CC BY
58
УДК:573.864.1:615.331
АНТИБАКТЕРІАЛЬНІ Й ІМУНОМОДУЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ШТАМІВ ЛАКТО-ТА БІФІДОБАКТЕРІЙ ЗА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ СТАФІЛОКОКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ
В. В. Мокрозуб
Л. М. Лазаренко Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
Л. П. Бабенко НАН України, Київ
Л. М. Шинкаренко М. Я. Співак
Е-mail: [email protected]
Отримано 08.09.2011
Визначено антибактеріальні й імуномодулювальні властивості штамів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281*, Lactobacillus casei ІМВ В-7280*, Lactobacillus acidophilus ІМВ В-7279*, Bifidobacterium longum VK1 та Bifidobacterium bifidum VK2 на моделі експериментальної стафілококової інфекції у мишей. Встановлено, що під впливом цих штамів суттєво зменшувалась кількість колоній Staphylococcus aureus, які висівали з нирок інфікованих мишей. Водночас після введення інфіко ва ним стафіло ко ком ми шам ок ре мих пробіотич них штамів лак то- та біфідо бак терій спо -стерігали підвищення імунорегуляторного індексу CD4/CD8, а також кількості CD19+- та CD25+-клітин у селезінці. Штами Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, Lactobacillus casei ІМВ В-7280, Lactobacillus acidophilus ІМВ В-7279, Bifidobacterium bifidum VK2 і Bifidobacterium longum VK1 є перспективними для створення пробіотиків, ефективних проти стафілококової інфекції, та для корекції імунітету.
Ключові слова: імунітет, інтерферон, Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus aureus, миші.
Створення групи новітніх біотехнологіч-них препаратів — імунобіотиків — на основі попередньо відібраних і охарактеризованих представників нормальної мікрофлори людини, зокрема штамів лакто- та біфідобак-терій, є важливою проблемою сучасної біо-технології, адже сфери застосування цих препаратів значно розширюються, і пробіо-тичну терапію дедалі частіше ставлять на противагу антимікробній [1, 2]. На сьогодні до ве де но ви со ку те ра пев тич ну ефек тивність пробіотиків при інфекційних, автоімунних, алергічних захворюваннях, злоякісних ново ут во рен нях, іму но дефіцит них ста нах то -що [3]. Слід зазначити, що пробіотичну терапію ши ро ко ви ко рис то ву ють під час лікування пацієнтів з «найпоширенішими» інфекційни ми зах во рю ван ня ми, які час то спровоковані агресивними умовно-патоген-ни ми ко мен саль ни ми мікро ор ганізма ми, у тому числі стафілококами, а також супро-вод жу ють ся роз вит ком іму но дефіцит них станів [4].
Для того щоб пробіотик був ефективним, бактеріям, які входять до його складу, має бути притаманний певний спектр біологічної активності. Насамперед, вони мають бути адаптовані до умов мікробіоценозу, виявляти антагоністичну дію щодо широкого спектра патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, мати антитоксичні, антиоксидантні, антимутагенні властивості, а також здатність балансувати імунну відповідь організму за різних форм імунодефіциту тощо [3]. У зв’язку з цим для виявлення опти-маль них пробіотич них штамів ціль о во го призначення доцільним є проведення комплексних досліджень їхньої біологічної дії.
Раніше нами було виділено з біологічного ма теріалу й оха рак те ри зо ва но шта ми лакто- і біфідобактерій: Lactobacillus casei ІМВ В-7280, L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, Bifidobacterium longum VK1 та B. bifidum VK2. Ці штами мали високу антагоністичну активність стосовно патогенних бактерій та
— Штами знаходяться в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України
адгезивні властивості до епітеліоцитів, а на моделі інтактних мишей ефективно індукували продукцію ендогенного інтерферону (ІФН) й активували клітини фагоцитарної системи, не впливаючи на продукцію проза-пального цитокіну — фактора некрозу пух-лин-а [5-9].
У зв’язку з вищенаведеним метою роботи було визначення антибактеріальних та іму-но мо ду лю валь них влас ти вос тей штамів L. casei ІМВ В-7280, L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, B. longum VK1 і B. bifidum VK2 на екс пе ри мен тальній мо делі стафіло ко ко вої інфекції у мишей дослідженням їхнього впли ву на пер сис тенцію стафіло ко ка, а та -кож на по каз ники клітин но го і гу мо раль но -го імунітету за зміною фенотипового складу лімфоцитів селезінки.
Матеріали і методи
Експериментальні дослідження проведено на мишах лінії BALB/c (18-20 г), самицях віком 6-8 тижнів, отриманих із розплід-ни ка Інсти ту ту мо ле ку ляр ної біології та генетики НАН України. Усі дослідження проводили з урахуванням норм Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та наукових цілей, від 20.09.1985, та Закону України № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» [10].
