CC BY
16ДИАГНОСТИКА
JSfeBQ
Оценочные испытания иммуноферментной тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab»
Т. Ю. Трохимчук, научный сотрудник лаборатории иммунохимии; Л. А. Ганова, к.б.н., зав. лабораторией иммунохимии; Н. В. Иванская, д.м.н., научный сотрудник лаборатории иммунохимии; Ю. И. Горлов, директор по качеству; С. В. Михалап, к.б.н., директор по науке; ЧАО «<НПК «Диапроф-Мед», г. Киев
В. А. Шевчук, научный сотрудник отдела интерферона и других иммуномодуляторов, Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного, НАН Украины, г. Киев И. А. Шепелин, генеральный директор; К. А. Шепелин, директор по развитию; ООО «Эпидбиомед-диагностика», г. Москва
Я верю, что когда-нибудь мы будем жить в «нулевом» обществе: «ноль» — новых случаев ВИЧ-инфекции; «ноль» — дискриминации; «ноль» — смертей, обусловленных СПИДом.
Исполнительный директор ЮНЭЙДС М. Сидибе, из письма к партнерам, 2011 год
В мае 2011 года на 64-й сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения государства-члены ВОЗ приняли «Глобальную стратегию сектора здравоохранения по ВИЧ/ СПИДу на 2011—2015 годы», призванную к 2015 году остановить распространение ВИЧ/СПИД и положить начало тенденции к сокращению заболеваемости. Одной из стратегических директив, которыми ВОЗ и страны будут руководствоваться в своей деятельности в ближайшие пять лет, является оптимизация результатов профилактики, диагностики, лечения и ухода при ВИЧ-инфекции. Среди мер по предотвращению распространения ВИЧ-инфекции особое внимание уделяется улучшению качества средств диагностики ВИЧ/СПИД.
Проблема ранней диагностики ВИЧ-инфекции остается актуальной и может быть решена внедрением в лабораторную практику высокочувствительных диагностических имму-ноферментных тест-систем 4-го поколения. Преимуществом данного комбинированного анализа является возможность одновременного определения в сыворотке или плазме крови антигена р24 ВИЧ-1 и суммарных ВИЧ-1/2-специфических антител, что позволяет сократить период диагностического окна и выявлять ВИЧ-инфекцию на ранних сроках.
Разработанная на предприятии Частное акционерное общество «Научно-производственная компания "Диапроф-Мед"» тест-система 4-го поколения для диагностики ВИЧ-инфекции сконструирована в «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с двухэтапным внесением конъюгатов и введением мощной системы биотин-стрептавидинового усиления специфического сигнала. Значительное увеличение чувствительности анализа достигнуто применением в составе конъюгатов, выявляющих иммунные комплексы, смеси биотинилированных коротких рекомбинантных и синтетических аналогов вирусных антигенов, а также биотини-лированных высокоаффинных моноклональных антител, распознающих антиген р24 ВИЧ-1.
В настоящей работе с использованием международного стандарта антигена р24 ВИЧ-1 и коммерческих панелей сывороток исследованы качественные характеристики и диагностические показатели данной тест-системы.
Материалы и методы
Иммуноферментный анализ
Тест-система иммуноферментная 4-го поколения «0!А-Н!У-Ад/АЬ».
