CC BY
1
3. Святогорова А. Е. Изучение параметров безопасности амидов жирных кислот на аквариумных рыбах / А. Е. Святогорова, Л. Н. Фетисов // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. - 2023. - Т. 12, № 1. - С. 143-146.
4. Святогорова А. Е. Протистоцидная активность амидов жирных кислот и известных антипротозойных препаратов / А. Е. Святогорова, Л. Н. Фетисов, А. А. Зубенко // Ветеринария Северного Кавказа. - 2023. - № 8. - С. 7782.
5. Святогорова А. Е. Токсичность амидов жирных кислот для аквариумных рыб / А. Е. Святогорова, Л. Н. Фетисов, А. А. Зубенко // Актуальные вопросы развития отраслей сельского хозяйства: теория и практика : Материалы V Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых АПК, п. Рас-
свет, 18-19 мая 2023 года. - п. Рассвет: Общество с ограниченной ответственностью «АзовПринт», 2023. - С. 229-232.
6. Скрининг новых антипротозойных средств - определение терапевтической эффективности при эймериозах / А. И. Клименко, В. В. Чекрышева, А. А. Зубенко [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2022. - № 4. - С. 24-27.
7. Чекрышева В. В. Токсичность катионо-активного соединения амида миристиновой кислоты для аквариумных рыб /В. В. Чекрышева, Л. Н. Фетисов, А. Е. Святогорова [и др.] // Известия Нижневолжского агроуниверси-тетского комплекса: Наука и высшее профессиональное образование. - 2021. - № 3 (63). -С. 254-262.
8.И:±р8://еп.'шк1реШа.о^^1к1/Ап::1рго:^оа
1
DOI: 10.48612/sbornik-2024-1-72 УДК 619:57.021:615.065:636.028
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ЛЯМБДА НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ IN VIVO
Хохлова Нина Алексеевна, канд. вет. наук Шабанов Дмитрий Игоревич Востроилова Галина Анатольевна, д-р. биол. наук Сыромятников Михаил Юрьевич, канд. биол. наук Стрельников Николай Алексеевич
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии, г. Воронеж, Российская Федерация
Нами было исследовано влияние препарата рекомбинантного интерферона лямбда (ИФН-А) на цитогенетическую стабильность костного мозга и количество повреждений мито-хондриальной ДНК (мтДНК) здоровых мышей и животных с индуцированным митомицином С свободнорадикальным стрессом. Мутагенное действие исследуемых веществ определяли с помощью микроядерного теста в клетках костного мозга. Повреждение мтДНК детектировали с помощью количественной полимеразой цепной реакции (q-PCR). В результате экспериментов установлено отсутствие мутагенного и токсического действия ИФН-А по отношению к клеткам костного мозга, а также сохранение целостности мтДНК клеток печени исследуемых мышей. В условиях индуцированного митомицином С свободнорадикального стресса в клетках печени мышей отмечена тенденция к снижению количества повреждений мтДНК на 13,86 и 32,7% в участках мтДНК, кодирующих 12S и 16S рРНК и ген ND5, соответственно, при курсовом применении ИФН-А, относительно количества повреждений мтДНК у животных после введения только митомицина С (10 мг/кг). Эти данные могут являться косвенным свидетельством анти-оксидантного и антиокислительного действия ИФН-А.