Стафілококову інфекцію моделювали внутрішньочеревним уведенням мишам добової культури S. aureus штам 8325-4 (наданий проф. Зуєвою В. С., Інститут епідеміології і мікробіології ім. Н. Ф. Гамалеї, Російська Федерація) у дозі 1109 кл. на тварину. Цей штам має плазміду стійкості до гентаміцину, внаслідок чого його можна було відділити від інших штамів стафілококів, висіявши на елективне середовище (BAIRD-PARKER-Agar, Merck, Німеччина) із цим антибіотиком (у концентрації 15 мкг/мл). У інфікованих мишей спостерігали такі клінічні прояви інфекційного процесу: підвищення температури тіла, млявість, зниження апетиту.
Використовували ліофілізовані бактерії L. casei ІМВ В-7280, L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, B. longum VK1 та B. bifidum VK2. Пе ред кож ним екс пе ри мен том пе ревіря ли життєздатність пробіотичних бактерій, контролюючи їх ріст на середовищі Man-Rogosa-Sharpe (MRS) при 37 °С упродовж 48 год. Через 24 год після інфікування мишам вво ди ли per os сус пензію пробіотич них
культур у фізіологічному розчині в дозі 1106 кл. на тварину один раз на добу протягом 7 діб. Штами вводили кожен окремо або в комбінації — L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — L. acidophilus ІМВ В-7279 (у рівному співвідношенні). В окрему групу порівняння увійшли інфіковані миші, які не отримували жодної пробіотичної культури, а на томість їм вво ди ли per os фізіологічний розчин. Групу контролю становили інтактні миші. Усі експериментальні дослідження проводили у трьох повторах.
На 1-шу, 3-тю, 6-, 9- та 12-ту добу після початку введення пробіотичних культур від декапітованих мишей отримували нирки, аліквоти гомогенатів яких висівали на елективне середовище для стафілококів із ген-таміци ном з ме тою ви яв лен ня ген таміци -ностійкого S. aureus 8325-4.
Зміну фенотипового складу лімфоцитів селезінки визначали, досліджуючи поверхневі антигени Т- та В-лімфоцитів, а також активованих CD^-клітин за допомогою методу прямої імунофлюоресценції. У роботі використовували моноклональні антитіла до cD3+-, cD4+-, CD8+-, CD19+- та CD^-анти-генів лімфоцитів (MACS, Miltenyi Biotec, Німеччина). Підрахунок кількості Т- та В-лімфоцитів, CD^-клітин, а також аналіз результатів проводили на цитофлюориметрі FACstar Plus (Becton-Dickinson, США).
Усі от ри мані циф рові дані оп раць о ву ва -ли за допомогою комп’ютерної програми Epi Info (версія 6.0) методом варіаційної статисти ки. Нуль о ву гіпо те зу для конт роль ної та дослідних груп порівняння перевіряли за до по мо гою не па ра мет рич них кри теріїв Вілкоксона-Мана-Уїтні (U) і Колмогорова-Смирнова. Відмінності між групами вважали статистично значущими при Р < 0,05.
Результати та обговорення
У результаті проведених досліджень встановлено, що L. casei ІМВ В-7280, L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, B. longum VK1 і B. bifidum VK2 (окремо) та в комбінації L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — L. acidophilus ІМВ В-7279 ви яв ля ли ан тис тафіло ко ко ву дію in vivo на мо делі екс пе ри мен таль ної стафіло -кокової інфекції у мишей. Однак анти-стафіло ко ко ва ефек тивність цих штамів бу -ла різною. Як видно з даних, наведених на рисунку, з гомогенату нирок інфікованих мишей, які не отримували пробіотичних куль тур, S. aureus 8325-4 висівався у ве-
ликій кіль кості про тя гом усь о го терміну спостереження — з 1-ї по 12-ту добу. Після вве ден ня інфіко ва ним ми шам L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 або B. bifidum VK2, ок ре мо чи композиції L. acidophilus ІМВ В-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ B-7281 кількість колоній S. aureus 832б-4, який висівався з гомогенату нирок, зменшувалась починаючи з 1-ї доби і впродовж наступних 12 діб. Разом з тим під впливом B. longum VK1 або L. casei ІМВ В-7280, окремо, на 1-шу добу кількість колоній S. aureus 8325-4, що висівався з нирок, зменшувалась неістотно, то му різни ця порівня но з по каз ни ка ми для інфікованих мишей, які не отримували пробіотичні культури, була невірогідною. Із гомогенату нирок інфікованих мишей, яким уводили ці штами окремо, S. aureus 8325-4 висівався у значно меншій кількості лише на 3-тю, 6-, 9- та 12-ту добу. Слід зазначити, що на 1-шу, 3-тю, 6- та 9-ту добу антистафілоко-кова дія була ефективнішою у L. acidophilus ІМВ В-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 або B. bifidum VK2, окремо та в ком по зиції L. acidophilus ІМВ В-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, ніж у B. longum VK1 або L. casei ІМВ В-7280.
