CC BY
1
Оригинальная статья
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Читать онлайн
Read online
Минаева Л.П., Евсюкова А.Д., Маркова Ю.М., Полянина А.С., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Чалый З.А., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А.
Оценка загрязнённости кофе, какао и какао-продуктов плесневыми грибами - потенциальными продуцентами микотоксинов
ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, Москва, Россия
Введение. Напитки и продукты на основе кофе и какао входят в число базовых продуктов потребительской корзины. В микофлоре сырья кофе и какао могут присутствовать микотоксигенные плесневые грибы тропических и субтропических регионов. Это обусловливает опасность загрязнения микотоксинами (МТ) готовой продукции и необходимость углублённого изучения потенциальных продуцентов МТ. Материалы и методы. Микробная контаминация образцов кофе, какао-бобов и какао-продуктов (Московский регион) изучалась культуральными методами. Токсинообразование моноспоровых изолятов плесневых грибов в условиях in vitro определяли в культуральном субстрате методом ультра высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (УВЭЖХ-МС/МС) в формате мультидетекции (18 МТ). Результаты. Все исследованные образцы характеризовались низкой микробной загрязнённостью. В поверхностной микофлоре доминировали виды Aspergillus секции Nigri. Изучена контаминация внутренней микофлоры зёрен зелёного кофе плесенями. Заражённость составляла 70—100%, преимущественно Aspergillus spp.; выделено 48 МСИ: 60% — виды Aspergillus секции Nigri, 12,5% — Aspergillus секции Flavi и 27% — Aspergillus spp. В условиях in vitro у 50% МСИ выявлено образование опасных МТ, максимальное количество достигало (мг/кг субстрата): фумонизин В2 — 24 (A. niger), охратоксин А — 518(Aspergillus секции Nigri), афлатоксин B1 — 27,9и афлатоксин — 1,44(A. flavus), стеригматоцистин — более 380(A. parasiticus). Ограничения исследования. В рамках исследования видовая принадлежность МСИ проведена микологическими методами без применения ПЦР-анализа. Это станет предметом дальнейших исследований.
Заключение. Показано доминирование Aspergillus spp. в поверхностной микофлоре готовой продукции и внутренней микофлоре необработанного сырья и высокие уровни образования опасных МТ штаммами Aspergillus spр. из зёрен зелёного кофе. Наличие потенциального риска загрязнения данных видов пищевой продукции МТ обусловливает необходимость мониторирования её контаминации плесенями — продуцентами МТ. Наличие токсигенной активности плесневых грибов из зелёного кофе показано в России впервые.
Ключевые слова: кофе; какао; плесневые грибы; Aspergillus spр.; продуценты микотоксинов; фумонизин В2; афлатоксины; охратоксин А; стеригматоцистин; эмерджентные микотоксины; УВЭЖХ-МС/МС
Соблюдение этических стандартов: исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов.
Для цитирования: Минаева Л.П., Евсюкова А.Д., Маркова Ю.М., Полянина А.С., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Чалый З.А., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Оценка загрязнённости кофе, какао и какао-продуктов плесневыми грибами — потенциальными продуцентами микотоксинов. Гигиена и санитария. 2022; 101(4): 418-424. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-4-418-424
Для корреспонденции: Минаева Людмила Павловна, канд. техн. наук, ст. науч. сотр. лаб. биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», 109240, Москва. E-mail: liuminaeva-ion@mail.ru
Участие авторов: Минаева Л.П. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка результатов токсинообразования и фенотипической идентификации плесневых грибов; написание текста, редактирование, ответственность за целостность всех частей статьи; Евсюкова А.Д. — сбор и обработка результатов фенотипической идентификации плесневых грибов; Маркова Ю.М., Полянина А.С., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Ефимочкина Н.Р. — сбор и обработка результатов микробиологических исследований; Чалый З.А. — сбор и обработка результатов УВЭЖХ-МС/МС исследований; Шевелева С.А. — согласование концепции исследования, редактирование. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.
Финансирование. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 18-16-00077-П) «Эмерджентные микотоксины в пищевых продуктах растительного происхождения: разработка методов анализа, изучение контаминации, видовая характеристика микромицетов-продуцентов, разработка гигиенических нормативов».
Поступила: 30.11.2021 / Принята к печати: 12.04.2022 / Опубликована: 30.04.2022
Lyudmila P. Minaeva, Alena D. Evsjukova, Yulia M. Markova, Anna S. Polyanina, Irina B. Bykova, Valentina V. Stetsenko, Zakhar A. Chalyy, Natalia R. Efimochkina, Svetlana A. Sheveleva
Assessment of contamination of coffee, cocoa and cocoa products, marketed in Russian, with mold fungi - potential producers of mycotoxins
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow, 109240, Russian Federation
Introduction. Beverages and products based on coffee and cocoa are included in the basic products in the consumer basket. The mycoflora of coffee and cocoa raw materials may contain mycotoxigenic molds from tropical and subtropical regions. This causes the hazard of contamination of finished products with mycotoxins (MT) and the need for in-depth study of potential MT producers.
Materials and methods. Microbial contamination of samples of coffee, cocoa beans and cocoa products (retail chain of the Moscow region) was studied by cultural methods. Toxin formation of single-spore isolates (SSI) of molds under in vitro conditions was determined in the culture substrate by the UHPLC-MS/MS method in the multidetection format (18 MT).
