CC BY
32
D3-15 a.qxd 06.09.2015 18:18 Page 22
al. Mikroelementy v meditsine. 2004; 5 (4) : 17-20 (in Russian)
3. Serdiuk A.M., Belitskaia E.N., Paranko N.M. and Shmatkov G.G. Tiazhelye metally vneshnei sredy i ikh vliianie na reproduktivnuiu funktsiiu zhenshchin [Heavy Metals of the Environment and their Impact on the Reproductive Function in the Women]. Dnepropetrovsk : Art-press ; 2004 : 148 p. (in Russian)
4. Biletska E.M., OnulN.M. Dov-killia ta zdorovia. 2011; 4 (59) : 1519 (in Ukrainian).
5. Bakulin I.G., Novozhenov V.G., Ivanova M.A. and Malabaev K.D. Otsenka elementnogo statusa v opredelenii nutrientnoi obespe-chennosti organizma. Znachenie narushenii elementnogo statusa pri razlichnoi patologii [Assessment of Elemental Status in the Determination of the Nutrient Supply of the Organism. Significance of the Disturbances of Elemental Status at Different Pathology]. Moscow ; 2005. — Available at : http://portal.vita-max.ua/media/60417/2005_ opit_01_bakulin.doc (in Russian)
6. Mendiola J., Moreno М.J., Ro-ca М., Vergara-Juarez N., Marti-nez-Garcia M.J., Garcia-Sanchez A., Elvira-Rendueles etal. Environmental Health. 2011 ; 10 (6).
7. Amidu N., Owiredu W.K.B.A., Bekoe M.A.T. and Quaye L. Journal of Medical and Biomedical Sciences. 2012; 1 (1): 14-20.
8. Fatma Atig, Monia Raffa, Ben-Ali Habib, Abdelhamid Ker-keni, Ali Saad and Mounir Ajina. BMC Urology. 2012; 12: 6.
9. Antomonov M.Yu. Matema-ticheskaia obrabotka i analiz medi-ko-biologicheskikh dannykh [Mathematical Processing and Analysis of Medico-Biological Data]. Kyiv ; 2006 : 558 p. (in Russian)
10. Prokhorova G.V. Sorosovskii obrazovatelnyi zhurnal. 2004; 8 (1) : 51-56. (in Russian)
11. Telisman S., Colak B., Piz-entA., Jurasovic J. andCvitkovic P. Environ. Res. 2007; 105: 256-266.
12. Jockenhoevel F., Bals-Pratsch M., Bertram H.P. and Ni-eschlag E. Andrologia. 1990; 2 (6); 503-511.
13. Romaniuk A.M., Moskalenko Yu.V., Sauliak S.V., Bonchev S.D. and Moskalenko R.A. Likarska spra-va. 2013; 4: 122-127. (in Russian)
14. Ghassan T. Alani, Sermed S. Khonda and Hedef D. El Yaseen. The Iraqi Postgraduate Medical Journal. 2011; 10 (1): 81-88.
15. Meeker J.D., Rossano M.G., Protas B., Diamond M.P., Puscheck E., Daly D. еt al. Environ. Health Perspect. 2008; 116: 1473-1479.
Надійшла до редакції 09.02.2015
SAFETY ASSESSMENT OF PROBIOTIC STRAINS B. BIFI0UM AND E. FAECIUM
Shentsova M.A., Surmasheva O.V., Nikonova N.O., Sahniuk O.M., Nastoiashcha N.I.
ОЦІНКА БЕЗПЕЧНОСТІ ПРОБІОТИЧНИХ ШТАМІВ B. BIFIDUM ТВ E. FAECIUM
ШЕНЦОВА М.О.1, СУРМАШЕВА О.В.1, НІКОНОВА Н.О.1, САХНЮК О.М.2, НАСТОЯЩА Н.І.2 1ДУ "Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзєєва НАМН України", 2ДП "Державний експертний центр МОЗ України", м. Київ
УДК 579.67 : 614.8
Ключові слова : пробіотичні препарати, B. bifidum, E. faecium, токсичність.
