CC BY
14
УДК 575.16:636,538+577.155
Данченко О.О., кандидат хiмiчних наук, доцент (nina@melitopol.net) Калитка В.В., доктор сшьськогосподарських наук, професор Колесник Д.М., астрант (dmitrynk@rambler.ru), Здоровцева Л.М., асистент © Мелтопольський державный педагог1чний утверситет
ОЦ1НКА АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСУ ТКАНИН ПТАХ1В В ОНТОГЕНЕЗ1 13 ЗАСТОСУВАННЯМ КОРЕЛЯЦ1ЙНОГО АНАЛ1ЗУ
Як оцтка стану системи антиоксидантного захисту розглядаеться р1вень узгодженост1 показнимв цгел системи. Узгоджетсть компонент1в системи АОЗ оцтювали за мльмстю парних кореляцгйних зв'язтв. Вгдносну мльмсть зв'язтв визначали за допомогою комп 'ютерног програми SPSS. З 'ясували узгоджетсть змт цих показнимв протягом другог половини ембрюгенезу i на початку постнатального перюду у тканинах гусей на Mni змн фiзiологiчного стану птицг. Доведено, що для визначення перiодiв дестабтзацп системи антиоксидантного захисту та оцнки антиоксидантного статусу достатня вибхрка з ТБК - активних продуктiв i антиоксидантних ферментiв.
Ключовi слова: активы форми кисню, система антиоксидантного захисту, ТБК-активш продукти, антиоксидантш ферменти, жиророзчинш втамши А, Е i fí-каротин, кореляцтний аналiз.
Вступ. В атмосферi кисню внутршньокл^инна генеращя активних форм кисню (АФК) е неминучим i водночас фiзiологiчно важливим процесом [1]. Для управлшня цим процесом кл^ини володшть багатокомпонентною системою захисту ввд АФК. I визначальною причиною окиснювального стресу е не продукщя АФК сама по соб^ а порушення балансу у просторi i час мiж !х генеращею i знешкодженням [2,3].
Матер1ал i методи. Для шкубаци вщбирались яйця гусей бшо! горьювсько! породи з середньою масою 134,2±8,4 г. Дослщження системи АОЗ в ембрiогенезi проводили у фiзiологiчно обгрунтоваш термши: 15 дiб -замикання аланто!су, наявнiсть сформовано! печшки, 22 доби -перехiд з бшкового типу живлення на жовтковий, 28 дiб -перенесення ембрiонiв на виведення, 30 дiб - вилуплення гусенят. У постнатальному перiодi онтогенезу дослщження проводили протягом перших дев'яти тижшв життя - термiну вирощування м'ясних гусенят [4]. Ращон пташенят був збалансований за обмiнною енергiею, проте!ном i вiтамiнами.
Об'ектом дослiдження були тканини печшки, мозку i скелетних м'язiв. Гусенят декапiтували пiд ефiрним наркозом згiдно зi схемою експерименту. Видалений мозок промивали у фiзiолоriчному розчинi i гомогенiзували в 50мМ фосфатному буферi (рН = 7,4).
Лшщш екстракти одержували за методом E.G. Bligh та W.I. Dyer [5] iз рекомендацiями F.B. Palmer [6]. Жирнокислотний склад визначали у
© Данченко О.О., Калитка В.В., Колесник Д.М., Здоровцева Л.М., 2008
61
лшщному екстрактД методом газорщинно! хроматографа на хроматографi Carlo Erba (1талДя) Í3 скляними набивними колонками (2,5мх3мм). Як носiй використовували Chromosorb W/DP Í3 нанесеною 10%-ю фазою Silar 5CP ("Serva", Нiмеччина) в умовах програмовано! температури 140-250 °С, 2 °С/хв ( температура iнжектора 210 °С, температура детектора 240 °С).
Ненасиченiсть ЖК визначали сумою вмДсту окремих ненасичених жирних кислот (НЖК) у мЕкв/г ЖК вiдносно подвшних зв'язкДв, що визначали за формулою:
m ■n ■103
N =-
M
де m - маса НЖК у 1г жирнокислотно! сумiшi, г; М -молярна маса НЖК, г/моль; n -кшьюсть подвiйних зв'язкiв у молекулi НЖК.
