer CM. Childhood and Adolescence lymphoid and Myeloid Leukemia. Hematology Amer. Soc. Hematol. Educ. Program. 2004;118-145.
5. Gilliland DG. Targeted therapies in myeloid leukemia. Acute leukemias XI. Prognostic factors and treatment strategies. Ann. Hematol. 2004;83(1): 75-76.
6. Human Cytogenetics. A practical approach. Malignancy and acquired abnormalities. Eds D.E. Rooney, B.H. Czepulkovsky. New York: Oxford Univ. press., 1995;293.
7. Meldipour P, Mirfakhraie R, Jahani M, Meldipour AR. Karyotype evolution: cytogenetics follow_up study in children acute lymphoblastic leukemia. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2003;4:358-68.
8. Raimondi SC. Current status of cytogenetic research in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 1993;81(1):2237-51.
♦
УДК 618.19-006.6-06:577.215/.216
ОЦ1НКА1НФОРМАТИВНОСТ1 СТУПЕНЯ МЕТИЛЮВАННЯ ДНК ГЕНА DKK4 ЯК Д1АГНОСТИЧНОГО КРИТЕР1Ю ПРИ АДЕНОКАРЦИНОМ1 М0Л0ЧН01 ЗАЛОЗИ
Одесъкий нащональний медичний утверситет пров. BcmixiecbKuü, 2, Одеса, 65082, Украта Odessa National Medical University ln. Valihovskyy, 2, Odessa, 65082, Ukraine e-mail: andronov_d@bk.ru
Ключов! слова: метилювання ДНК, ген DKK4, CG сайт, аденокарцинома молочно! залози. Key words: DNA methylation, DKK4 gene, CG site, breast adenocarcinoma
Реферат. Оценка информативности степени метилирования ДНК гена DKK4 как диагностического критерия при аденокарциноме молочной железы. Запорожан В.Н., Бубнов В.В., Маричереда В.Г., Петровский Ю.Ю., Андронов Д.Ю. Аномалии метилирования ДНК играют значительную роль в возникновении и развитии онкологических заболеваний. Целью данного исследования была оценка значимости количественного определения гиперметилирования первого экзона гена DKK4 в качестве биомаркера опухолевой трансформации эпителиальных клеток молочной железы больных аденокарциномой 2-3 стадии. Анализ метилирования был проведен методом количественного пиросеквенирования с использованием набора PSQ96MA фирмы Qiagen. Установлено, что содержание метилированной ДНК гена DKK4 в образцах ткани аде-нокарциномы молочной железы значительно выше, чем в образцах неизмененной ткани молочной железы, взятых от этих же больных. Так содержание метилированной ДНК при раке молочной железы в среднем составило 36,8±12,63 процента, тогда как в образцах условно нормальной ткани молочной железы - 19,37±7,1 процента, р<0,01. Из 23 образцов ткани аденокарциномы молочной железы высокий уровень содержания метилированной ДНК первого экзона гена DKK4 был выявлен в 20 образцах (86,96 %, р<0,01); в 3 образцах уровень метилированной ДНК был сопоставим с содержанием в образцах условно нормальной ткани.
В.М. Запорожан, В.В. Бубнов, В.Г. Mapinepeda, Ю.Ю. Петровський, Д.Ю. Андронов
Abstract. Evaluation of informativeness of DNA methylation degree of DKK4 gene as a diagnostic criterion in breast adenocarcinoma. Zaporozhan V.N., Bubnov V.V., Marichereda V.G., Petrovsky Yu.Yu., Andronov D.Yu.