Results. All samples examined were characterized by low microbial contamination. The surface mycoflora was dominated by Aspergillus species of the section Nigri. The contamination of the internal microflora of green coffee beans with molds was studied. Infection was 70—100%, mainly Aspergillus spp.; 48 SSI were isolated: 60% — Aspergillus species of the Nigri section, 12.5% — Aspergillus of the Flavi section and 27% — Aspergillus spp. Under in vitro conditions, the formation of
Original article
dangerous MTs was detected in 50% of SSI, the maximum amount reached (mg/kg of substrate): fumonisin B2 — 24.0 (A.niger), ochratoxin A — 518.0 (Aspergillus section Nigri), aflatoxin B1 — 27.9 and aflatoxin B2 — 1.44 (A.flavus), sterigmatocystin — more than 380.0(A.parasiticus).
Limitations. Within the framework of the study, the species affiliation of MSIs was carried out by mycological methods without the use of PCR analysis, which will be the subject of further research.
Conclusion. Aspergillus spp. were shown to dominate in the surface mycoflora of finished food products and the internal mycoflora of unprocessed raw materials. There has been established the ability of strains of Aspergillus sp. from the internal microflora ofgreen coffee to the formation of high levels of hazardous MTs. The presence of potential risk of MT contamination of these types of food products necessitates monitoring their contamination with MT-producing molds. The presence of toxigenic activity in molds isolated from green coffee has been shown in Russia for the first time.
Keywords: coffee; cocoa; mold fungi; Aspergillus sp.; producers of mycotoxins; fumonisin B2; aflatoxins; ochratoxin A; sterigmatocystin; emergent mycotoxins; UHPLC-MS/MS
Compliance with ethical standards. The study does not require an opinion from a biomedical ethics committee or other documents.
For citation: Minaeva L.P., Evsjukova A.D., Markova Yu.M., Polyanina A.S., Bykova I.B., Stetsenko V.V., Chalyy Z.A., Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Assessment of contamination of coffee, cocoa and cocoa products marketed in Russian, with mold fungi — potential producers of mycotoxins. Gigiena i Sanitariya (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2022; 101(4): 418-424. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-4-418-424 (In Russian)
For correspondence: Luydmila P. Minaeva, PhD Technical Sciences, Senior researcher of the Laboratory of biosafety and nutrimicrobiome analysis, Federal Research Centre of Nutrition and Biotechnology, Moscow, 109240, Russian Federation. E-mail: liuminaeva-ion@mail.ru
Information about authors:
Minaeva L.P., https://orcid.org/0000-0003-1853-5735 Evsjukova A.D., https://orcid.org/0000-0001-6835-3644 Markova Yu.M., https://orcid.org/0000-0002-2766-7716 Bykova I.B., https://orcid.org/0000-0001-7288-312X Stetsenko V.V., https://orcid.org/0000-0001-6470-171X Chalyy Z.A., https://orcid.org/0000-0002-9371-8163 Efimochkina N.R., https://orcid.org/0000-0002-9071-0326 Sheveleva S.A., https://orcid.org/0000-0001-5 6 47-9709
Contribution: Minaeva L.P. — concept and design of the study, collection and processing of the results of toxin formation and phenotypic identification of molds, writing and editing of the manuscript, responsibility for the integrity of all parts of the article; Evsjukova A.D. — collection and processing of the results of phenotypic identification of molds; Markova Yu.M., Polyanina A.S., Bykova I.B., Stetsenko V.V., Efimochkina N.R. — collection and processing of material of microbiological studies; Chalyy Z.A. — collection and processing of material UHPLC-MS/MS research results; Sheveleva S.A. — agreement of the research concept, editing. All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgement. The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 18-16-00077-P) "Emergent mycotoxins in food products of plant origin: development of methods of analysis, study of contamination, species characteristics of micromycetes-producers, development of hygienic standards."
Received: November 30, 2021 / Accepted: April 12, 2022 / Published: April 30, 2022
Введение
Напитки и продукты на основе кофе и какао входят в состав ежедневных рационов большинства населения. Наряду с чаем кофе является одним из базовых продуктов потребительской корзины, какао в виде напитков и кондитерских изделий входит в рацион взрослого и детского населения. В последнее время в качестве заменителя какао и в производстве диетических безглютеновых продуктов используется порошок кэроб, получаемый из плодов рожкового дерева, — новый вид пищевого продукта на российском рынке и пока недостаточно изученный. Российская Федерация импортирует кофе, какао и какао-продукты как в виде сырья, так и в переработанном. Доля сырья для кофе (зелёный кофе) составляет около 85% от ввозимого объёма, для какао-продуктов (какао-бобы) — около 35% [1, 2], что обусловливает риски микробной контаминации на этапах транспортировки и хранения необработанного сырья.
В технологии производства кофе и какао наиболее важным с точки зрения безопасности является этап сушки и ферментации собранных плодов в естественных климатических условиях за счёт собственной микрофлоры, включающей в том числе плесневые грибы — потенциальные продуценты микотоксинов (МТ). К основным источниками афлатоксинов (АФЛ) в кофе относят виды Aspergillus секции Flavi (A. flavus, A. parasiticus), охраток-синов — виды A. ochraceus, A. westerdijkiae и A. steynii, а также виды Aspergillus секции Nigri, способные к образованию как фумонизина В2 (A. niger, A. welwitschiae), так и охратоксин А (ОТА) (A. carbonarius) [3]. При ферментации какао-бобов Penicillium citrinum и A. fumigatus являются основными видами, предопределяющими пейзаж грибковой экосистемы [4]. Чрезмерное развитие в микофлоре этих и других видов Penicillium зрр. и Aspergillus зрр. может приводить к накоплению афлатоксинов и охратоксина А в обработанных какао-бобах и их конечных продуктах, которые в процессе переработки остаются в обезжиренной твёрдой фракции какао (порошке) и становятся дополнительным источником ОТА и АФЛ в рационе [5].