1нтенсившсть пероксидного окислення лiпiдiв (ПОЛ) у печшщ мозку i скелетних м'язах оцiнювали за вмiстом продуктДв пероксидаци, якi реагують з 2-тюбарбДтуровою кислотою (ТБК-активними продуктами) [7], вмДст вiтамiнiв А, Е i ß-каротин спектрофотометрично [8].
Стан системи антиоксидантного захисту (АОЗ) в тканинах ощнювали за коефiцieнтом антиоксидантно! активностi (Каоа ), який розраховували як вщношення вихщного ПОЛ (без Дшщащ! Fe2+ ) до iндукованого Fe2+ ПОЛ, оскшьки в гомогенатах тканин мктиться не тiльки субстрат пероксидаци, а й компонента АОЗ, якД здатш гальмувати пероксидацiю лшццв. Статистичну обробку результатiв здiйснювали з використанням t-критерш Ст'юдента.
Результати дослщження. Ранiше нами було дослщжено динамiку основних показникДв про-антиоксидантно! рiвноваги: вмДсту лшщДв i !х жирнокислотного складу, вторинних продуктДв лiпопероксидацi! ТБК-активних продуктДв (ТБКАП), активностД антиоксидантних (АО) ферментiв супероксиддисмутазну (СОД), каталазну (КАТ), глутатиопероксидазну (ГПО) та вмДсту жиророзчинних вiтамiнiв А, Е i ß-каротину у тканинах гусей в онтогенезi [9-12]. Виходячи з того, що повнощнне функцiонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ) передбачае надзвичайну узгодженiсть ди всДх !! компонентДв [1], метою дано! роботи було з'ясування узгодженостД змДн цих показникДв протягом друго! половини ембрюгенезу i початку постнатального перДоду у тканинах гусей на тлД динамДки фДзюлопчного стану оргашзму ще! птищ для ощнки !х антиоксидантного статусу. РДвень узгодженостД компонентДв системи АОЗ ощнювали за кшькютю парних кореляцтаних зв'язкДв основних показникДв рДвноваги ПОЛ-^АОА. ВДдносну кшьюсть кореляцтаних зв'язкДв визначали за допомогою комп'ютерно! програми SPSS.
Розвиток ембрюна за умови дотримки технолопчних умов такубаци можна розглядати як функщонування закрито! системи, оскшьки обмта ембрюна з навколишшм середовищем вДдбуваеться на рДвнД газДв. Кореляцтаний аналДз динамДки дослДджуваних компонентДв системи АОЗ печтаки гусей свДдчить про те, що стутнь !х узгодженостД в ембрюгенезД дуже високий (80,8%) (Рис. 1, а).
62
У постнатальному онтогенезi за ди рiзних антропогенних чинниюв узгодженiсть функцюнування компонентiв системи АОЗ поступово скорочуеться, змiнюeться характер !х взаемоди. Нами встановлено, що зменшення кiлькостi кореляцшних зв'язкiв в межах системи АОЗ у гусей в постнатальному онтогенезi вщбуваеться головним чином у два етапи. Перший -перюд постнатально! адаптаци, супроводжуеться формуванням нових пристосувальних механiзмiв. Постнатальна адаптацiя гусенят, безумовно, визначаеться якютю iнкубацiйних яець i технологiчними умовами !х шкубацл.
Р Р1
100 90 80 70 60 50 40
100
90
80
70
60
50 40
>.7 N
ДЧ N
••••
-2 4 10 16 22 28 34 40 46 52 58 64
-2 4 10 16 22 28 34 40 46 52 58 64
Вт, доба Вт, доба
а) - уС дослгджет показники б) - ус показники, за выключениям НЖКI лгпгдгв Р2 Р3
100
90
80
70
60
50 40
100 90 80 70 60
50
40
1 *•• 'V,
>д ч
"у
-2 4 10 16 22 28 34 40 46 52 58 64 Вт, доба
-2 4 10 16 22 28 34 40 46 52 58 64 Вт, доба
в)- усг,о кргм НЖК, лгпгдгв, вт. А г в-каротину г)- усг, окргм НЖК, лгпгдгв, вт. А, Ег в-каротину
Рис. 1. Динамша вщносно! кшькост парних кореляцшних зв'язюв дослщжених показниюв печшки: ™ ™- за даними експерименту; ^^^^ -лшшна апроксимацiя; ■ ■ ■ ■ ■ ■ - кубiчна апроксимащя.