Abnormalities of DNA methylation play a significant role in initiation and progression of tumors. The aim of the study was the evaluation of the quantitative determination of hypermethylation of DKK4 gene first exon as a biomarker of the breast epithelial cells malignant transformation in patients with adenocarcinoma (2-3 stage). The analysis of DNA methylation was performed by quantitative pyrosequencing using the set PSQ96MA (Qiagen, USA). It was established that DKK4 methylated DNA content in breast adenocarcinoma tissue samples significantly exceeds the same indexes in the unchanged breast tissue taken from the same patients. The average methylated DNA level in conditions of breast cancer equals to 36,8±12,63 percents whereas the same normal breast indexes equal to 19,37±7,1 percents, p<0,01. The increased content of methylated DNA in DKK4 gene first exon was revealed in 20 samples of breast adenocarcinoma tissues out of23 (86.96%, P < 0,01); in the rest 3 samples the investigated content of methylated DNA was comparable with the same index in the normal breast tissues.
Оцшка рол1 метилювання в «мовчант» гетв I геномно! нестабшьносп уважно вивчаеться про-тягом остантх роив [1, 5]. Метилювання ДНК визнано фундаментальним етгенетичним меха-тзмом, який необхщний для нормального ем-брюнального розвитку, регуляци подшу клггин, диференщювання, апоптозу [2, 5, 12]. При цьому неправильне гшер- або гшометилювання ДНК мо-же призводити до низки генетичних захворювань, включаючи новоутворення [4]. Метилювання ци-тозину, за яким слщуе гуатн (метилювання Срв), е найбшьш широкодослщженою етгенетичною модифшащею в оргатзм1 людини [9, 11].
Метилювання цитозину в першому екзот гетв призводить до !х шактиваци шляхом блоку-вання транскрипци. При скритнгу клгтинних лшш колоректального раку карцином була показана висока частота одночасного метилювання вс1х гетв амейства 8РЯР [5]. Було також доведено, що втрата функци гетв 8РЯР при IX метилювант супроводжувалося активащею Wnt-сигнального шляху в клгтинних лшях колоректального раку. Гени ВКК-с1мейства також е шпбггорами активаци Wnt-peгyлятopнoгo каскаду та гальмують р1ст пухлин. Етгенетична шактивацш цих гетв призводить до активаци пухлинного росту в експеримент1 [13, 14].
Вивчення рол1 етгенетично! модифшаци пер-шого екзону гена БКК4 може бути щкава для оцшки можливосп використання метилювання цього гена в д1агностищ та прогноз! перебпу раку молочно1 залози.
Мета дослщження - оцшка значущосп кшь-юсного визначення гшерметилювання першого екзону гена БКК4 як бюмаркера пухлинно! трансформаци еттел1альних клггин молочно! залози.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
До групи дослщження ввшшли 23 жшки, з тдтвердженим д1агнозом аденокарциноми мо-лочно1 залози 2-3 стади, як1 були комплексно обстежет вщповщно до вимог д1ючих кттчних протокол1в, регламентованих наказами МОЗ Ук-
paÏHH (№ 582 вщ 15.12.2003 та № 676 вщ 31.12.2004). Обстеження проведено на кттчних базах кафедри акушерства та гшекологи № 1 Одеського нащонального медичного утверси-тету. Bei жшки, як1 були включет в дослщ-ження, дали шформовану згоду.
Дослщження метилювання гетв DKK4 проводили на бюпешному матер1ат 23 зразюв аденокарциноми молочно!' залози i 22 зразюв незмшено1 тканини молочно!' залози вщ цих же хворих. Геномна ДНК була видшена за допо-могою набор1в GeneJET DNA Purification Kit (Thermo scientific, USA). Бкульфггна обробка геномно!' ДНК була виконана зпдно з протоколом до набору EpiTect Bisulfite kit (Qiagen, Germany). Шсля б1сульфггно1 обробки ДНК, що було видшене, проведена ампл1фшащя методом TouchDown ПЛР з HotStartTag DNA Polymerase. Для ампл1ф1каци використовували Ha6ip Fermentas Maxima Hot Start PCR Master Mix PCR kit (Thermo scientific, USA) i 5 пкмоль специф1чних npafiMepiß: 950C - 15 хв., 10 цикшв - 95°С - 30 сек., 65° С - 1 хв., 3i зниженням температури на 1 градус / цикл.; 40 цикл1в - 94°C - 30 сек., 60°C - 45 сек., 720C - 45 сек.; 72°C - 10 хв.