Проблема контаминации кофе опасным ОТА побудила Научный комитет Европейской комиссии по пищевым продуктам провести оценку риска и признать необходимость контроля ОТА в такой продукции. Было отмечено, что кофе и какао входят в группу продуктов питания, являющихся основными источниками поступления ОТА в организм человека с пищей [6].
Для разработки надёжных подходов к снижению негативного воздействия МТ и эмерджентных микотоксинов (ЭМТ) на организм человека, включая обоснование гигиенических критериев безопасности, внедрение новых технологий защиты пищевой продукции от загрязнения и эффективный лабораторный контроль, необходимо углублённое изучение поражающих растительную продукцию плесеней, являющихся потенциальными продуцентами МТ, и их токсигенных свойств.
В связи с изложенным задачей настоящего исследования было изучение характера и уровней загрязнённости кофе, какао и кэроба потенциально токсигенными плесневыми грибами с определением видовой принадлежности выделенных штаммов и оценка способности продуцировать МТ и ЭМТ в модельных условиях.
Материалы и методы
Исследовано 56 образцов, полученных из розничной сети Московского региона: 32 образца кофе (20 - зелёный, 12 - обжаренный), 10 образцов какао (4 - какао-бобы сырые, 4 - обжаренные), 10 образцов какао-порошка, 2 образца какаосодержащих продуктов и 4 - кэроба. Происхождение образцов по регионам и странам представлено в табл. 1.
Микробиологический анализ. Микологический посев проводили по ГОСТ 10444.12-20131, количество мезофильных
1 ГОСТ 10444.12-2013. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчёта количества дрожжей и плесневых грибов [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200107308 (дата обращения: 16.09.2020 г.).
Оригинальная статья
Происхождение образцов Origin of samples
Таблица 1 / Table 1
Вид продукции Product type Регион, страна происхождения Region, country of origin -number of samples Число образцов Number of samples
Кофе зелёный (зерно) Green coffee (grain) Центральная Америка: Central America: Куба / Cuba 1
Гватемала / Guatemala 1
Гондурас / Honduras 1
Южная Америка: / South America:
Бразилия / Brazil 6
Колумбия / Colombia 2
Африка / Africa
Уганда / Uganda 2
Кения / Kenya 1
Эфиопия / Ethiopia 1
Юго-Восточная Азия:/South East Asia.
Индия / India 2
Танзания / Tanzania 1
Вьетнам / Vietnam 1
Лаос / Laos 1
Кофе обжаренный Roasted coffee Юго-Восточная Азия:/South East Asia: Индонезия / Indonesia Европа: / Europa: 2
Кипр / Cyprus 1
Нет данных / No data 9
Какао-бобы Африка: / Africa:
сырые Raw cocoa beans Кот-д'Ивуар / Cote d'lvoire Южная Америка: / South America: 1
Эквадор / Ecuador 1
Нет данных / No data 2
Какао-бобы обжаренные Roasted Юго-Восточная Азия:/South East Asia: Индонезия / Indonesia 1
cocoa beans Южная Америка: / South America:
Колумбия / Colombia 1
Нет данных / No data 4
Какао-порошок Cocoa powder Африка: / Africa: Гана / Ghana Юго-Восточная Азия:/South East Asia: 1
Индонезия / Indonesia 1
Нет данных / No data 8
Какаосодержащие продукты Cocoa products Нет данных No data 2
Кэроб Европа: / Europa:
Carob Испания / Spain 3
Нет данных / No data 1
аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15-942.
Фенотипическая идентификация грибных моноспоровых изолятов (МСИ) была проведена классическими микологическими методами в соответствии с рекомендациями Chen A.J. и соавт., Samson R.A. и соавт. [7, 8]. Культураль-ные свойства и макроморфологические характеристики определяли в процессе роста на диагностических питательных средах (CYA, CYAS, и CREA) при температуре 15; 24; 36 и 40 °С в соответствии с методиками Samson и соавт. и Diaz G.V. и соавт. [8, 9]. Микроморфологические характеристики (размер и форму конидий) оценивали при микро-скопировании. Таксономическую идентификацию проводили по фенотипическим характеристикам в соответствии с Samson и соавт. [8, 10], для морфологически схожих видов указывали принадлежность к секции видов.
Изучение внутренней микофлоры зелёного кофе проводили как при микологическом анализе зерна — посевом цельных зёрен на стерильную питательную среду [11]. Выросшие непосредственно из кофейных зёрен плесневые грибы отсевали, затем выполняли поэтапную расчистку до получения МСИ, используемых в дальнейших исследованиях.
Исследование токсинообразования в условиях in vitro проводили на модельных средах: картофельно-сахарозном агаре (KCA/PDA) и зерне риса с относительной влажностью 35% [10, 12]. Условия культивирования исследуемых продуцентов и последующую экстракцию МТ из субстратного мицелия осуществляли в соответствии с разработанной ранее методикой [13]. Стандартное отклонение для трёх повторностей (посевов на питательные среды) при анализе микотоксинов в экстрактах из субстратного мицелия составляло 7,4%, получено с использованием программного обеспечения Office Excel (Microsoft, США).