Ключевые слова: рекомбинантный интерферон лямбда; митомицин C; митохондриаль-ная ДНК; количественная ПЦР (qPCR); лабораторные мыши
EVALUATION OF THE EFFECT OF RECOMBINANT INTERFERON LAMBDA DRUG ON CYTOGENETIC STABILITY IN VIVO
Khokhlova Nina Alekseevna, PhD Vet. Sci. Shabanov Dmitriy Igorevich Vostroilova Galina Anatolyevna, Dr. Biol. Sci. Syromyatnikov Mikhail Yurievich, PhD Biol. Sci. Strelnikov Nikolai Alekseevich
All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy, Voronezh, Russian Federation
We investigated the impact of the recombinant interferon of lambda drug (IFN-A) on cytogenetic stability in the bone marrow and mitochondrial DNA (mtDNA) damage in healthy mice and those with induced mitomycin and free radical stress. Using a micronucleus test on bone marrow cells, we determined the mutagenic effects of the substances under study. The mtDNA damage was identified by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). As a result of our experiments, we found that IFN-A did not have any mutagenic or toxic effects on bone marrow cells, nor did it cause any damage to the mtDNA in the liver cells of these mice. Under conditions of oxidative stress induced by the use of mitomycin C on mouse liver cells, the amount of mitochondrial DNA (mtDNA) damage was found to decrease by 13.86% and 32.7%, respectively, at mtDNA sites that encode 12S ribosomal RNA and 16S ribosomal RNA as well as the ND5 protein gene. This decrease was observed after the administration of interferon lambda (IFN-A) in addition to mitomycin C (10 mg/kg), relative to animals that were administered mitomycin C alone. These data provide indirect evidence for the antioxidant and anti-oxidative effects of IFN-A in mitomycin C-treated mice.
Key words: recombinant interferon of lambda; mitomycin C; mitochondrial DNA; quantitative polymerase chain reaction (qPCR); laboratory mice
Важным явлением при клеточном дыхании является образование активных форм кислорода (АФК), обладающих широким спектром физиологического и патофизиологического действия. В настоящее время этот термин объединяет целый ряд образующихся в организме промежуточных продуктов метаболизма кислорода в виде высокореакционных соединений. Установление ключевой роли митохондрий в регуляции адаптационного ответа клетки привела к формированию концепции митогормезиса, согласно которой изменения митохондриального гомеостаза координируют ядерный и цитозольный ответ клетки при адаптации. АФК, продуцируемые митохондриями, являются ключевыми участниками путей трансдукции сигнала от митохондрий к ядру при активации клеточного ответа на действие стрессирующих факторов и ряда регуляторов [2, 6]. Митохондриальный геном сильно подвержен окислительному стрессу ввиду топологической близости к источникам генерации АФК, в результате воздействия которых на молекулу ДНК индуцируются процессы хромосомных аберраций, приводящих к нарушениям корректной структуры хромосом и возникновению мито-
хондриальных болезней [5]. В основе разработки лекарственных средств, обладающих активностью в отношении профилактики и коррекции окислительного стресса, лежит их способность поддерживать митохондриаль-ных баланс. Таким образом, для оценки степени влияния фармакологически активного веществ на митохондриальный биогенез по маркеру митоходриальной ДНК (мтДНК) и общую цитогенетическую стабильность организма целесообразно проводить скрининг соединений на модельных объектах.
Поэтому целью нашей работы явилось изучение влияния препарата рекомбинантно-го интерферона лямбда на цитогенетическую стабильность клеток костного мозга и на уровень повреждения митохондриальной ДНК печени в условиях индуцированного митоми-цином С окислительного стресса in vivo.
Методика исследований. Работа была осуществлена на базе отдела экспериментальной фармакологии и функционирования живых систем ФГБНУ «ВНИВИПФиТ» (лаборатория доклинических исследований и моделирования биологических систем и виварий) с соблюдением требований международных и российских стандартов в сфере обращения с
животными, задействованными в эксперименте, и «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [3]. Дизайн эксперимента был предварительно одобрен локальной биоэтической комиссией. В эксперименте использовали клинически здоровых половозрелых белых
Таблица 1 - Дизайн экспериментальной работы
беспородных мышей-самцов разведения вивария ФГБНУ «ВНИВИПФиТ». Исследуемым объектом служили образцы ДНК печени и препараты клеток костного мозга мышей.
В опыте было сформировано 4 группы подопытных мышей-самцов по п=6 в каждой, массой тела 18-20 г.