Дизайн праймер1в здшенювали за допомогою програми MethylPrimer Express v 1.0 (Applied Biosystems, USA).
Анал1з метилювання було проведено методом кшьюсного тросеквенування з використанням набору PSQ96MA компани Qiagen i 10 пкмоль специф1чних праймер1в, що секвенують до першого екзону гена DKK4 зпдно з методикою (Qiagen, Germany). Кшьюсний анатз метилювання проводили на тросеквенатор1 PyroMark Q96 MD i PyroMark Q24 MDX за допомогою програми Pyro Q-CpG Software (Qiagen, Germany). Програма автоматично обчислюе стутнь метилювання CpG сайт1в у npo6i та показуе його у вщеотках для кожного сайту метилювання. Дат були оброблет методами непараметрично!' статистики за Фрщманом.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Вивчення етгенетичних мехатз)шв регуляци розвитку, росту 1 старшия, а також порушення цих мехатзм!в, що призводить до виникнення р1зних захворювань, у тому числ1 й онколо-пчиих, вщгграе велике значения в розумшт мехатзм!в онкогенезу. Для оцшки можливосп використання метилювання промотору гена БКК4 як д1агностнчного маркера було проведено вивчення вмюту метиловано! ДНК цього гена в зразках тканини аденокарциномн й
умовно нормально1 тканини молочно1 залози, що було взято вщ цих же хворих.
У першому екзот гена БКК4 е чотири СО сайти, в яких метилюеться цитозин у клггииах аденокарциноми молочно! залози. На рисунках 1 1 2 представлен! результата визначення р1вня метилювання гена БКК4 методом тросеквену-вання. На рисунках, що представлен!, показано вмкт метиловано! ДНК для кожного Св сайту гена БКК4 у зразку тканини аденокарциноми молочно! залози 1 в умовно нормально! тканини.
Рис. 1. Вмкт метильованих СО сайпв у першому екзош гена БКК4 в зразку незмшеноТ тканини молочноТ залози
Прим1тка : вщсоток метиловано'1 ДНК в СО (або ОТ для комплементарного ланцюга) сайт1в вказано зверху графжа
Вмкт метиловано! ДНК першого екзону гена БКК4 у зразках тканини аденокарциноми молочно! залози значно вище, тж у зразках незмшено! тканини молочно! залози, що було взято вщ цих же хворих. Так р!вень метиловано! ДНК у зразках аденокарциноми молочно! залози в середньому становив 36,8±12,63 в!дсотка, тод! як у зразках умовно нормально! тканини молочно! залози - становив 19,37±7,1 вщсотка, з достов!ртстю р<0,01. 1з 23 зразк!в тканини аденокарциноми молочно! залози високий р!веиь вм!сту метиловано! ДНК першого екзону гена БКК4 було виявлено в 20 зразках (86,96%, р<0,01); у 3 зразках р!вень метиловано! ДНК був пор!вняний з! вмютом у зразках умовно нормально! тканини.
Низький р!вень вм!сту метиловано! ДНК гена БКК4 було виявлено в 21 зразку незмшено! тканини молочно! залози, у двох зразках !з 23 -вмкт метиловано! ДНК було пор!вняно з таким, що ! в зразках тканини аденокарциноми (34 ! 35%).
На рисунку 3 наведено усереднений анал!з пор!вняиня вм!сту метиловано! ДНК гена БКК4 у зразках аденокарциноми та тканини молочно! залози, що незмшена. Чутливють ! специф!чи!сть кшьюсно! оц!ики вм!сту метиловано! ДНК гена БКК4 аденокарциноми молочно! залози, що було розраховано за допомогою програми МеёСа1с, стаиовила 86,9% ! 91,3% в!дпов!дно.