айже усі існуючі нині пробіотичні штами, які використовуються у виробництві пробіотичних препаратів і дієтичних добавок, мають статус GRAS (Generally regarded as safe) і визнані як безпечні для використання людиною. Даний статус надає міжнародне визнання безпеки пробіотичних штамів і дозволяє необмежене застосування їх у харчовій та фармацевтичній промисловості, а також безпечне використання для дітей з перших днів життя [1-4]. Молочнокислим бактеріям роду Enterococcus не було надано статусу GRAS, оскільки представники цього роду нині є одними з основних збудників внутрішньолікар-няних інфекцій і здатні викликати тяжкі захворювання [5]. Тому питання щодо безпечного практичного використання ентерококів залишається дискусійним і широко обговорюваним [4].
Метою роботи було визначення токсикологічних характеристик стосовно потенційної безпечності для здоров'я досліджуваних про-
ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ B. BIFIDUM И E. FAECIUM
Шенцова М.А., Сурмашева Е.В., Никонова Н.А., Сахнюк О.Н., Настоящая Н.И.
Актуальность работы заключается в важности стандартизации пробиотических препаратов. Для стандартизации их используют стандартные образцы пробиотических микроорганизмов. Определение безопасности стандартных образцов является обязательным условием.
Материалы и методы. Использованы общепринятые методы определения безопасности микроорганизмов. Оценку безопасности пробиотических штаммов проводили в остром и хроническом опытах опеределения токсичности по наличию летального эффекта и изменению показателей, характеризующих функциональное состояние организма и отдельных органов экспериментальных животных — мышей и крыс.
Результаты исследования. Во время проведения испытаний штаммов B. bifidum и E. faecium при однократном их введении в организм животных (внутрибрюшинное, внутрижелудочное и подкожно) не удалось определить основной параметр токсичности — показатель середнесмертельной дозы ЛД50.
При многократном введении суспензий пробиотических штаммов B. bifidum и E. faecium в организм структурно-функциональных изменений в тканях и органах экспериментальных животных не зафиксировано, что свидетельствует о безопасности штаммов. Таким образом, в моделях острого и хронического экспериментов была продемонстрирована безопасность микробных популяций в созданных стандартных образцах B. bifidum и E. faecium. Ключевые слова: пробиотические препараты, B. bifidum,
E. faecium, токсичность.
© Шенцова М.О., Сурмашева О.В., Ніконова Н.О.,
Сахнюк О.М., Настояща Н.І. СТАТТЯ, 2015.
№ 3 2015 Environment & Health 22
D3-15 a.qxd 06.09.2015 18:18 Page 23
SAFETY ASSESSMENT OF PROBIOTIC STRAINS B. BIFIDUM AND E. FAECIUM Shentsova M.A., Surmasheva O.V.,
Nikonova N.O., Sahniuk O.M., Nastoiashcha N.I.
Actuality of the work lies in the significance of the standardization of probiotic preparations.
The standard samples of probiotic microorganisms are used for their standardization. Determination of standard samples' safety is a compulsory condition. Materials and methods. We used generally accepted methods of the assessment of the micro-organisms' safety. Assessment of the safety of probiotic strains was conducted in acute and chronic experiments of the toxicity by the presence of lethal effect and change of the indices characterizing the functional state of the organism and separate organs of the experimental animals — mouse and rats.
Results. During the testing of the strains B. bifidum and E. faecium at their single introduction into the organism of the animals (intraperitoneal, intragastric and subcuta neum) we failed to determine a main parameter of toxicity — an indicator of median lethal dose LD50.
At the multiple introduction of the suspensions of probiotic strains B. bifidum and E. faecium into the organism the structural and functional changes in tissues and organs of experimental animals were not fixed, it indicates the strains' safety. Thus, a safety of the microbial populations in the created standard samples B. bifidum and E. faecium was demonstrated in the models of acute and chronic experiments.