Інфіковані
1 -І-------------1------------1------------т------------1------- ■ L. acidophilus ІМВ В-7279
1 доба 3 доба б до6а 9 доба 12 доба - L. delbrueckii subsp.
bulgaricus ІМВ В-7281
Кількість колоній S. aureus 8325-4, що їх висіва ли з го мо ге на ту ни рок інфіко ва них мишей після перорального введення пробіотич них штамів
На 12-ту добу антистафілококова активність ок ре мих пробіотич них куль тур та композиції може бути оцінена таким чином: L. acidophilus ІМВ В-7279 / L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 > L. acidophilus ІМВ В-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 > B. bifidum VK2 / L. casei ІМВ В-7280 > B. longum VK1. Композиція L. acidophilus ІМВ В-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 також проде-
монструвала високу антистафілококову активність, проте вона вірогідно не відрізнялась від активності у L. acidophilus ІМВ В-7279 або L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, окремо.
Результати проведених нами раніше досліджень [11] стосовно антагоністичної властивості цих пробіотичних культур in vitro стосовно S. aureus 8325-4, були такі: L. acidophilus ІМВ В-7279 > B. bifidum VK2 > L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 > B. longum VK1 / L. casei ІМВ В-7280. Отже, in vivo деякі штами, зокрема B. bifidum VK2, справ ля ли менш ефек тив ну антистафілококову дію, ніж in vitro, порівняно з іншими штамами. Імовірно, це можна пояснити тим, що пробіотичні бактерії мо жуть ви яв ля ти різні ме ханізми ан ти -стафілококової дії in vitro та in vivo [3].
Відо мо, що ан ти бак теріаль на дія про біо -тичних штамів лакто- та біфідобактерій in vivo опосередковано пов’язана з їхніми іму-номодулювальними властивостями. Встановлено [12], що з розвитком ефективної імунної відповіді на стафілокок спостерігає-ть ся ак ти вація як клітин ної, так і гу мо раль -ної ланок імунітету, оскільки в патогенезі зах ворю вань, спри чи не них стафіло ко ка ми, певну роль відіграють як бактеріальні клітини, так і їхні екзотоксини. Тому далі проводили дослідження фенотипового складу селезінки інфікованих стафілококом мишей, які отримували штами лакто- та біфідобактерій.
Одержані нами дані показали, що за стафілококової інфекції кількість CD3+-, CD8+-, CD^-клітин у селезінці не змінювалась порівняно з показниками контролю протягом усього терміну спостереження (таблиця). Однак на 3-тю добу спостерігали зменшення кількості CD^-клітин, що призводило до зниження імунорегуляторного індексу CD4/CD8. На 1-шу, 6- та 9-ту добу кількість CD^-клітин у селезінці інфікованих мишей та імунорегу-ляторний індекс CD4/CD8 залишались у межах контрольних величин. Кількість CD^-клітин підвищувалась на 1-шу добу, але в інші терміни зменшувалась до рівня контролю.
Фенотиповий склад лімфоцитів селезінки змінювався під впливом пробіотичних культур. Так, спостерігалось незначне підвищення кількості CD^-клітин у селезінці інфікованих мишей, які отримували B. longum VK1 на 9-ту добу, L. acidophilus ІМВ В-7279 або L. casei ІМВ В-7280 окремо — на 1-шу добу, B. bifidum VK2 — на 6-ту добу, або композицію L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — L. acidophilus ІМВ В-7279 — на 6-ту добу, проте різниця стосовно показників для інфікованих мишей, які
не отримували пробіотичні штами, та в контролі була невірогідною. Встановлено, що порівняно з показниками для інфікованих мишей, які не одержували пробіотичні штами, кількість CD4+-клітин на 3-тю добу підвищувалась лише під впливом композиції L. del-brueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — L. acidophilus ІМВ В-7279. Разом з тим кількість CD^-клітин була нижчою, ніж у контролі (інтактні миші), у селезінці інфікованих мишей, які отримували B. longum VK1 на 3-тю та 6-ту добу, або B. bifidum VK2 — на 3-тю, або L. acidophilus ІМВ В-7279 — на 9-ту добу, або L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — на 6-ту добу.