В составе иммуносорбента тест-системы использованы рекомбинантные антигены Env-1 ВИЧ-1 и Env-2 ВИЧ-2, а также моноклональные антитела (МКАТ), распознающие антиген р24 ВИЧ-1. Конъюгат №1 состоит из смеси биоти-нилированных конъюгатов на основе МКАТ, распознающих антиген р24 ВИЧ-1, и аналогов вирусных антигенов Env-1 и Env-2. При внесении в лунки планшета образцов ВИЧ-инфицированной крови и конъюгата №1 антиген р24 ВИЧ-1 связывается с МКАТ в составе иммуносорбента и биотинилированного конъюгата. Специфические антитела взаимодействуют одновременно с антигенами Env-1 и Env-2 в составе иммуносорбента и биотинилированно-го конъюгата. Образовавшиеся комплексы выявляются конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Специфические антитела, не связавшиеся с биотинилированным конъюгатом, выявляются пероксидазными конъюгатами антигенов Env-1 и Env-2 в составе конъюгата №2 (для предотвращения «хук-эффекта»). После отмывания несвязанных компонентов в лунки добавляют раствор проявителя. Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент. Учет результатов проводят на спектрофотометре в двуволновом режиме при длине волны 450/620 нм. Панели, стандарты, образцы сывороток Аналитическую чувствительность тест-системы на антиген р24 ВИЧ-1 определяли с использованием 1-го Международного стандарта ВОЗ HIV p24 (NIBSC code 90/636).
Способность тест-системы диагностировать раннюю ВИЧ-инфекцию исследовали на 9 сероконверсионных панелях сывороток: HIV6240, HIV6243, HIV6247, HIV6248, HIV9012, HIV9017, HIV12007 (ZeptoMetrix Corp., США) и PRB 965, PRB 966 (SeraCare Life Sciences, США).
Таблица 1
Результаты определения аналитической чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» по выявлению антигенар24 ВИЧ-1
Концентрация Результаты ИФА в трех дублях (ОП/cut off)
р24 ВИЧ-1 (NIBSC) МЕ/мл 1 2 3
25,00 18,64 18,21 18,42
12,50 10,64 10,90 10,77
6,25 6,03 6,15 6,09
3,25 3,35 3,21 3,28
1,56 1,88 1,82 1,85
0,78 1,07 1,29 1,18
0,39 0,64 0,64 0,64
0,19 0,46 0,63 0,55
0,09 0,48 0,46 0,47
0,04 0,33 0,33 0,33
Отрицательная сыворотка для разведения стандарта 0,24 0,25 0,25
www.akvarel2002.ru №2 (33) • 2013
■dim j
ДИАГНОСТИКА
Таблица 2
Результаты тестирования сероконверсионных панелей сывороток производства ZeptoMetrix в тест-системе «DIA-HIV-Ag/Ab»
Тест-системы
Название панели (№ образцов) Срок забора крови (дни) Genetic Sistems HIV-1 Ag EIA Тест-система сравнения HIV Ag/Ab DIA-HIV Ag/Ab Иммуноблот
Результат анализа
HIV6240 (1-6) 0—16 отр отр отр отр
HIV6240 (7) 21 + отр отр отр
HIV6240 (8-9) 23—28 + + + отр
HIV6240 (10-12) 30—45 + + + ± gp41
HIV6240 (13) 53 отр + + p24, p17, р55, gp120,
HIV6243 (1-6) 0—20 отр отр отр отр
HIV6243 (7-8) 25—28 + + + отр
HIV6243 (9-10) 33—35 + + + ± gp41
HIV6247 (1-7) 0—16 отр отр отр отр
HIV6247 (8-10) 23—30 + + + отр
HIV6248 (1-5) 0—14 отр отр отр отр
HIV6248 (6-7) 18—25 + + + отр
HIV9018 (1-7) 0—21 отр отр отр отр
HIV9018 (8) 25 + отр отр отр
HIV9018 (9-10) 28—32 + + + отр
HIV9018 (11) 35 + + + ± gp41
HIV9017 (1-3) 0—54 отр отр отр отр
HIV9017 (4-5) 117—119 + + + отр
HIV9017 (6-9) 124—133 + + + + gp41, p24/p26
HIV12007 (1-3) 0—54 отр отр отр отр
HIV12007 (4-5) 117—119 + + + отр
Таблица 3
Результаты тестирования сероконверсионных панелей сывороток производства SeraCare Life Sciences в тест-системе «DIA-HIV-Ag/Ab»
Тест-системы
Название панели (№ образцов) Срок забора крови (дни) Genetic Sistems HIV-1 Ag EIA Тест-система сравнения HIV Ag/Ab DIA-HIV Ag/Ab Иммуноблот
Результат анализа
PRB 965 (1) 0 отр отр отр отр
PRB 965 (2-3) 5—7 + + + отр
PRB 965 (4-5) 12—14 + + + ± gp160
PRB 965 (6) 21 отр + + ± gp160
PRB 966 (1-7) 0—37 отр отр отр отр
PRB 966 (8-10) 44—51 + + + отр
Диагностическую эффективность тест-системы определяли при тестировании 72 сывороток крови ВИЧ-инфицированных, содержащих специфические антитела в различных концентрациях, из них 32 образца с антителами к ВИЧ-1 и 41 - к ВИЧ-2.