Рис. 2. BMicT метильованих CG сай-пв у першому екзош гена DKK4 у зразку тканини аденокарциноми молочноТ залози
Прим1тка : вщсоток метиловано! ДНК в CG (або GT для комплементарного ланцюга) сайтов вказано зверху графжа
Wnt/beta-catenin кттинний регуляторний шлях е необхщним для нормального ембрюналь-ного розвитку й диференщювання клггин. Абе-рантна активащя цього шляху призводить до блокування апоптозу, диференщювання кттин, тдвищенню мгготичного шдексу [11, 13 ]. Функ-щонування Wnt шляху пов'язано з ключовим ефектором - бета-катеншом. У неактивному стат цитоплазматичний бета-катетн тддаеться фосфорилюванню та подальшш деградаци в про-теосомах. Активащя Wnt регуляторного шляху пов'язана 1з взаемод1ею чинниюв зростання Wnt з
%
мембранним рецептором (амейство Frizzled ре-цептров), перешкоджаючи тим самим деградаци бета-катетну. Транслокащя останнього в ядро та взаемод1я з транскрипцшними факторами призводить до активаци гетв мшеней, функщя яких пов'язана з активащею прол1фераци (Cycline, C-myc та iH.). Гени DKK1, 2,3,4, WIF1 запоб1гають шдукци сигнатзаци, впливаючи на Frizzled рецептори i LRP5-6 ко-рецептор, i е шпбггорами Wnt/beta-catenin клггинного регуляторного шляху [3, 10].
Рис. 3. Усереднений анал1з пор!вняння вмкту метилованоТ ДНК за CG сайтами у першому екзош гена DKK4 у зразках тканини аденокарциноми молочноТ залози (1) та нормально! тканини молочноТ залози (2)
1
2
Оскшьки ген БКК4 е шпбггором Wnt регу-ляторного клггинного шляху, який бере участь у регуляци прол1фераци 1 пухлинному росл, то метилювання гена БКК4 може призводити до ш-пбування його фуикци, тим самим сприяючи активаци прол!фераци 1 росту пухлини [7, 8, 12].
висновки
1. При кшьюснш оцшщ вмюту метиловано! ДНК за СО сайтами першого екзону гена БКК4 було виявлено високий вмкт метиловано! ДНК у зразках тканини аденокарциноми молочно! залози (36,8±2,63%), яке було значно вище, н!ж у иезм!неи!й тканин! молочно! залози, взятш в!д цих же хворих (19,87±1,47%, р<0,001)
2. Чутливють к!льк!сного визначеиня вм!сту метиловано! ДНК гена БКК4, що було розрахо-вано за допомогою програми МеёСа1с, становить 86,9%, а специф!чтсть - 91,3%, що дозволяе ре-комендувати його як б!омаркер для раниьо! д!агностики аденокарциноми молочно! залози.
3. Метод тросеквенування, запроионований для анатзу метилувания першого екзону гена БКК4, е швидким, над!йиим ! високоспеци-ф!чним методом, що дозволяе кшьюсно визна-чати вм!ст метиловано! ДНК у зразках тканини молочно!залози.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Correction of PCR-bias in quantitative DNA met-hylation studies by means of cubic polynomial regression / E.A. Moskalev, M.G. Zavgorodnij, S.P. Majorova [et al.] // Nucleic Acids Res. — 2011. — Vol. 39.— e77.
2. Dapper 1 antagonizes Wnt signaling by promoting dishevelled degradation / L. Zhang, X. Gao, J. Wen, Y. Ning [et al.] // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 8607-8612.
3. Deletions of chromosome 8p and loss of SFRP1 expression are progression markers of papillary bladder cancer / R. Stoehr, C. Wissmann, H. Suzuki [et al.] // Lab. Invest. — 2004. — Vol. 84. — P. 465-478.