Keywords: probiotic preparations, B. bifidum, E. faecium, toxicity.
біотичних штамів B. bifidum та E. faecium в умовах короткотривалої дії. Для прогнозування потенційної здатності про-біотичних субстанцій накопичуватися в організмі, ризику виникнення негативних шкідливих ефектів та хронічної інтоксикації, отже й можливості чинити загальнотоксичну дію були досліджені кумулятивні властивості зразків пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium.
Матеріали і методи. Токси-колого-гігієнічна оцінка лабораторних зразків пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium, які були виділені з молочнокислих продуктів, здійснювалася шляхом визначення та аналізу параметрів гострої токсичності за внутрішньошлунко-вого, внутрішньовенного та підшкірного введення їх до організму лабораторних тварин, хронічної токсичності — за вну-трішньошлункового введення. Усі дослідження супроводжувалися контролями — групи інтактних тварин з аналогічними параметрами фізичного стану [2, 6, 7].
Токсикологічні властивості пробіотичних штамів визначали в експериментах гострої та хронічної токсичності за наявністю летального ефекту і змінами показників, що характеризують функціональний стан організму тварин.
У дослідах використовували клінічно здорових безпорідних білих мишей з масою тіла (18,0 ± 2,0) г (80 голів), безпорідних білих щурів з масою тіла (180,0 ± 20,0) г (30 голів), які утримувалися на стандартному раціоні у стабільних умовах за ГОСТ 42 1-88. Про відсутність ознак токсичності у пробіотичних штамів судили за станом інте-
гральних показників, що відображають рівень метаболічних процесів: масою тіла тварин, ваговими коефіцієнтами та відсутністю патоморфологічних змін в органах тварин.
Гістологічні дослідження виконувалися стандартними методами з фарбуванням препаратів гематоксилін-еозином.
Статистичну обробку отриманих даних було проведено на ПК Intel® Pentium Dual-Core inside, цифровий матеріал у кожній окремій вибірці був перевірений та підтверджений на нормальне розподілення величин. Для чисельних даних розраховували середнє арифметичне, дисперсію та стандартне квадратичне відхилення. Інтервал надійності отримували з вірогідністю 95%.
Результати дослідження. При детальному аналізі результатів вивчення гострої токсичності було виявлено, що однократне введення досліджуваних штамів B. bifidum та E. faecium у дозі 1х1011 КУО/мл мишам і щурам у максимально допустимій дозі різними способами не впливало на загальний стан піддослідних тварин. Симптомів гострого отруєння не спостерігалося, летальність була відсутня. Пробіотичні культури добре переносилися тваринами: вони були активними, рухливими, з нормальною координацією рухів, стандартною реакцією на зовнішні подразники, звичайною частотою дихальних рухів, нормальною консистенцією фекальних мас, кратністю сечовипускання та забарвлення сечі, гарним апетитом і нормальним зовнішнім виглядом та не відрізнялися від контрольних.
Під час спостереження за зміною маси тіла тварин у динаміці принципових відмінностей у тварин дослідних та контрольних груп не було виявлено. Було зафіксовано збільшення маси тіла усіх експериментальних груп.
Так, маса тіла обох груп мишей, яким вводили підшкірно суспензії пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium, зросла порівняно з початковим її значенням відповідно з (17,55 ± 0,09) г і (17,29 ± 0,11) г на (24,60 ± 1,03)% і (26,82 ± 1,15)%. Спостерігалося також і збільшення маси тіла у контрольної групи на (25,76 ± 0,99)%. Індекс приросту маси тіла дослідних тварин складав 0,96 для групи мишей, якій вводили штам B. bifidum, і 1,03 для мишей, які отримували пробіотичний штам E. faecium.