У цей перiод спостерiгаеться значна дезоргашзащя системи АОЗ: протягом перших 7 дiб життя гусенят рiвень вiрогiдно iснуючих кореляцiйних зв'язкiв показниюв проантиоксидантно! рiвноваги знизився до 66,7%. Проте з другого тижня життя в печшщ гусенят узгоджешсть функцюнування цих
63
показниюв швидко вщновлюеться i досягае максимального рiвня у 14-добовому вiцi (93,6%).
Другий етап, зумовлений фiзiологiчною напругою, що спричинена формуванням спочатку контурного, а потiм ювенального тр'я. Розвиток пташенят у цей перюд значною мiрою залежить вiд технолопчних умов !х утримання. На тлi напольно! технологи i збалансованого за основними показниками ращону рiвень узгодженост компонентiв системи АОЗ гусенят цього дослщу знизився до 53,8% в 28-добовому вiцi i аж до 47,4% наприюнщ дослiду.
Цiкавим е те, що динамша кореляцiйних зв'язюв достатньо стiйка i характер 11 залишаеться незмiнним за вилученням одного чи декшькох дослiджених показникiв (рис. 1, а-г; табл.).
Таблиця
Р1вень узгодженост динамики корреляцшних звязкчв _бш\11Уични\ показникш залежно вщ 1х кшькост_
Р (а) Р1 (б) Р2(в) Р3 (г) Р4
Р(а) 1,000 0,924** 0,772** 0,712* 0,791**
Р1 (б) 0,924** 1,000 0,864** 0,807** 0,783**
Р2(в) 0,772** 0,864** 1,000 0,980** 0,940**
Р3 (г) 0,712* 0,807** 0,980** 1,000 0,954**
Р4 0,791** 0,783** 0,940** 0,954** 1,000
* - кореляцш суттева на 0,05 р1внц **- кореляцш суттева на 0,01 р1вш.
Цей факт можна прослiдкувати послщовним вилученням iз загально! таблицi кореляцшних зв'язкiв дослiджених показникiв ненасиченостi ЖК, вмiсту лiпiдiв, вiтамiнiв А, Е i Р-каротину. Навiть за наявност тiльки вмiсту лiпiдiв, ТБКАПл;п i активностi АО ферментiв чiтко прослщковуеться характер змiн кореляцiйних зв'язкiв за умови змщення рiвноваги ПОЛ-^АОА (Рис. 2), що визначае доцшьшсть використання ще! вибiрки i е достатшм для визначення перiодiв дестабшзацп системи АОЗ. Тому саме таку оптимальну модель нами використано у кореляцшному аналiзi тканин iнших органiв.
£9
с? Ъ
.о
сз
.о Ц
со
I
о
0
1
со
Вiк, доба
Рис. 2. Динамжа вщносно! кшькост парних кореляцiйних зв'язкiв для мшмально! сукупностi дослiджених показникiв (ТБКАП, лшщи i АО ферменти).
64
Зaгaльний aнaлiз узгодженост покaзникiв, що визнaчaють стaн piвновaги ПОЛ-^АОА в ткнитах мозку свiдчить, що у обох вщд^х мозку нaпpикiнцi ембрюгенезу iснye високий piвень коpеляцiйноï зaлежностi дослiджених покaзникiв, a сaме 78,5% вщ зaгaльноï кiлькостi можливих трних зв'язкiв для
В i к , доба В i к, доба
а б
Рис. 3. Дитам^ вщноснох' кшькост пapних кореляцшних зв'язюв дослiджених покaзникiв ВМ (а) i РМ (б).