4. DNA hypermethylation accompanied by trans-criptional repression in follicular lymphoma / L.B. Bennett, J.L. Schnabel, J.M. Kelchen [et al.] // Genes Chromosomes Cancer. — 2009.— Vol. 48.— P. 828-841.
5. Epigenetic inactivation of the Wnt antagonist DICKKOPF-1 (DKK-1) gene in human colorectal cancer / O. Aguilera, M.F. Fraga, E.Ballestar [et al.] // Oncogene. — 2006. — Vol. 25. — P. 4116-4121.
6. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer / H. Suzuki, D.N. Watkins, K.W. Jair [et al.] / Nat. Genet. — 2004. — Vol. 36. — P. 417-422.
7. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer / M. Nojima, H. Suzuki, M. Toyota [et al.] // Oncogene. — 2007. — Vol. 26 . — P. 4699-4713.
8. Frequent epigenetic inactivation of Wnt antagonist genes in breast cancer / H. Suzuki, M. Toyota, H. Caraway [et al.] // Br. J. Cancer. — 2008. — Vol. 98. — P. 1147-1156.
9. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/beta-cate-nin signaling, is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing / T.O. Yau, C.Y. Chan, K.L. Chan, [et al.] // Oncogene. — 2005. — Vol. 24. — P. 1607-1614.
10. Loss of SFRP1 is associated with breast cancer progression and poor prognosis in early stage tumors / E. Klopocki, G. Kristiansen, P.J. Wild [et al.] // Int. J. Oncol. — 2004. — Vol. 25. — P. 641-649.
11. Niehrs C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators / C. Niehrs // Oncogene. — 2006. — Vol. 25. — P. 7469-7481.
12. Polakis P. Wnt signaling and cancer / P. Polakis // Genes Dev. — 2000. — Vol. 14. — P. 1837-1851.
13. Kawano Y. Secreted antagonists of the Wnt signaling pathway / Y. Kawano, R. Kypta // J. Cell Sci. — 2003. — Vol. 116. — P. 2627-2634.
14. Small molecule inhibitors of Wnt/beta-cate-nin/lef-1 signaling induces apoptosis in chronic lympho-cytic leukemia cells in vitro and in vivo / R.K. Gan-dhirajan, P.A. Staib, K. Minke [et al.] // Neoplasia. — 2010. — N 12. — P. 326-335.
REFERENCES
1. Moskalev EA, Zavgorodnij MG, Majorova SP, Vorobjev IA, Jandaghi P, Bure IV, Hoheisel JD. Correction of PCR-bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Res. 2011;39:e77.
2. Zhang L, Gao X, Wen J, Ning Y, Chen YG. Dapper 1 antagonizes Wnt signaling by promoting dishevelled degradation. J Biol Chem. 2006;281:8607-12.
3. Stoehr R, Wissmann C, Suzuki H. et al.Deletions of chromosome 8p and loss of SFRP1 expression are progression markers of papillary bladder cancer. Lab. Invest. 2004;84:465-78.
4. Bennett LB, Schnabel JL, Kelchen JM, Taylor KH, Guo J, Arthur GL, Papageorgio CN, Shi H, Caldwell CW. DNA hypermethylation accompanied by transcriptional repression in follicular lymphoma. Genes Chromosomes Cancer. 2009;48:828-41.
5. Aguilera O, Fraga MF, Ballestar E, Paz MF, Herranz M, Espada J, García JM, Muñoz A, Esteller M, González-Sancho JM. Epigenetic inactivation of the Wnt antagonist DICKKOPF-1 (DKK-1) gene in human colorectal cancer. Oncogene. 2006;25:4116-21.
6. Suzuki H, Watkins DN, Jair KW. et al. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer. Nat. Genet. 2004;36:417-22.
7. Nojima M, Suzuki H, Toyota M. et al. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer. Oncogene. 2007;26:4699-713.