Лабораторні щури, яким підшкірно вводили пробіотичні штами, також помітно збільшили масу тіла: зафіксовано підвищення показника середньої маси зі (184,71 ±
1.97) г на (15,94 ± 2,01)% для групи тварин, яка отримувала штам B. bifidum, і зі (177,38 ±
1.97) на (15,06 ± 1,66)% для групи, що отримувала E. faecium. Щури контрольної групи збільшили масу тіла у середньому на (13,87 ± 1,45)%, а індекс приросту маси тіла дорівнював 1,21 для групи, якій вводили штам B. bifidum, і 1,10 — для групи, що отримувала штам E. faecium.
Схожі результати було зафіксовано для тварин, які отримували пробіотичні штами вну-трішньошлунковим способом. Так, група мишей, якій вводили штам B. bifidum, збільшила
23 Environment & Health № 3 2015
D3-15 a.qxd 06.09.2015 18:18 Page 24
масу тіла у середньому на (25,34 ± 1,39)%. На (26,68 ± 0,75)% зросла маса тіла мишей, які отримували штам E. Faecium, у контрольній групі — на (26,99 ± 0,69)%. Індекс приросту маси мишей, які отримували пробіотичний штам B. bifidum, склав 0,94, а E. fae-cium — 0,99.
Дослідні щури, які отримували пробіотичні штами, збільшили масу тіла на (15,50 ± 1,35)% (штам B. bifidum) і (16,18 ± 1,55)% (штам E. faecium), у контрольній групі — на (15,46 ± 0,91)%. Індекс приросту маси тіла щурів дослідних груп був майже однаковим і складав 1,04 і 1,06 відповідно.
Для лабораторних тварин за внутрішньочеревного введення було отримано такі результати. Приріст маси тіла мишей, що отримували штам B. bifi-dum, склав (23,91 ± 1,36)%, E. faecium — (28,54 ± 0,63)%, а для контрольної групи тварин — (25,15 ± 0,84)%. Тобто індекс збільшення маси тіла мишей дорівнював 0,97 для штаму B. bifidum і 1,13 — для штаму E. faecium.
Середній приріст маси тіла щурів за внутрішньочеревного введення штамів B. bifidum та E. faecium дорівнював (16,73 ± 1,20)% і (17,77 ± 1,52)% відповідно. Тварини контрольної групи збільшили вагу у середньому на (17,95 ± 0,93)%. Індекс приросту маси тіла склав 0,97 для групи щурів, яка внутрішньовенно отримувала штам B. bifidum, і 0,99 — для групи з E. faecium.
Таким чином, найбільший приріст показників маси тіла було зафіксовано для групи щурів, яким вводили підшкірно штам B. bifidum. Найменш результативним способом введення пробіотичних штамів з негативним значенням індексу приросту маси тіла виявився внутрішньочеревний спосіб.
Отже, усі три способи введення суспензії пробіотичних мікроорганізмів з метою вивчення параметрів гострої токсичності виявилися безпечними і не спричиняли будь-якого шкідливого впливу на загальний стан піддослідних тварин. Не було зафіксовано жодних клінічних ознак проявів інтоксикації, інтегральні показники залишалися у нормі, функціональні порушення або морфо-
логічні зміни були відсутні. Тому виділені пробіотичні штами B. bifidum та E. faecium можна віднести до V! класу токсичності і вважати відносно нешкідливими за класифікацією Сидорова К.К. [6].
Під час проведення випробувань гострої токсичності не вдалося визначити основний параметр токсичності — показник середньосмертельної дози ЛД50 за внутрішньочеревного, внутрішньошлункового та внутрішньовенного способів введення суспензій пробіотичних штамів лабораторним мишам і щурам. Дослідження впливу більш високої кількості мікроорганізмів пробіотичних штамів було обмежене можливістю введення великих об'ємів зразків експериментальним тваринам. Розрахунковий індекс кумуляції визначити також не вдалося. Таким чином, пробіо-тичні штами можна вважати малотоксичними.
Результати вивчення хронічної токсичності пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium базувалися на патолого-анато-мічних і гістологічних дослідженнях органів мишей. Отримані дані з взаємозалежності
між дозою та ефектом дії про-біотичних субстанцій за одноразового введення було використано нами для визначення дози для досліджень токсичності під час повторних введень.