Результаты и обсуждение
Исследование параметра чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 проводили с использованием 1-го Международного стандарта ВОЗ HIV p24 (NIBSC), последовательно разведенного, согласно прилагаемой инструкции, отрицательной сывороткой от 25 до 0,04 МЕ/мл. По результатам тестирования данных образцов в трех повторах (табл. 1), порог чувствительности тест-системы по антигену р24 ВИЧ-1 составил 0,78 МЕ/мл.
Определение способности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» выявлять раннюю ВИЧ-инфекцию проводили с использованием 9 сероконверсионных панелей сывороток. Каждая панель сывороток состояла из образцов от ВИЧ-инфицированного пациента, отобранных в различные сроки и исследованных с использованием коммерческих диагно-стикумов: ИФА-тест для определения антигена р24 ВИЧ-1, иммуноблот и иммуноферментная тест-система 4-го поколения с СЕ-маркировкой (тест-система сравнения). Результаты проведенных испытаний тест-системы на 7 панелях сывороток производства ZeptoMetrix представлены в таблице 2.
Согласно паспортным данным к панели HIV 6240, образцы №№7—12 (21—45 день от первой донации крови) содержат антиген р24 ВИЧ-1, в образце №13 он уже не выявляется, иммуноблот диагностирует антитела с 10-го образца. Тест-система «DIA-HIV-Ag/Ab» и ее коммерческий аналог определяют положительными все сыворотки, начиная с 8-го образца (23 день от первого забора крови у пациента). При тестировании панелей HIV6243, HIV6248, HIV9017, HIV12007 данные тест-системы 4-го поколения определяли положительными сыворотки с первого образца, в котором обнаружен антиген р24 ВИЧ-1. При тестировании панели HIV9018 указанные тест-системы определяли положительными образцы №№9—11 (28—35 день от первой дона-ции крови), в то время как тест-система, предназначенная только для выявления антигена р24 ВИЧ-1, выявила его на 3 дня раньше (в образце №7). В панели HIV6247 тест-система сравнения и «DIA-HIV-Ag/Ab» определяли положительными все сыворотки, начиная с образца №8.
Результаты тестирования 2 сероконверсионных панелей производства SeraCare Life Sciences представлены в таблице 3. Согласно полученным данным, тест-система «DIA-HIV-Ag/Ab», как и ее аналог 4-го поколения, выявляли положительные сыворотки одновременно с тест-системой, предназначенной для определения антигена р24 ВИЧ-1, и в более ранние сроки, чем иммуноблот.
Для определения параметра чувствительности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» протестированы сыворотки больных ВИЧ, которые содержали антитела к ВИЧ-1 (32 образца) и ВИЧ-2 (41 образец). Все сыворотки определены положительными с высокими значениями ОП/cut off (данные не представлены).
Таким образом, исследования диагностической способности тест-системы «DIA-HIV-Ag/Ab» показали, что она имеет высокий показатель чувствительности как по антигену р24 ВИЧ-1, так и специфическим антителам, что позволяет ей выявлять ВИЧ в ранние сроки на уровне лучших коммерческих аналогов, имеющих СЕ-маркировку.
По вопросам ифа-тест систем обращаться по тел. 8 (495) 7-999-000, Шепелин Константин Анатольевич
Ж
№2 (33) • 2013
www.akvarel2002.ru