Определение 18 микотоксинов: AFL (афлатоксины B1, В2, G1 и G2), 3- и 15-ацетил дезоксиниваленол (3- и 15-AcDON), боверицин (BEA), дезоксиниваленол (DON), ОТА, стеригматоцистин (STC), T-2 токсин (Т-2), НТ-2 токсин (НТ-2), T-2 триол (Т-2 triol), фумонизины В1 и В2 (FB1, FB2), энниа-тины А, В (ENN A, B), микофеноловая кислота МФК (MFA) проводили методом УВЭЖХ-МС/МС в режиме мультиде-текции по разработанной ранее методике [14]. Для исключения влияния матрикса и получения ложноположительных результатов стандарты МТ разводили в экстрактах соответствующих питательных сред.
Результаты
Изучение микробной контаминации кофе, какао, какао-продуктов и кэроба. Согласно требованиям технического регламента «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011)3, в ЕАЭС в отношении плесневых грибов и общей микробной загрязнённости установлены следующие требования безопасности: для кофе количество плесеней — не более 500 КОЕ/г, КМАФАнМ не нормируется; для какао-порошка количество плесеней — не более 100 КОЕ/г, КМАФАнМ — не более 1 • 105 КОЕ/г; для какаосодержащих продуктов (по шоколаду с добавками) плесени — не более 100 КОЕ/г, КМАФАнМ - не более 5-104 КОЕ/г.
Результаты микробиологических исследований образцов, распределённые по уровням загрязнения, представлены в табл. 2. По содержанию плесневых грибов только в 2 образцах из 56 исследованных проб (3,6%) было выяв-
2 ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200022648 (дата обращения: 16.09.2020 г.).
3 ТР ТС 021/2011. О безопасности пищевой продукции: технический регламент Таможенного союза / утв. Решением Комиссии
Таможенного союза от 9 декабря 2011 года № 880 (с изменениями на 08.08.2019 г.). [Электронный ресурс]. КОДЕКС: электронный
фонд правовой и нормативно-технической документации. URL: https://docs.cntd.ru/document/902320560 (дата обращения: 07.11.2021).
Original article
Таблица 2 / Table 2
Распределение образцов кофе, какао, какао-продуктов и кэроба по уровням микробной загрязнённости Distribution of coffee, cocoa, cocoa products and carob samples by microbial contamination levels
Кофе / coffee Какао-бобы / Cocoa beans Какао порошок Cocoa powder n = 10 Какаосодержащие Кэроб Carob n = 4
Показатель, КОЕ/г Indicators, CFU/g зелёный Green n = 20 обжаренный Roasted n = 12 сырые Raw n = 4 обжаренные Roasted n = 6 продукты* Cocoa products* n = 2
Плесени / Mold
Норматив / Normalized value of the indicator < 500 - - - < 100 < 100 -
Среднее / Average 1.1 • 103 < 5 < 5 < 5 < 5 < 5 5
Диапазоны значений < 5 ... 2.1 • 104 < 5 ... 101 < 5 < 5 ... 4-101 < 5 ... 2.7 • 101 < 5 < 5 ... 10
Range of values
Уровень загрязнения Число образцов по уровням загрязнённости
Contamination levels Number of samples by contamination levels
< 5 6 10 4 5 9 2 2
5-100 11 2 0 1 1 0 2
> 100 ... 500 1 0 0 0 0 0 0
> 500 2 0 0 0 0 0 0
Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)
Total Mesophilic Aerobic end Facultative Anaerobic Microbial Count (TMAFaMC)
Норматив / Normalized value of the indicator - - - - 105 5 • 104 -
Среднее / Average 4.9 • 104 < 15 4.2 • 104 3.3 • 105 1.3-104 5.5 • 104 2.6 • 102
Диапазоны значений < 15 ... 9.1 • 105 < 15 ... 5 • 102 3.2 • 103 ... 1.5 • 105 < 15 ... 2-106 < 15 ... 1.3-105 < 15 ... 1.1 • 105 < 15 ... 7.2 • 102
Range of values
Уровень загрязнения Число образцов по уровням загрязнённости
Contamination levels Number of samples by contamination levels
< 15 5 11 0 3 4 1 1
15 ... 5 • 104 14 1 2 2 5 0 3
> 5 • 104 1 0 1 1 1 1 0
Пр и м е ч а н и е. * — для образцов какаосодержащей продукции (посыпка шоколадная и какао-бобы в шоколаде) показатель КМАФАнМ принят как для шоколада и шоколада с добавками.
Note. * - for samples of cocoa-containing products (chocolate sprinkles and cocoa beans in chocolate), the TMAFaMC indicator is applied, the same as for chocolate and chocolate with additives.
лено количество, превышающее установленный норматив: в зелёном кофе из Бразилии — 2,1 • 104 КОЕ/г и из Кении — 1,5 • 103 КОЕ/г. По показателю КМАФАнМ установленным нормативам не соответствовали: один образец какао-порошка (1,3 • 105 КОЕ/г) и один образец какаосодержащего продукта (какао-бобы в шоколаде - 1,1 • 105 КОЕ/г). В продуктах, для которых этот норматив не установлен, высокие уровни КМАФАнМ были выявлены в зелёном кофе из Уганды — 9,1 • 105 КОЕ/г, в сырых какао-бобах — 1,5 • 105 КОЕ/г и в обжаренных какао-бобах тёртых — 2 • 106 КОЕ/г (см. табл. 2). В 51 образце (91%) общая микробная загрязнённость не превышала 5 • 104 КОЕ/г.