Було виявлено, що в умовах 3-місячного багаторазового внутрішньошлункового введення суспензій штамів про-біотичних бактерій загибелі піддослідних тварин не відбувається. До кінця строку спостережень усі тварини залишались у нормальному фізіологічному стані і без ознак захворювань. Так, загальний стан, зовнішній вигляд, поведінкові реакції, харчова активність мишей не змінювалися. Маса тіла білих мишей протягом експериментів зростала і до кінця досліджень збільшилася у середньому на (80,59 ± 3,31)% у контрольній групі та на (81,83 ± 8,03)% і (81,65 ± 4,47)% — у дослідних групах тварин, які отримували штами B. bifidum та E. faecium відповідно.
Доведено, що при повторних внутрішньошлункових введеннях протягом 90 діб у максимальних терапевтичних дозах пробіотичні субстанції не спричиняли негативного впли-
Рисунок
Мікроскопічні картини зрізів органів мишей: а — тимус (контрольна група); б — тимус (група B. bifidum); в — тимус (група E. faecium); г — печінка (контрольна група); ґ — печінка (група B. bifidum); д — печінка (група E. faecium); з — нирки (контрольна група); и — нирки (група B. bifidum); і — нирки (група E. faecium); з — легені (контрольна група); и — легені (група B. bifidum); і — легені (група E. faecium)
№ 3 2015 Environment & Health 24
D3-15 a.qxd 06.09.2015 18:18 Page 25
ву на основні системи та органи мишей. Фізіологічні і геоморфологічні показники дослідних тварин не відрізнялися від таких в інтактних мишей та не виходили за межі фізіологічної норми. Величини та індекси абсолютних мас внутрішніх органів мишей за багаторазового введення досліджуваних пробіотичних зразків у тварин дослідних та контрольної груп були рівнозначними. Анатомічна картина органів усіх дослідних тварин, яким вводили B. bifidum та E. faecium, була тотожною.
Виявлено, що в усіх тварин дослідної та контрольної груп не зафіксовано будь-яких патологічних змін у жодному з органів (рис.).
Дослідження найважливіших органів — головних антитоксичних бар'єрів на шляху потрапляння бактеріальних агентів до організму лабораторних тварин — дозволило підтвердити відсутність синдрому вираженої загальної інтоксикації. Відсутність клінічних проявів токсинемії, токсичної дистрофії та некротичних змін паренхіматозних органів вказують на відсутність токсичної пошкоджуючої дії пробіотичних штамів на клітини макроорганізму. Так, при детальному аналізі мікропре-паратів органів тварин обох дослідних груп не виявлено змін в їхній структурі порівняно з такою у контрольної групи. У паренхіматозних органах дистрофічні і некротичні новоутворення виявлені не були. Зміни морфології життєво важливих внутрішніх органів тварин дослідних груп за внут-рішньошлункового введення мишам стандартизованої суспензії пробіотичних штамів не були виявлені. У так званих "шокових" органах — нирках та легенях — змін також не було виявлено. Таким чином, отримані дослідні дані свідчать про слабко виражені кумулятивні властивості експериментальних лабораторних зразків пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium.
Після надходження до організму піддослідних тварин протягом 3-х місяців приріст маси тіла був таким, як і у тварин контрольної групи.
Таким чином, на моделях гострої і хронічної токсичності було продемонстровано без-
пеку мікробних популяцій у створених лабораторних зразках пробіотичних штамів B. bifi-dum та E. faecium.
Висновки
На моделях гострої і хронічної токсичності було продемонстровано безпеку мікробних популяцій у створених лабораторних зразках пробіотичних штамів B. bifidum та E. faecium.
Однократне внутрішньошлун-кове, підшкірне і внутрішньочеревне введення пробіотич-них штамів B. bifidum та E. fae-cium у максимально можливих дозах (1011 КУО/мл) не викликало токсичного впливу на організм експериментальних тварин, що дозволяє зробити висновок про безпечність виділених мікроорганізмів.