Группы животных Применяемые препараты, способ, доза, объём введения
I Отрицательный контроль Изотонический раствор натрия хлорида внутрибрюшинно в объёме 0,2 мл
II Положительный контроль Митомицин С в дозе 10,0 мг/кг в объеме 0,2 мл
III Опытная Препарат рекомбинантного интерферона лямбда (Ш^А) внутримышечно 0,1 мл/кг в объеме 0,1 мл трехкратно с интервалом 24 часа
IV Опытная Препарат рекомбинантного интерферона лямбда внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг в объеме 0,1 мл трехкратно с интервалом 24 часа; внутрибрюшинно митомицин С (ММС) в дозе 10 мг/кг в объёме 0,2 мл одновременно с третьим введением исследуемого препарата
Через 24 ч после последней инъекции препаратов животных выводили из эксперимента передозировкой СО2 с отбором образцов тканей печени и костного мозга от подопытных мышей всех групп для проведения исследования.
Для определения уровня повреждений в мтДНК использовали модифицированный метод Q-PCR. Данный метод позволяет проводить специфичное для последовательности обнаружение и точную количественную оценку повреждений в длинных участках ми-тохондриальных ДНК [5, 9]. Для этого выделяли тотальную ДНК из 50 мг печени мышей исследуемых групп при помощи набора ПРОБА-ГС (ДНК-технология, Россия), следуя инструкции производителя.
Количество повреждений мтДНК измеряли с помощью Q-PCR длинных фрагментов с использованием ПЦР смеси 5х qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия) на амплификаторе DTlite 4 («ДНК-технология», Россия). Расчет повреждений мтДНК проводили в участках, кодирующих 12S и 16S рРНК (12S-16S) и гена N05 (N05), проявлявших чувствительность к повреждению, с использованием праймеров, указанных в [7]. Количество повреждений в мтДНК нормировали на 10 000 пар нуклеоти-дов (п. н.) по формуле:
(1 - 2-(Дда - Дкор)} х длина фрагмента (п. н.)
D mtDNA = -- . " „ ----
10000
где D mtDNA - количество повреждений мтДНК на 10 000 п. н.; Ддл - разница между Cq контрольных и опытных длинных фрагментов; Дкор - разница между Cq контрольных и опытных коротких фрагментов [7]. За контрольный показатель Cq принимали количество повреждений в мтДНК мышей из группы I.
Расчет количества повреждений проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft; США). Измерение количества копий мтДНК проводили с помощью Q-PCR, используя фрагмент мтДНК «16S-Nd1» и ядерный ген Gapdh в качестве рефе-ренса [7].
Нормализованный уровень мтДНК относительно ядерной ДНК рассчитывали по формуле:
nlmtDNA = 2"AACq [4].
Приготовление препаратов клеток костного мозга для проведения микроядерного теста проводили согласно рекомендациям [3, 8]. Исследование микропрепаратов на частоту встречаемости полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (МЯПХЭ) проводили с помощью микроскопа Биоскоп-1 (ЛО-МО, Россия) при увеличении х1000. Для опре-
деления частоты полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) подсчитывали 2000 клеток. Соотношение ПХЭ к нормохромным эритроцитам (ПХЭ/НЭ) определяли на 500 клеток [8]. Для сравнения исследуемых групп использовали и-тест Майна — Уитни с помощью программы STATISTICA 10 США).
Результаты исследований и их обсуждение. Для оценки влияния на
цитогенетическую стабильность клеток костного мозга мышей были определены частота МЯПХЭ и отношение ПХЭ/НЭ (рис. 1). У животных из группы негативного контроля (группа I) частота МЯПХЭ и ПХЭ/НЭ составляла 0,47±0,14 и 48,6±2,53 %. Введение ИФН-А (группа II) не приводило к изменению иссле-
дуемых параметров (частота МЯПХЭ и ПХЭ/НЭ равнялись 0,47±0,14 и 48,6±2,53 % соответственно). Введение ММС в дозе 10 мг/кг отдельно или совместно с ИФН-Ä оказывало статистически значимый мутагенный и токсический эффект на организм мышей. Так в группах III и IV частота МЯПХЭ повышалась в
29.8 и 23,5 раз относительно негативного контроля и составляла 14,03±1,6 и 11,23±1,0, соответственно. Доля ПХЭ в костном мозге также снизилась относительно группы I на
17.9 и 17,6 % в группах III и IV, соответственно. Значимых отличий между группой III и группой негативного контроля (IV) не было выявлено.