Кількість CD^-клітин у селезінці інфікованих мишей зменшувалась під впливом B. longum VK1 на 1-шу добу, L. acidophilus ІМВ В-7279 або L. casei ІМВ В-7280, або B. bifidum VK2 — на 3-тю добу стосовно показників для інфікованих мишей, які не одержували пробіотичні штами, та в контролі. Протягом усього терміну кількість цих клітин зберігалась на рівні контролю в селезінці інфікованих мишей, які отримували L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 або композицію L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 — L. acidophilus ІМВ В-7279.
Фенотиповий склад лімфоцитів селезінки інфікованих мишей, які отримували пробітичні бактерії
Групи мишей/ термін спостереження Відносна кількість клітин, % CD4/CD8, ум. од.
CD3+ cd4+ C D 00 + CD19+ CD25+
Інтактні - 56,3±3,4 41,5±2,3 26,3±2,3 8,8±3,4 9,1±1,2 1,60±0,13
Інфіковані 1-ша доба 57,8±2,3 42,2±3,4 24,8±3,3 6,7±1,3 12,1±2,3* 1,70±0,11
3-тя доба 56,2±0,9 36,0±1,4* 25,9±2,3 11,5±1,3 9,2±1,3 1,39±0,09*
6-та доба 55,2±3,5 40,6±2,3 25,4±2,4 5,2±1,4 6,4±1,4 1,60±0,10
9-та доба 57,4±2,5 43,0±2,3 23,0±1,4 9,5±1,4 9,0±2,3 1,87±0,14
Отримува- ли: B. longum VK1 1-ша доба 52,3±4,5 40,9±2,4 18,6±1,4*^ 13,1±1,3 • 8,5±1,2 2,20±0,19*^
3-тя доба 54,1±5,4 33,5±1,4* 21,3±2,5 5,8±1,2 • 5,7±2,3 1,57±0,17
6-та доба 51,8±1,4 32,7±1,5* 20,5±2,3 13,9±0,9 • 11,3±2,3 1,60±0,16
9-та доба 64,6±2,6 42,2±2,4 24,6±2,3 7,5±1,4 9,7±2,3 1,72±0,15
L. acidophilus ІМВ В-7279 1-ша доба 63,1±3,5 40,4±3,4 25,6±3,3 11,3±2,4 • 7,0±1,4 1,58±0,16
3-тя доба 53,4±4,4 37,2±2,3 18,1±2,4*^ 11,4±1,3 10,2±2,4 2,06±0,20 •
6-та доба 52,4±5,4 37,5±1,4 26,0±3,4 10,6±2,4 • 9,2±3,4 1,44±0,19
9-та доба 51,3±3,4 35,8±1,4% 22,5±2,3 11,3±2,3 10,0±2,3 1,59±0,11
L. casei ІМВ В-7280 1-ша доба 64,9±4,6 43,1±2,3 24,5±1,4 9, 4 If 3 9,9±2,3 1,76±0,20
3-тя доба 58,7±5,3 38,5±3,3 19,6±1,5*^ 7,6±1,4 7,7±3,4 1,96±0,16 •
6-та доба 58,5±4,5 41,7±3,5 23,4±2,4 7,8±2,4 7,3±1,4 1,78±0,20
9-та доба 62,7±5,5 42,4±2,5 26,1±2,3 11,2±1,3 6,7±1,3 1,62±0,16
B. bifidum VK2 1-ша доба 61,0±3,4 38,5±3,4 22,2±1,4 11,9±1,4 • 15,6±1,3* 1,73±0,16
3-тя доба 52,0±4,4 35,6±2,3* 17,1±2,3*^ 6,5±2,2 14,5±1,3% 2,08±0,21 •
6-та доба 64,3±1,6 39,5±2,4 26,1±2,3 13,2±2,4 • 14,4±2,4% 1,51±0,13
9-та доба 55,9±3,5 36,5±3,4 25,5±2,3 11,9±1,3 9,1±2,4 1,43±0,14 •
L. delbrue-ckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 1-ша доба 58,9±4,5 36,8±3,5 23,0±1,4 10,3±1,3 • 16,2±2,3*^ 1,60±0,16
3-тя доба 60,6±4,4 37,8±2,5 22,3±3,4 9,8±2,4 5,4±3,3 1,70±0,14
6-та доба 52,5±3,4 34,5±1,4% 21,7±2,3 11,4±2,4 • 12,9±1,3*^ 1,59±0,14
9-та доба 58,3±4,6 43,3±1,4 22,4±2,3 14,6±3,4 • 10,1±2,4 1,93±0,16
L. delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 L. acidophilus ІМВ В-7279 1-ша доба 59,3±3,5 41,6±1,5 22,8±1,4 10,2±2,3 • 10,0±2,3 1,82±0,15
3-тя доба 62,2±4,4 40,9±1,2 • 20,0±2,4 7,8±3,4 6,0±1,3 2,07±0,13 •
6-та доба 57,0±2,5 37,6±3,4 22,4±3,4 12,9±1,3 • 15,7±2,3*^ 1,59±0,12
9-та доба 59,5±3,6 40,6±2,3 27,4±1,3 13,0±2,3 14,9±3,4*^ 1,48±0,15
Примітка: * — Р < 0,05 стосовно показників для інтактних мишей; • — Р < 0,05 стосовно показників для інфікованих мишей, які не отримували пробіотичні культури.