Наибольшая частота обнаружения плесеней (55%) была в зелёном кофе — в 11 из 20 образцов на уровне от 5 до 100 КОЕ/г. Остальные виды продуктов были преимущественно чистыми, и лишь отдельные образцы имели такой же уровень загрязнённости.
Уровни бактериальной контаминации образцов характеризуют общее гигиеническое состояние производства и конечной продукции. По показателю КМАФАнМ в зелёном кофе также была выявлена наиболее высокая частота загрязнённости образцов — 70%, в 14 образцах содержалось от 15 до 5 • 104 КОЕ/г. Такой же уровень был выявлен в трёх из четырёх образцов кэроба, в пяти из десяти образов какао-порошка и в одном из двух образцов сырых какао-бобов. Пре-
вышение установленного норматива зафиксировано в одном образце какао-порошка и одном образце какаосодержащего продукта (какао-бобы в шоколаде).
Изучение внутренней микофлоры зелёного кофе. При исследовании внутренней микофлоры зелёного кофе оценивали количество поражённых зёрен и видовой состав плесневых грибов. Данные, представленные в табл. 3, показывают, что наибольшее число поражённых зёрен (100%) было в образцах из Центральной Америки, далее, в порядке убывания, следовали образцы из Африки — 90%, Южной Америки — 87,5% и Юго-Восточной Азии — 70%. В большинстве случаев внутренняя контаминация была обусловлена грибами рода Aspergillus, в отдельных образцах обнаруживались Penicillum, Mucor и Alternaria. Наибольшая частота обнаружения Aspergillus spp. была в образцах из Центральной Америки (96,7% зёрен) и Африки (95% зёрен).
Для дальнейших исследований из внутренней микофло-ры зёрен зелёного кофе были выделены 48 МСИ, относящиеся к наиболее представленному в образцах роду Aspergillus. По результатам фенотипической идентификации к секции Aspergillus Nigri были отнесены 29 штаммов (60,4%), к секции Aspergillus Flavi — 6 (12,5%). Для 13 (27%) штаммов рода Aspergillus зрр. видовая принадлежность не была окончательно установлена. Среди выделенных видов некоторые являются потенциальными продуцентами МТ и ЭМТ.
Оригинальная статья
Таблица 3 / Table 3
Загрязнённость кофейных зёрен внутренней микофлорой (средние значения) Contamination of coffee beans with internal microflora (average values)
Происхождение, число (n) образцов Origin, number (n) of samples Заражённые зёрна,% Infected grains, % Чистые зёрна, % Uninfected grains, % Видовой состав микофлоры, % Species composition of mycoflora, %
Aspergillus spp. Penicillium spp. Mucor spp. Alternaria spp. другие виды плесеней о^г types of mold
Южная Америка / South America n = 8 87.5 12.5 75 12.5 15 7.5 17.7
Центральная Америка / Central America n = 3 100 0 96.7 0.0 10.0 6.7 10
Африка / Africa n = 4 95 5 95 0 0.3 0 0
Юго-Восточная Азия / South East Asia n = 5 70.0 30.0 53.0 0.0 2.0 4.0 0.2
Таблица 4 / Table 4
Характеристики токсигенных грибов Aspergillus spр., выделенных из зелёных кофейных зёрен Characteristics of toxigenic molds of Aspergillus spр. isolated from green coffee beans
Число токсигенных
изолятов Видовой состав изолятов Происхождение Содержание МТ в питательных средах, мг/кг
Number Species composition of isolates Origin MT content in culture substrate, mg/kg
of toxigenic isolates
Центральная Америка/ Central America (n = 20)
4 Aspergillus section Nigri (A. niger)* Бразилия, Колумбия ФВ2 / Fumonisin 0.017-0.114
Brazil, Colombia
2 A. flavus Бразилия, Колумбия АФЛ В1 / Aflatoxin В1 11.9-14.1
Brazil, Colombia АФЛ В2 / Aflatoxin В2 0.15-0.67
СТЦ / Sterigmatocystin 0.01-0.66
2 Aspergillus section Nigri (A. carbonarius)* Колумбия / Colombia ОТА / Ochratoxin A 6.0 и (and) 145.4
Всего токсигенных изолятов по региону — 8 из 20 (40%) / Total toxigenic isolates by region 8 out of 20 (40%)
Южная Америка / South America (n = 10)
3 Aspergillus section Nigri (A. niger)* Куба, Гватемала, Гондурас ФВ2 / Fumonisin 0.11-2.52
Cuba, Guatemala, Honduras
1 A. flavus Гватемала / Guatemala АФЛ В1 / Aflatoxin В1 16.0
АФЛ В2 / Aflatoxin В2 0.20
СТЦ / Sterigmatocystin 0.66
1 A. parasiticus Куба / Cuba СТЦ / Sterigmatocystin 380.8
Всего токсигенных изолятов по региону — 5 из 10 (50%) / Total toxigenic isolates by region 5 out of 10 (50%)
Африка / Africa (n = 9)
5 Aspergillus section Nigri (A. niger)* Уганда, Эфиопия, Танзания ФВ2 / Fumonisin 0.13-24.1
Uganda, Ethiopia, Tanzania
2 Aspergillus section Nigri (A. carbonarius)* Танзания / Tanzania ОТА / Ochratoxin A 0.90 и (and) 518.0
Всего токсигенных изолятов по региону — 7 из 9 (77.8%) / Total toxigenic isolates by region 7 out of 9 (77.8%)
Юго-Восточная Азия / South East Asia (n = 9)
2 Aspergillus section Nigri (A. niger)* Вьетнам, Индия ФВ2 / Fumonisin 0.09 и (and) 2.30
Vietnam, India
1 A. flavus Вьетнам АФЛ В1 / Aflatoxin В1 27.9
Vietnam АФЛ В2 / Aflatoxin В2 1.44
СТЦ / Sterigmatocystin 0.01
1 A. parasiticus Индия / India СТЦ / Sterigmatocystin 2.14
Всего токсигенных изолятов по региону — 4 из 9 (44.4%) / Total toxigenic isolates by region 4 out of 9 (44.4%) Примечание. * — наиболее вероятный вид плесневого изолята. Note. * — most likely type of mold isolate.