Перехщ до постнaтaльного iснyвaння як у ВМ, тaк i РМ супроводжуеться piзким пaдiнням yзгодженостi змiн покaзникiв пpо-aнтиоксидaнтноï piвновaги. 3a двa тижнi з 28 доби ембрюгенезу до 14 доби постнaтaльного перюду piвень кореляцшних зв'язюв скорочуеться в обох вiддiлaх мозку: у ВМ нa 32,1%, a у РМ — 21,5%. Адже piвень дезоpгaнiзaцiï покaзникiв пpо-aнтиоксидaнтноï piвновaги пiд чaс постнaтaльноï aAamauii' у ткaнинaх ВМ бiльший. У таступш 2 тижнi з 14 до 28 доби у ВМ спостер^еться пщвищення piвня коpеляцiйноï yзгодженостi та 10,7%. В подaльшомy дестaбiлiзaцiя piвновaги ПОЛ-^АОА у ВМ спостеpiгaeться спочaткy 5 тижня (що призводить до скорочення вipогiдних коpеляцiйних зв'язкiв та 7,1%) i, у ще бшьшому стyпенi, 7 тижня (нa 14,2%).
У РМ юльюсть вipогiдно юнуючих коpеляцiйних зв'язкiв протягом 3 тижня зaлишaeться нa piвнi попереднього зтачення, дaлi поступово знижуеться 4 i 5 тижня, стaбiлiзyeться 6 i raaAae до мiнiмaльноï кiлькостi 7 тижня. Остaннi 2 тижнi експерименту хapaктеpизyються вiдновленням yзгодженостi покaзникiв пpо-aнтиоксидaнтноï piвновaги.
Тaким чином, в обох вадд^х мозку постнaтaльнa aдaптaцiя призводить до пaдiння piвня yзгодженостi дослщжених покaзникiв пpо-aнтиоксидaнтноï piвновaги, aле у ВМ зниження piвня yзгодженостi бшьше. Ткaниннa специфiчнiсть фyнкцiонyвaння системи АОЗ i переб^ пpоцесiв ПОЛ у вiддiлaх мозку проявляеться ще i в тому, що РМ е бшьш чутливим нa почaткових стaдiях фоpмyвaння контурного пip'я. Ткaнини ж ВМ зaзнaють знaчноï дестaбiлiзaцiï piвновaги ПОЛ^АОА лише пiд чaс ювенaльного
65
линяння. Проте, у обох вщдшах мозку основне зменшення юлькост кореляцшних зв'язкiв спостерiгаeться саме на тлi постнатально! адаптаци.
За динамiкою загально! кiлькостi парних кореляцiйних зв'язкiв дослщжених показниюв у скелетних м'язах (СМ) (рис. 4) видшяеться перiод переходу до постнатального iснування (до 7-добового вiку гусенят), протягом якого рiвень узгодженостi показникiв проантиоксидантно! рiвноваги скоротився на 21,5% i завершився стабшзащею цих зв'язкiв другого тижня. Початок формування контурного пiр'я на третьому тижнi майже не вплинув на узгоджешсть динамiки цих показникiв. З 21 доби в тканинах СМ спостер^алось штенсивне вiдновлення узгодженостi змш показникiв про-антиоксидантно! рiвноваги, вiдносна юльюсть кореляцiйних зв'язкiв перевищила вiдповiдний вихщний показник i у 35-добових гусенят досягла максимального значення. I тшьки формування ювенального пiр'я протягом шостого - сьомого тижнiв призвело до рiзкого падiння узгодженостi дослiджених показниюв: юльюсть кореляцiйних зв'язкiв зменшилась на 39,3% i досягла мiнiмального рiвня. З 49 до 56 доби спостер^аеться вiдновлення узгодженостi показникiв рiвноваги ПОЛ^АОА до 71,4% i на цьому рiвнi залишаеться до юнця експерименту.
о о
.1 401 I I I I I I I I I
т -2 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63
В i к, доба
Рис. 4. Динамжа вщносно! кiлькостi кореляцiйних зв'язкiв дослщжених показниюв у СМ.