8. Suzuki H, Toyota M, Caraway H. et al. Frequent epigenetic inactivation of Wnt antagonist genes in breast cancer. Br. J. Cancer. 2008;98:1147-56.
9. Yau TO, Chan CY, Chan KL, Lee MF, Wong CM, Fan ST, Ng IO. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling, is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing. Oncogene. 2005;24:1607-14.
10. Klopocki E, Kristiansen G, Wild PJ. et al. Loss of SFRP1 is associated with breast cancer progression and poor prognosis in early stage tumors. Int. J. Oncol. 2004;25:641-9.
11. Niehrs C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators. Oncogene. 2006;25:7469-81.
12. Polakis P. Wnt signaling and cancer. Genes Dev. 2000;14:1837-51.
13. Kawano Y, Kypta R. Secreted antagonists of the Wnt signaling pathway. J. Cell Sci. 2003;116:2627-34.
14. Gandhirajan RK, Staib PA, Minke K, Gehrke I, Plickert G, Schlösser A, Schmitt EK, Hallek M, Kreuzer KA. Small molecule inhibitors of Wnt/beta-catenin/lef-1 signaling induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells in vitro and in vivo. Neoplasia. 2010;12:326-35.
♦
УДК 618.14:616-006.36-089:612.6
В. О. Потапов, СУЧАСН1 П1ДХОДИ ДО Л1КУВАННЯ
Ю.В. Донсъка, Г1ПЕРПЛАЗП ЕНДОМЕТР1Я У Ж1НОК 3
М.В. Медведев ЛЕЙОМЮМОЮ МАТКИ
ДЗ «Дтпропетровсъка медична академгя МОЗ Украти»
кафедра акушерства i гтекологи
(зав. - д. мед. н., проф. В. О. Потапов)
вул. Дзержинського, 9, Днтропетровськ, 49044, Украта
SE "Dnipropetrovsk medical academy of Health Ministry of Ukraine"
Department of Obstetrics and Gynecology
Dzerzhinsky str., 9, Dnipropetrovsk, 49044, Ukraine
e-mail: medvedev.mv@gmail.com
Ключов! слова: лейомюма матки, zineprna3Ín endoMempin, консервативна MÍ0MeKm0MÍn,0pzaH036epizam4e лгкування, аготсти ГнРГ, КОК
Key words: uterine leiomyoma, endometrial hyperplasia, myomectomy, conservative treatment, GnRH agonists, OCPs
Реферат. Современные подходы к лечению гиперплазии эндометрия у женщин с лейомиомой матки. Потапов В.А., Донська Ю.В., Медведев М.В. В исследовании принимало участие 155 женщин, из них 30 практически здоровых женщин составили контрольную группу. 125 женщин с лейомиомой матки и гиперплазией эндометрия составили основные группы. Было проведено рандомизированное исследование новой схемы применения агонистов ГнРГ совместно с КОК после консервативной миомэктомии. Методики сравнения включали монотерапию а-ГнРГ, гестагены (дидрогестерон) либо КОК. Проведенное лечение с использованием различных медикаментозных схем терапии гиперплазии эндометрия после миомэктомии убедительно продемонстрировало достоверно большую эффективность комбинации а-ГнРГ с КОК в отношении снижения частоты симптомов этих заболеваний, выразительности менструальной кровопотери и повышения качества жизни в весь период наблюдения. Большая эффективность применения комбинации КОК и а-ГнРГ, по нашему мнению, связана с большей степенью супрессии пролиферации и ангиогенеза как за счет локального воздействия (КОК), так и на системном уровне (а-ГнРГ). Таким образом, предложенный метод адъювантной терапии после миомэктомии для женщин с сопутствующей гиперплазией эндометрия имеет значительные клинические преимущества с минимальным воздействием на минеральную плотность костной ткани и другие климактерические проявления, вызванные монотерапией а-ГнРГ.