Original article
Исследование токсигенных свойств плесневых грибов — контаминантов зелёного кофе. В условиях in vitro проведены исследования токсинообразующей активности 48 МСИ. Данные по числу токсигенных изолятов, видовому составу, происхождению и максимальным количествам МТ, накопленным в модельных средах, представлены в табл. 4. Наиболее высокие уровни токсинообразования отмечены на зерне риса — на субстрате с минимальной влажностью, что характерно для ксерофильных микромицетов, к которым относятся виды Aspergillus секций Nigri и Flavi [15]. У половины испытанных штаммов (24 из 48) выявлена способность к образованию как опасных, регламентируемых в пищевой продукции МТ, - АФЛ В1, АФЛ В2, ОТА, ФВ2, так и новых эмерджентных МТ, в частности, СТЦ.
Среди 29 изолятов Aspergillus секции Nigri большинство (14 штаммов) накапливали в субстрате ФВ2, 4 штамма — ОТА, 11 были нетоксигенными. Из изолятов секции Flavi 6 штаммов продуцировали АФЛ В1, АФЛ В2 и СТЦ. Продукция одновременно трёх МТ (АФЛ В1, АФЛ В2 и СТЦ) была характерна для всех четырёх штаммов A. flavus. Два штамма A. parasiticus продуцировали только СТЦ. Среди 13 штаммов других видов рода Aspergillus все были нетоксигенными.
По регионам происхождения наибольший процент ток-синопродуцирующих штаммов был выделен среди образцов кофе из Африки — 77,8%, далее в порядке уменьшения: в 50% образцов из Южной Америки, в 44,4% — из Юго-Восточной Азии, в 40% — из Центральной Америки.
Установлено, что отдельные изоляты при моделировании условий на питательных средах, оптимальных для токсино-образования у плесеней, способны к накоплению высоких и сверхвысоких количеств МТ, среди которых были обнаружены наиболее опасные и нормируемые в пищевой продукции. Так, штамм Aspergillus секции Nigri (A. niger) продуцировал ФВ2 на уровне 24 мг/кг, сопоставимом с продукцией этого МТ типичным продуцентом — Fusarium verticillioides; грибы Aspergillus секции Flavi синтезировали высокие и супервысокие уровни как одновременно нескольких видов опасных микотоксинов АФЛ B1 — 27,9 мг/кг и АФЛ B2 — 1,44 мг/кг в комплексе с эмерджентным СТЦ (A. flavus), так и только СТЦ на сверхвысоком уровне — более 380 мг/кг (A. parasiticus); выявлена способность штаммов Aspergillus секции Nigri продуцировать ОТА в количествах до 518 мг/кг.
Обсуждение
Анализ микробного загрязнения исследованных образцов кофе, какао, какао-продуктов и кэроба, среди которых 55,6% (32 из 56) представлены переработанными видами продукции, показал, что содержание плесеней в 94,6% образцов не превышало 100 КОЕ/г, а общая бактериальная загрязнённость в 91% не превышала 5 • 104 КОЕ/г. Видовой состав плесеней, определяющих поверхностную загрязнённость образцов, был представлен преимущественно видами Aspergillus секции Nigri, которые определяли максимальные уровни контаминации.
Изучение внутренней микофлоры образцов зелёного кофе, полученных из четырёх кофепроизводящих регионов (Южной и Центральной Америки, Африки и Юго-Восточной Азии), показало высокую степень поражённости зёрен плесневыми грибами, которая в зависимости от региона составляла от 70 до 100%. Во всех образцах преобладали грибы рода Aspergillus, в отдельных случаях обнаруживались Penicillum, Mucor и Alternaria. Видовая идентификация выделенных из зёрен кофе 48 МСИ, принадлежащих к аспергиллам секций Nigri и Flavi, показала наличие среди них потенциальных продуцентов МТ и ЭМТ.
Особую опасность представляют плесневые грибы внутренней микофлоры, так как содержание МТ в пищевых продуктах в большей мере обусловлено наличием токси-генных видов плесневых грибов, вегетирующих именно во внутренней части плодов растений (зёрен, ягод, семян) и использующих их в качестве субстрата. Поэтому выделение
плесневых грибов из внутренней микофлоры, определение их видовой принадлежности и токсигенных свойств даёт понимание источников происхождения МТ в данных видах продукта.