mnpce, % 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
А
pce/ne, % 60,00
50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
Б
iv
Рисунок 1 - Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (А) и отношение полихроматофильных эритроцитов к нормохромным (Б) в костном мозге мышей, исследуемых групп: I - животные группы негативного контроля; II - мыши, трехкратно получившие инъекцию ИФН-À в дозе 0,1 мл/кг; III - мыши, получившие инъекцию ММС в дозе 10,0 мг/кг и ИФН-А аналогично группы II; IV - мыши, получившие инъекцию ММС в дозе 10,0 мг/кг; МЯПХЭ - частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, %; PCE/NE — отношение полихроматофильных эритроцитов к нормохромным; * - статистически значимое отличие от негативного контроля (группа I) при p < 0,05; M ± SE - среднее арифметическое ± стандартная ошибка
*
*
*
*
ii
III
iv
ii
Iii
Таким образом, курсовое введение ИФН-А в дозе 0,1 мл/кг не оказывало мутагенного и токсического воздействия, оцениваемого по частоте МЯПХЭ и доле ПХЭ в костном мозге мышей, что может быть свидетельством отсутствия у него мутагенных свойств.
Далее, нами была исследована копий-ность мтДНК, полученная из печени мышей, исследуемых групп (рис. 2 А). Нормализованный уровень мтДНК у мышей из группы негативного контроля составил 1,29±0,55. Введение митомицина С и ИФН-А не приводило к значимому изменению этого параметра у животных всех исследуемых групп, что отчасти согласуется с полученными ранее нами дан-
ными [5].
Отсутствие значимых различий в нормализованном уровне мтДНК клеток печени мышей позволило нам определить относительное количество повреждений мтДНК (рис. 2 Б). У животных группы I количество повреждений мтДНК на 10 000 п. н. (DmtDNA) составило 0,08±1,28 и 0,26±1,75 в участках 12S-16S и Nd5, соответственно. Введение ИФН-А не привело к значимому изменению DmtDNA в клетках печени мышей группы II в обоих участках мтДНК. Введение митомицина С индуцировало значимое увеличение DmtDNA в группах III и IV в участке 12S-16S.
2,6
0
о. s > x
,5 01
3 5 1,6
1 с
5° * А 0 1 1
IS
о x
0,6
А
I 3
°£2 с с[
5 -1
I
II
III
IV
12s-16s DNd5
Рисунок 2 - Количество копий митохондриальной ДНК в образцах печени мышей (А) и уровень повреждений мтДНК на 10 000 п. н. (Б): I - животные группы негативного контроля; II — мыши, трехкратно получившие инъекцию ИФН-А в дозе 0,1 мл/кг; III - мыши, получившие инъекцию ММС в дозе 10,0 мг/кг и ИФН-А аналогично группе II; IV - мыши, получившие инъекцию ММС в дозе 10,0 мг/кг.; 12S-16S - участок мтДНК, кодирующий гены 12S-16S рибосом; Ш5 -участок мтДНК, кодирующий митохондриальный ген Nd5; * - статистически значимое отличие от негативного контроля (группа I) при р < 0,05; М ± SE - среднее арифметическое ± стандартная ошибка
2
4
1
о
-2
о
Относительно группы негативного контроля происходило увеличение DmtDNA в 53,6 и 8,2 раза в участках 12S-16S и Nd5 у мышей группы III, соответственно. У животных после инъекции митомицина С (группа IV) также наблюдалось увеличение DmtDNA в 62,2 и 12,2 раза в участках 12S-16S и Nd5 относительно группы I. При этом наблюдалась тенденция к снижению DmtDNA у мышей, получивших помимо митомицина С инъекции ИФН-А (группа III) относительно животных группы IV. Так, DmtDNA в участке 12S-16S снизился на 13,86 % (с 4,98±0,49 до 4,29±0,68 в группах IV и III, соответственно) и на 32,7 % в участке Nd5 (с 3,18±1,03 до 2,14±0,83 в группах IV и III, соответственно). В связи с этим можно предположить, отсутствие индуцированного ИФН-А повреждения мтДНК. Поскольку одним из основных факторов, повреждающих мтДНК, является окислительное действие свободных радикалов, таких как активные формы кислорода, наличие тенденции к снижению DmtDNA при его введении может косвенно свидетельствовать об анти-оксидантом действии ИФН-А [2, 5, 6].