Якщо перюди напруги проантиоксидантно! рiвноваги визначати за рiвнем узгодженостi показникiв ще! рiвноваги, то в тканинах СМ перюдами напруги е початок постнатального перюду (перший тиждень) i формування ювенального тр'я (шостий - сьомий тижш).
Порiвняння динамiки кореляцiйних зв'язкiв дослщжених бiохiмiчних показникiв окремих тканин свщчить, що !й притамана певна тканинна специфiчнiсть.Так, фiзiологiчна напруга, пов'язана з формуванням контурного тр'я, в першу чергу позначаеться на рiвнi кореляцшних зв'язюв печiнки i СМ, а в останню - мозку. Найбшьше ж падiння узгодженостi функцiонування системи АОЗ (у ВМ i РМ) в цей перюд спостерiгаеться п'ятого тижня. Початок формування ювенального тр'я ратше позначаеться розбалансуванням показникiв рiвноваги ПОЛ^АОА печiнки i СМ, а в останню чергу — ВМ.
66
Висновки. Ппотезу вщносно того, що стан про-антиоксидантно! рiвноваги визначаеться piB^M узгодженостi компонентiв системи АОЗ тдтверджено за допомогою математично! моделi, в основу яко! покладено динамiку кшькост парних коpеляцiйних зв'язкiв. Доведено, що стан про-антиоксидантно! piвноваги i фiзiологiчний стан оpганiзму птицi у цшому визначае piвень цiе!' узгодженостг I навпаки, за piвнем узгодженост окремих показникiв проантиоксидантно! piвноваги можна з'ясувати стан ще! piвноваги.
Лггература
1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. // Биохимия - 2005.- 70. - №2. - с. 246 - 264.
2. Skulachev, V.P. (1996) Q. Rev. Biophys., 29, 169-202.
3. Барабой В.А. Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии. К.: Наук. думка. - 1997. с. 419.
4. Сахацький MI., 1вко I.I., 1онов I.A. та in Довщник птаявника Харюв.: 2001. 160 с.
5. Bligh E.G., Dyer W.I. // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. 37. p. 911-917.
6. Palmer F.B. St. C. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. 231. N1 p.134-144.
7. Владимиров Ю. А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252с.
8. Антонов Б.И., Яковлева Т.Ф., Деряби на В.И. Лабораторные исследования в ветеренарии: биохимические и микробиологические. - М.: Агрпромиздат. 1991. -278с.
9. Данченко О.О., Калитка В.В., Особливосп антиоксидантного гомеостазу печiнки гусей в ранньому постнатальному онтогенезi. // Укр. бiохiм. журн., - 2002. -74, №2. - С.69-72.
10. Данченко О.О., Калитка В.В., Мехашзми формування системи антиоксидантного захисту в гусей в ембpiогенезi та ранньому постнатальному перюдг // Укр. бюхш. журн., - 2002. - 74, №4. - С.120-124.
11. Данченко О.О., Калитка В.В., Колесник Д.М., Онтогенетичш особливосп змш жирнокислотного складу лiпiдiв печiнки гусей як головного субстрату пероксидаци // Укр. б^м. журн., - 2003. - 75, №3. - С.124-129.
12. Здоровцева Л.М., Тарасикова О.Г., Кушцина Г.А., Рубан Т.В., Формування антиоксидантного статусу мозку гусей в онтогенезi // Питання бiоiндикацi! та екологн. - Запоpiжжя: 2003. - вип.8, №1. - С. 94-103.
Summary
As the assessment of a state of system of antioxidatic protection (AOP) is surveyed level of a coordination of indexes of this system. A coordination of components of system AOP estimated by quantity of twin correlation communications. A fraction of communications defined by means of computer program SPSS. Have found out a coordination of changes of these indexes throughout second half of embryogenesis and in the beginning of the postnatal periods in tissues of gooses against changes of a physiological state of a poultry. It is proved, that for definition of the periods destabilizations of system of antioxidatic protection and an assessment of the antioxidatic status sample from TBA-active products and antioxidatic ferments is sufficient.
Стаття надшшла до редакцИ 24.07.2008
67