Імунорегуляторний індекс CD4/CD8 на 3-тю добу підвищувався після введення інфікованим мишам L. acidophilus !MB B-7279, L. casei LMB B-7280, B. bifidum VK2 окремо (через зменшення кількості CD^-клітин) або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279 (через підвищення кількості CD^-клітин) порівняно з показниками для інфікованих мишей, які не отримували пробіотичних культур. Під впливом B. longum VK1 імунорегуляторний індекс CD4/CD8 підвищувався на 1-шу добу (унаслідок зменшення кількості CD^-клітин) стосовно як показників для інфікованих мишей, які не отримували пробіотичних культур, так і контролю.
Кількість CD^-B-лімфоцитів у селезінці інфікованих мишей, які отримували пробіотичні культури, не змінювалась порівняно з показниками контролю. Однак на 1-шу та б-ту добу кількість цих клітин підвищувалась після введення інфікованим мишам B. longum VK1, L. acidophilus rMB B-7279, B. bifidum VK2, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, кожний окремо, або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279 порівняно з інфікованими мишами, які не отримували пробіотичні культури.
Звертає на себе увагу те, що під впливом B. bifidum VK2 (на 1-шу, 3-тю та б-ту добу), L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 (на 1-шу і б-ту добу), а також композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279 (на б- та 9-ту добу) у селезінці інфікованих мишей суттєво зростала кількість CD^-клітин. Це може свідчити про активацію Т-, B-лімфоцитів чи макрофагів або підвищення експресії на поверхні клітини рецепторів інтерлейкіну-2 — цитокіну №1-клітин, який спрямовує розвиток імунної відповіді за клітинним типом. Під впливом інших пробіотичних культур кількість CD^-клітин у селезінці інфікованих мишей зберігалась на рівні контролю. Отже, зростання імунорегуляторного індексу CD4/CD8, а також кількості у селезінці CD19+- і CD^-клітин після введення інфікованим стафілококом мишам окремих пробіотичних штамів лакто- та біфідобактерій, які досліджували, у різні терміни спостереження опосередковано може свідчити про активацію як клітинної, так і гуморальної ланок імунітету.
Таким чином, встановлено, що штами L. casei !MB B-7280, L. acidophilus !MB B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, B. longum VK1 та B. bifidum VK2, та-
кож композиція L. acidophilus !MB B-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 на моделі експериментальної стафілококової інфекції у мишей виявляли антибактеріальну й імуномодулювальну дію. Усі штами продемонстрували антистафілококову ефективність in vivo, однак найефективнішою вона була у L. acidophilus rMB B-7279 та L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, кожен штам ок ре мо. Слід заз на чи ти, що L. acidophilus !MB B-7279 мав високу антагоністичну активність щодо S. aureus 8325-4 in vitro [11], а штам L. delbrueckii subsp. bulgaricus ЩЕ B-7281 — виявився активатором фагоцитів [7], активність яких внаслідок пе ребігу стафіло ко ко вої інфекції по ру шу ва -лась [13]. Однак уведення мишам композиції L. acidophilus ШЬ B-7279 — L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 не призвело до очікуваного поліпшення анти-стафілококової дії цієї композиції порівняно з монокультурами. Показано, що багато різних штамів лакто- та біфідобактерій пригнічували ріст S. aureus, зокрема, L. acidophilus EP317/402 [14], L. acidophilus CL1285(®) і L. casei LBC80R [15]; L. plantarum 8P-A3, L. casei DN-114001, L. reuteri [1б], B. longum Z4, B. bifidum Г1 [17] та деякі інші штами Bifidobacterium [18]. Здійснюється пошук інших штамів молочнокислих бактерій, які б мали високу ефективність проти стафілококів і виявляли здатність до балансування імунної відповіді, порушеної внаслідок перебігу патологічного процесу. Bодночас завжди має бути пробіотичний препарат вибору, оскільки в різних хворих один і той самий штам або штами у складі композицій можуть по-різному адаптуватись до умов мікробіоценозу, що буде визначати їхню ефек тивність.