Багатократне внутрішньо-шлункове введення суспензій досліджуваних зразків про-біотичних штамів B. bifidum та E. faecium у максимально допустимих дозах не викликало токсичного впливу на організм тварин, що дозволяє зробити висновок про нешкідливість пробіотичних штамів.
Результати патологоанато-мічних і гістологічних досліджень різних органів білих мишей, а також відсутність факту загибелі тварин та змін у мікроскопічній структурі досліджених органів свідчать про нешкідливість пробіотичних штамів.
ЛІТЕРАТУРА
1. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards. WHO Technical Report Series 932, annex 2 / WHO Expert Committee on Biological Standardization. — Geneva, 2004. — P 73-131, 137.
2. Державна Фармакопея України. — Перше видання. Доповнення 4. — Харків, 2011. — 538 с.
3. Нетребко О.К. Пробиотики и пребиотики в питании грудных детей / О.К. Нетребко // Педиатрия. — 2007. — Т 86, № 1. — С. 80-87.
4. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл / Н.А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. — 2003. — № 4. — С. 50-58.
5. Бондаренко В.М. Симбиотические энтерококки и проблема энтерококковой оппортунистической инфекции / В.М. Бондаренко, А.Н. Суворов // Москва, 2007. — 30 с.
6. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введе-
ния / К.К. Сидоров // Токсикология новых промышленных химических веществ. — М., 1973. — Вып. 13. — С. 47-60.
7. Медико-биологические исследования производственных штаммов микроорганизмов и токсиколого-гигиеническая оценка микробных препаратов, определение их безопасности и обоснование гигиенических нормативов и регламентов : метод. указания. — Приказ № 521 МОЗ Украины 26.10.2004.
REFERENCES
1. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Recommendations for the Pepara-tion, Characterization and Establishment of International and other Biological Reference Stan-dards.WHO Technical Report Series 932, annex 2.Geneva ; 2004 : 73-131, 137.
2. Derzhavna Farmakopeia Ukra-iny. Pershe vydannia. Dopovnennia 4 [National Pharmacopoeia of Ukraine. First Edition. Supplement 4]. Kharkiv ; 2011 : 538 p. (in Ukrainian).
3. Netrebko O.K. Pediatriia. 2007; 86(1):80-87.
4. Glushanova N.A. Biulleten si-birskoi meditsiny. 2003; 4 : 50-58 (in Russian).
5. Bondarenko V.M., Suvorov A.N. Simbioticheskie enterokokki i problema enterokokkovoi oppor-tunisticheskoi infektsii [Symbiotic Enteroccocus and Problem of Enterococcus Opportunistic Infection]. Moscow ; 2007 : 30 p. (in Russian)
6. Sidorov K.K. O klassifikatsii toksichnosti yadov pri parenteral-nykh sposobakh vvedeniia [On Classification of Poisons' Toxicity at Parenteral Ways of Introductions]. In : Toksikologiia novykh promyshlennykh khimicheskikh veshchestv [Toxicology of New Industrial Chemical Substances]. Moscow ; 1973 ; Iss. 13 : 47-60 (in Russian).
7. Mediko-biologicheskie is-sledovaniia proizvodstvennykh shtammov mikroorganizmov i tok-sikologo-gigiencheskaia otsenka mikrobnykh preparatov, oprede-lenie ikh bezopasnosti i obosno-vanie gigienicheskikh normativov i reglamentov : metodicheskie ukazaniia. Utverzhdeny MOZ Uk-rainy Prikaz № 521 26.10.2004 [Medico-Biological Investigations of the Industrial Strains of Microorganisms and Toxicological-Hygienic Assessment of the Microbial Preparations, Determination of their Safety and Substantiation of the Hygienic Standards and Regulations : Methodical Instructions] (in Russian).
Надійшла до редакції 08.02.2015
25 Environment & Health № 3 2015