Исследование в условиях in vitro на модельных средах токсинобразующих свойств изолятов Aspergillus зрр., выделенных из внутренней микофлоры зёрен зелёного кофе, показало значительную долю (50%) штаммов, продуцирующих как опасные, регламентируемые в пищевой продукции МТ — АФЛ В1, АФЛ В2, ОТА, ФВ2, так и эмерджентные МТ, в частности, СТЦ. Стеригматоцистин является биогенным предшественником афлатоксинов и отнесён Международным агентством по изучению рака (МАИР) к классу 2В (возможный канцероген для человека) [16].
Фумонизин-продуцирующая активность видов Aspergillus секции Nigri была выявлена у штаммов, полученных из образцов кофе всех четырёх географических регионов, в то время как охратоксин-продуцирующая активность обнаруживалась только у штаммов из Центральной Америки и Африки. Впервые продукция фумонизинов была описана для изолятов A. niger, выделенных из образцов тайского кофе, при этом отмечалось, что для чёрных аспергиллов характерна продукция ФВ2 и ФВ4 в отличие от грибов рода Fusarium, продуцирующих также ФВ1, ФВ3 и др. [17]. При изучении микофлоры кофе на тайских плантациях было показано, что источником фумонизина В2 в кофе являлись Aspergillus niger («чёрные аспергиллы»), а не типичный продуцент фумони-зинов в зерновых — вид Fusarium verticillioides. Сообщается об обнаружении на кофейных зёрнах наряду с A. niger также видов A. carbonarius, A. sclerotiicarbonarius и A. foetidus [17]. В том же исследовании описана способность отдельных видов секции Nigri (A. carbonarius, A. westerdijkiae, A. steynii и A. sclerotiorum) к продукции ОТА, а отдельных штаммов вида A. niger — к одновременной продукции ФВ2 и ОТА. Отличительной особенностью вида A. carbonarius является способность к продукции высоких уровней ОТА у 98—100% штаммов [3].
В комплекс Aspergillus секции Nigri входят несколько морфологически неразличимых видов, имеющих при этом различные метаболитные профили, в частности, A. niger и A. carbonarius. В полученных в данном исследовании результатах 14 штаммов Aspergillus секции Nigri, продуцирующих ФВ2, на основании их хемотипа с высокой долей вероятности принадлежат к виду A. niger, а 4 штамма, продуцирующих ОТА, — к виду A. carbonarius, что подтверждается высоким уровнем продукции ОТА.
Выявлены 4 штамма A. flavus, продуцирующие одновременно АФЛ В1, В2 и СЦТ, а также 2 штамма A. parasiticus, производящих только СЦТ. Таким образом, фенотипи-ческая идентификация указанных изолятов согласуется с хемотипом [3]. Окончательная видовая принадлежность устанавливается по результатам ПЦР-анализа с видоспеци-фическими праймерами.
Знания о способности плесневых контаминантов к ток-синообразованию важны для разработки подходов к предотвращению загрязнения микотоксинами пищевой продукции в процессе её получения, переработки и хранения с учётом специфики поведения микофлоры. Также эти исследования позволили получить новые данные о метаболитных профилях конкретных видов грибов и их хемотипах, основанных на видоспецифичности токсинпродуцирующей способности, что даёт возможность создавать новые алгоритмы для таксономической идентификации микромицетов.
Заключение
В целом микробиологическое состояние большинства исследованных образцов кофе, какао, какао-продуктов и кэроба оценивается как удовлетворительное. В переработанной пищевой продукции несоответствия выявлены только в двух продуктах из 28 по общему микробному числу, в непереработанном сырье из 28 образцов только два образца зелёного кофе не соответствовали нормативу по количеству
Оригинальная статья
плесеней. При этом как в поверхностной микофлоре готовой продукции, так и во внутренней микофлоре необработанного сырья отмечена высокая частота встречаемости грибов рода Aspergillus.
Полученные в экспериментальных условиях данные демонстрируют высокий потенциал микотоксинообра-зования грибов рода Aspergillus — плесневых контаминан-тов кофейного сырья, способных в благоприятных условиях к накоплению высоких и сверхвысоких уровней нескольких опасных МТ (ОТА, АФЛ В1, ФВ2) а также ЭМТ (СТЦ). С учётом повсеместной распространённости видов Aspergillus секции Nigri это свидетельствует о наличии потенциального риска контаминации растительного сырья и пищевой продукции опасными МТ (ФВ2 и ОТА) и подтверждает, что создание надлежащих условий на всех этапах транспортировки и хранения данного вида сырья, а также вырабатываемых из него продуктов является необхо-
димой частью системы обеспечения безопасности и снижения риска возникновения пищевых микотоксикозов.
Обнаруженная у штаммов Aspergillus секции Nigri фумо-низин- и охратоксин-продуцирующая активность приобретает особую значимость с учётом широкого использования A. niger в биотехнологии в качестве важнейшего продуцента органических кислот и ферментных препаратов для пищевой промышленности.
Всё это подтверждает необходимость более глубокого изучения микофлоры этих видов пищевой продукции. Большое значение для прогнозной оценки риска имеет изучение токсигенных свойств грибных контаминантов в отношении расширенного спектра токсических метаболитов, включая ЭМТ.
Настоящим исследованием впервые в Российской Федерации доказано наличие токсигенной активности у плесневых грибов, выделенных из зелёного кофе.