Одержані дані свідчать, що після введення інфікованим стафілококом мишам пробіотичних штамів лакто- та біфідобактерій, які ми досліджували, спостерігалася зміна деяких показників, що характеризують стан клітинного й гуморального імунітету. Зауважимо, що ці штами на моделі експериментальної стафілококової інфекції у мишей справ ля ли різну іму но мо ду лю валь ну дію. Так, на 3-тю добу підвищувався до рівня контролю імунорегуляторний індекс CD4/CD8 під впливом L. acidophilus !MB B-7279, L. casei rMB B-7280, B. bifidum VK2 окремо або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — L. acidophilus !MB B-7279 порівняно з інфікованими мишами, які не отримували пробіотичні культури. Bтім, зростання цього показника відбува-
лося за рахунок підвищення у селезінці кількості CD^-клітин лише після введення інфікованим стафілококом мишам композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279. Bодно-час кількість CD^-клітин у різні терміни спостереження виявилась нижчою, ніж у контролі (інтактні миші), у селезінці інфікованих мишей, які отримували B. longum VK1, B. bifidum VK2, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 або L. acidophilus !MB B-7279, окремо. Під впливом L. acidophilus !MB B-7279, L. casei !MB B-7280, B. bifidum VK2, B. longum VK1, окремо, імунорегуляторний індекс CD4/CD8 підви щу вав ся за ра ху нок змен шен ня кіль -кості CD8+-клітин у селезінці інфікованих мишей. Про активацію гуморальної ланки імунітету опосередковано свідчило підвищення у селезінці кількості CD^-B-лімфо-цитів у різні терміни спостереження після введення інфікованим мишам B. longum VK1, L. acidophilus !MB B-7279, B. bifidum VK2, L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281, окремо, або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 —
L. acidophilus !MB B-7279. Під впливом B. bifidum VK2 (на 1-шу, 3-тю та б-ту добу), L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 (на 1-шу та б-ту добу), а також композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279 (на б- та 9-ту добу) у селезінці інфікованих стафілококом мишей підвищувалась кількість клітин, які експресували антиген CD25+. Інші штами пробіотичних бактерій, які ми вивчали, не впливали на кількість CD^-клітин у селезінці інфікованих мишей. Аналізуючи отримані дані, можна зробити припущення, що на моделі експериментальної стафілококової інфекції ефективніший імуномодулюваль-ний вплив на по каз ни ки клітин но го та гу мо -рального імунітету мала композиція L. delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279, оскільки під її впливом підвищувалась на 3-тю добу кількість CD^-Т-лімфоцитів, що призвело як до зростання величини імунорегулятоного індексу CD4/CD8, так і CD19+- та CD^-клітин (у різні терміни спостереження).
Підвищення кількості Т- та B-лімфоцитів, а також їхньої проліферативної активності та продукування ними низки імунорегулятор-них цитокінів, зокрема Th1- та №2-типу, спостерігалось під впливом багатьох інших штамів лакто- та біфідобактерій при різних патологічних процесах [19-23]. Характер впливу на активність Т- та B-лімфоцитів
і спектр цитокінів відрізнялись у різних штамів молочнокислих бактерій, а результати окремих досліджень показали, що дія залежала від дози. Результати проведених нами досліджень і дані літературних джерел свідчать, що імуномодулювальні властивості окремих культур лакто- та біфідобак-терій суттєво відрізняються між собою, це є їх індивідуальною характеристикою. Тому, створюючи препарати на основі лакто- та біфідобактерій з підвищеним рівнем імуно-модулювальної активності — імунобіотики — доцільно забезпечити виконання всіх умов максимальної реалізації закладеного в цих бактеріях біологічного потенціалу.
Отримані нами дані підтверджують вимоги Європейського регуляторного законодавства в галузі пробіотиків щодо необхідності проведення всебічних досліджень біологічної активності як окремих пробіотичних культур, так і їх поєднань при створенні пробіотичних препаратів на основі монокультур лакто- та/або біфідобактерій чи їх різних комбінацій.
Отже, пробіотичні штами L. casei rMB B-7280, L. acidophilus rMB B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, B. longum VK1 та
B. bifidum VK2 мали антагоністичні властивості стосовно стафілокока in vivo, про що свідчило прискорення елімінації Staphylococcus aureus 8325-4 з нирок інфікованих мишей.
Імуномодулювальні властивості пробіотичних штамів L. casei !MB B-7280, L. acidophilus rMB B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, B. longum VK1 та B. bifidum VK2, окремо, або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279 на моделі експериментальної стафілококової інфекції у мишей підтверджувало підвищення в різні терміни спостереження величини імунорегуляторного індексу CD4/CD8, кількості в селезінці CD^-клітин (під впливом композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279), СD19+-B-лімфоцитів, а також CD^-клітин (під впливом B. bifidum VK2, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, окремо, або композиції L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281 — L. acidophilus rMB B-7279).
Пробіотичні штами L. casei rMB B-7280, L. acidophilus !MB B-7279, L. delbrueckii subsp. bulgaricus rMB B-7281, B. longum VK1 та B. bifidum VK2 є перспективними для створення імунобіотиків, ефективних щодо Staphylococcus aureus, а також для корекції показників імунореактивності організму, по ру ше них унаслідок пе ребігу
інфекційно-запальних захворювань.
ЛІТЕ РА ТУ РА
1. Кругликов В. Д., Цураева Р. И., Рыжков И. В. и др. Бозможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии // Журн. микробиол. — 1997. — № 1. — С. б7-б9.
2. Банникова Л. А., Королева H. С., Семенихи-на В. Ф. Mикробиологические основы молочного производства. — M.: Агропромиз-дат, 1987. — 400 с: ил.
3. Широбоков В. П., Янковский Д. С., Ды-мент Г. С. Mикробная экология человека. — К.: ООО «Червона Рута-Турс», 2010. — 340 с.
4. Шендеров Б. А. Значение колонизационной ре зис те нт нос ти в па то ге не зе ин фек -ционных заболеваний / Иммунология инфекционного процесса. Под ред. B.^ Покровского и др. — M.: Mедицина, 1994. — 24б с.
5. Spivak M. Ya., Pidgorsky V. S., Lazarenko L. M. et al. Lactobacillus and Bifidobacterium influence on the indices of immune influence on the indices of immune response of the organism showed on experimental model // Microbiology @ Biotechnology. — 2009. — N 1(5). — P. З9-4б.
6. Старовойтова С. А.., Лазаренко Л. H.,Авде-ева Л. В. и др. По иск штам мов бак те рий ро -дов Lactobacillus и Bifidobacterium, перс-пек тив них для соз да ния про би о ти ков // Наук. вісник Ужгород. ун-ту (Сер. Біол.). — 2009. — Т. 2б. — С. 21б-219.
7. Пат. № 93133. Штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus !MB B-7281 — активатор фагоцитов / Співак M. Я., Шинкаренко Л. M., Підгорський B. С. та ін. — Заявл. 11.07.2010; Опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1.
8. Пат. № 93132. Штам Lactobacillus
acidofillus MB B-7279 — індуктор ендогенного інтерферону І типу / Співак M. Я., Підгорський B. С., Шинкаренко Л. M. та ін. — Заявл. 11.07.2010; Опубл.
10.01.2011, Бюл. № 1.
9. Пат. № 93133. Штам Lactobacillus casei MB B-7280 — індуктор «пізнього» інтерферону та активатор макрофагів / Співак M. Я., Шинкаренко Л. M., Підгорський B. С. та ін. — Заявл. 11.07.2010; Опубл.
10.01.2011, Бюл. № 1.
10. Рєзніков О. Г. Проб ле ми ети ки при про ве -денні екс пе ри мен таль них ме дич них і біологічних досліджень на тваринах // Bісник НАНУ. — 2001. — № 1. — С. 5-7.
11. Старовойтова С. А.., Лазаренко Л. H., Авдеева Л. В. и др. По иск штам мов бак те рий ро -дов Lactobacillus и Bifidobacterium, перс-пек тив них для соз да ния про би о ти ков //
Наук. вісник Ужгород. ун-ту (Сер. Біол.). — 2009. — Т. 26. — С. 216-219.
12. Белобородов В. Б., Митрохин С. Д. Стафилококковые инфекции / Инф. антибакт. тер. — 2003. — Т. 5, № 1. — С. 28-35.
13. Спивак Н. Я., Лазаренко Л. Н., Михайлен-
ко О. Н. Интерферон и система мононукле-арных фагоцитов. — К.: Фитосоцио-
центр. — 2002. — 164 с.
14. Старовойтова С. А. Розробка композиції поліштамового пробіотику на основі бактерій роду Lactobacillus: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. — Київ, 2008. — 21 с.
15. Karska-Wysocki B, Bazo M, Smoragiewicz W. Antibacterial activity of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // Microbiol Res. — 2010. — V. 165 (8). — P. 674-686.
16. Ермоленко Е. И., Исаков В. А., Ждан-Пуш-кина С. Х. Количественная характеристика антагонистической активности лактобацилл // Мікробіол. журн. — 2004. — № 5. —
С. 94-98.