Литература
(п.п. 3-10, 12, 15, 17 см. References)
Ипатова А.А. Обзор российского рынка кофе в 2017—2019 годах. Российский продовольственный рынок. 2020; (1). https://foodmarket.spb.ru/ Точиева Л. Импорт какао-продуктов и обзор производства шоколадных изделий. Апрель 2021. Российский продовольственный рынок. 2021; (4). https://foodmarket.spb.ru/
Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М., Новожилов К.В. Фуза-риоз зерновых культур. Защита и карантин растений. 2011; (S5):
69-120.
Минаева Л.П., Полянина А.С., Киселева М.Г., Чалый З.А., Ефимоч-кина Н.Р., Шевелева С.А. Изучение контаминации сухофруктов ток-
сигенными плесневыми грибами. Гигиена и санитария. 2021; 100(7): 717—23. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7 14. Чалый З.А., Киселева М.Г., Седова И.Б., Минаева Л.П., Шевелева С.А., Тутельян В.А. Изучение контаминации сухофруктов микотоксинами. Вопросы питания. 2021; 90(1): 33 — 9. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-33-39 16. Седова И.Б., Киселева М.Г., Захарова Л.П., Тутельян В.А. Токсиколо-го-гигиеническая характеристика микотоксина стеригматоцистина и методы его определения в пищевых продуктах. Гигиена и санитария. 2019; 98(1): 105—17. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2019-98-1-105-117
2
References
1. Ipatova A.A. Overview of the Russian coffee market in 2017—2019. Rossiyskiy prodovol'stvennyy rynok. 2020; (1). Available at: https://foodmarket.spb.ru/ (in Russian)
2. Tochieva L. Cocoa imports and chocolate production overview. Rossiyskiy prodovol'stvennyy rynok. 2021; (4). Available at: https://foodmarket.spb.ru/ (in Russian)
3. Moretti A., Susca A., eds. Mycotoxigenic Fungi: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, vol. 1542). New York: Springer; 2017.
4. Petyaev I.M., Bashmakov Y.K. Cocobiota: Implications for Human Health. J. Nutr. Metab. 2016; 2016: 7906927. https://doi.org/10.1155/2016/7906927
5. Copetti M.V., Iamanaka B.T., Pitt J.I., Taniwaki M.H. Fungi and mycotoxins in cocoa: from farm to chocolate. Int. J. Food Microbiol. 2014; 178: 13—20. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.023
6. Commission Regulation (EC) No 1881/2006. Commission Directive 2006/1881/EC of 19 December 2006, setting maximum levels for certain contaminants in food stuffs. Off. J. Eur. Commun. 2006; L364: 5—24.
7. Chen A.J., Hubka V., Frisvad J.C., Visagie C.M., Houbraken J., Meijer M., et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Aspergillus (formerly Eurotium), and its occurrence in indoor environments and food. Stud. Mycol 2017; 88: 37-135. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2017.07.001
8. Samson R.A., Noonim P., Meijer M., Houbraken J., Frisvad J.C., Varga J. Diagnostic tools to identify black aspergilli. Stud. Mycol. 2007; 59: 129-45. https://doi.org/10.3114/sim.2007.59.13
9. Diaz G.V., Coniglio R.O., Chungara C.I., Zapata P.D., Villalba L.L., Fonseca M.I. Aspergillus niger LBM 134 isolated from rotten wood and its potential cellulolytic ability. Mycol. 2020; 12(3): 160-73. https://doi.org/10.1080/21501203.2020.1823509
10. Samson R.A., Visagie C.M., Houbraken J., Hong S.B., Hubka V., Klaassen C.H., et al. Phylogeny, identification and nomenclature
of the genus Aspergillus. Stud. Mycol 2014; 78: 141-73. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2014.07.004
11. Gagkaeva T.Yu., Gavrilova O.P., Levitin M.M., Novozhilov K.V. Fusariosis of grain crops. Supplement to the Journal. Zashchita i karantin rasteniy. 2011; (5). (in Russian)
12. Han X., Jiang H., Xu J., Zhang J., Li F. Dynamic fumonisin B2 production by Aspergillus niger intented used in food industry in China. Toxins (Basel). 2017; 9(7): 217. https://doi.org/10.3390/toxins9070217
13. Minaeva L.P., Polyanina A.S., Kiseleva M.G., Chalyy Z.A., Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Dried fruits marketed in Russian: toxigenic mold contamination. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2021; 100(7): 717-23. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2021-100-7-717-723 (In Russian)
14. Chalyy Z.A., Kiseleva M.G., Sedova I.B., Minaeva L.P., Sheveleva S.A., Tutelyan V.A. Dried fruits marketed in Russia: multi-mycotoxin contamination. Voprosy pitaniya. 2021; 90(1): 33-9. https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-1-33-39 (in Russian)
15. Rico-Munoz E., Samson R.A., Houbraken J. Mould spoilage of foods and beverages: Using the right methodology. Food Microbiol. 2019; 81: 51-62. https://doi.org/10.1016Zj.fm.2018.03.016
16. Sedova I.B., Kiseleva M.G., Zakharova L.P., Tutel'yan V.A. Toxicological and hygienic characteristics of mycotoxin sterigmatocystin and methods for its determination in food products. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2019; 98(1): 105-17. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2019-98-1-105-117 (in Russian)
17. Noonim P., Mahakarnchanakulb W., Nielsen K.F., Frisvad J., Samson R.A. Fumonisin B2 production by Aspergillus niger from Thai coffee beans. Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control. Expo. Risk. Assess. 2009; 26(1): 94-100. https://doi.org/10.1080/02652030802366090