17. Коршунов В. М., Уртаева З.А., Смеянов В. В. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованиемп гнотобиологической технологии // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. — 1999. — № 5. — С. 72-77.
18. Lahtinen S. J., Jalonen L., Ouwehand A. C., Salminen S. J. Specific Bifidobacterium strains isolated from elderly subjects inhibit growth of Staphylococcus aureus // Int. J. Food Microbiol. — 2007. — V. 117(1). — P. 125-128.
19. D'Arienzo R., Maurano F., Luongo D. et al. Adjuvant effect of Lactobacillus casei in a mouse model of gluten sensitivity // Immunol. Let. — 2008. — V. 119(1-2). — P. 78-83.
20. Ko E. J., Goh J. S., Lee B. J. et al. Bifidobacterium bifidum exhibits a lipopolysaccharide-like mito-genic activity for murine B lymphocyte. // J. Dairy Sci. — 1999. — V. 82(9). — P 1869-1876.
21. Mane J., Pedrosa E., Loren V. et al. A mixture
of Lactobacillus plantarum CECT 7315 and CECT 7316 enhances systemic immunity in elderly subjects: A dose-response,
double-blind, placebo-controlled, randomized pilot trial // Nutr. Hosp. — 2011. — V. 26(1). — P. 228-235.
22. Walsh M. C., Gardiner G. E., Hart O. M. et al. Predominance of a bacteriocin-producing Lactobacillus salivarius component of a five-strain probiotic in the porcine ileum and effects on host immune phenotype. // FEMS Microbiol. Ecol. — 2008. — V. 64(2). — P. 317-327.
23. Yasui H., Ohwaki M. Enhancement of immune response in Peyer's patch cells cultured with Bifidobacterium breve. // J. Dairy Sci. — 1991. — V. 74(4). — P. 1187-1195.
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ЛАКТО- И БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
В. В. Мокрозуб Л. Н. Лазаренко Л. П. Бабенко Л. Н. Шинкаренко Н. Я. Спивак
Инс ти тут мик ро би о ло гии и ви ру со ло гии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Определены антибактериальные и иммуномодулирующие свойства штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, Lactobacillus casei ІМВ В-7280, Lactobacillus acidophilus ІМВ В-7279, Bifidobacterium longum VK1 и Bifidobacterium bifidum VK2 на модели экспериментальной стафилококковой инфекции у мышей. Установлено, что под вли-я ни ем этих штам мов су ще ст вен но умень ша -лось ко ли че ст во ко ло ний Staphylococcus aureus, которые высевались из почек инфици-ро ван ных мы шей. Вмес те с тем пос ле вве де ния инфицированным стафилококком мышам от-дель ных про би о ти чес ких штам мов лак то-и бифидобактерий наблюдалось повышение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, атак-же количества СD19+- и CD^-клеток в селезенке. Штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281, Lactobacillus casei ІМВ В-7280, Lactobacillus acidophilus ІМВ В-7279, Bifidobacterium bifidum VK2 и Bifidobacterium longum VK1 яв ля ют ся перс пектив ны ми для соз да ния про би о ти ков, эф фек тив ных про тив стафилококковой инфекции, и для коррекции им му ни те та.
Ключевые слова: иммунитет, интерферон,
Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus aureus, мыши.
ANTIBACTERIAL AND IMMUNOMODULATING PROPERTIES OF LACTO- AND BIFIDOBACTERIA STRAINS AT EXPERIMENTAL STAPHYLOCOCCAL INFECTION
V. V. Mokrozub L. M. Lazarenko L. P. Babenko L. M. Shinkarenko M. Ya. Spivak
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
Antibacterial and immunomodulating properties of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, Lactobacillus casei IMV B-7280, Lactobacillus acidophilus B-7279 IMV, Bifidobacterium longum VK1 and Bifidobacterium bifidum VK2 strains were determined at the experimental model of staphylococcal infection of mice. It was established that under the influence of these strains it was significantly reduced the number of Staphylococcus aureus colonies, which were seeded out from kidneys of infected mice. At the same time after introduction by mice with staphylococcal infection of separate probiotic strains of lacto- and bifidobacteria it was observed increasing of the CD4/CD8 immunoregulatory index, and also the number of CD19+- and cD25+-cells in spleen. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IMV B-7281, Lactobacillus casei IMV B-7280, Lactobacillus acidophilus B-7279 IMV, Bifido-bac terium bifidum VK2 and Bifidobacterium longum VK1 strains found to be perspective for probiotics creation, that could be effective against staphylococcal infection and for the immunity correction.
Key words: immunity, interferon, Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus aureus, mice.