Выводы. Курсовое введение препарата рекомбинантного интерферона лямбда лабораторным мышам не приводило к увеличению частоты микроядер в полихроматофиль-ных эритроцитах костного мозга, снижению доли полихроматофильных эритроцитов, а также сохроняло без изменений уровень ко-
пийности мтДНК и количество повреждений мтДНК. Эти результаты позволяют предполагать отсутствие у препарата рекомбинантно-го интерферона лямбда токсических, мутагенных и ДНК-повреждающих свойств при его использовании в исследованных доах. Тенденция к снижению количества повреждений мтДНК при использовании препарата реком-бинантного интерферона лямбда в условиях индуцированного митомицином С окислительного стресса, вероятно, позволяет предположить у него наличие антиоксидантных свойств.
Список литературы
1. Востроилова Г. А. Влияние интерферона лямбда на генерацию активных форм кислорода в клетках мышей в условиях оксидатив-ного стресса, индуцированного Митомицином С / Г. А. Востроилова, Н. А. Хохлова, Д. И. Шабанов [и др.] // Нормативно-правовое регулирование в ветеринарии. - 2023. - № 4. - С. 189-194.
2. Мартинович Г. Г. Активные формы кислорода в регуляции функций и свойств клеток: явления и механизмы / Г. Г. Мартинович. - Минск : БГУ, 2021. - 239 с.
3. Миронов А. Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К. - 2012. -944с.
4. Хорольская В. Г. Влияние фенофибрата
на генотоксичность в мозге и печени и на экспрессию генов, регулирующих метаболизм жирных кислот, у мышей / В. Г. Хорольская, А. П. Гуреев, Е. А. Шафоростова [и др.] // Биомедицинская химия. - 2019. - Т. 65. - № 5. -С.388-397.
4. Шабанов Д. И. Исследование влияния митомицина на уровень повреждений мито-хондриальной ДНК у мышей in vivo / Д. И. Шабанов, Г. А. Востроилова, Е. В. Михайлов [и др.] // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2023. - № 2(23). - С. 12-23.
5. Шлапакова Т. И. Активные формы кислорода: участие в клеточных процессах и развитии патологии / Т. И. Шлапакова, Р. К. Костин,
Е. Е. Тягунова // Биоорганическая химия. -2020. - Т. 46, № 5. - С. 466-485.
6. Gureev A. P. Simplified qPCR method for detecting excessive mtDNA damage induced by exogenous factors / A. P. Gureev, E. A. Shaforostova, A. A. Starkov, V. N. Popov // Toxicology. - 2017. -Vol. 382. - P. 67-74.
7. Jain A. K. In Vivo Micronucleus Assay in Mouse Bone Marrow / A. K. Jain, A. K. Pandey // Methods Mol Biol. - 2019. - 2031. P. 135 - 146.
8. Lehle S. LORD-Q: a long-run real-time PCR-based DNA-damage quantification method for nuclear and mitochondrial genome analysis / S. Lehle, D. G. Hildebrand, B. Merz [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol. 42(6). - P. e41.
001: 10.48612^Ьогтк-2024-1-73 УДК 57.084.1:616-006.6:619
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГИДРОФИЛЬНОЙ КРИОФРАКЦИИ СЕЛЕЗЁНКИ НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ КЛЕТОК МЫШЕЙ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА
Шабанов Дмитрий Игоревич Востроилова Галина Анатольевна, д-р. биол. наук Хохлова Нина Алексеевна, канд. вет. наук Корчагина Анастасия Андреевна, канд. вет. наук Морозова Диана Дмитриевна Некрасов Артём Валерьевич
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии, г. Воронеж, Российская Федерация
Нами было изучено влияние фармакологической субстанции, полученной из гидрофильной криофракции селезенки КРС, на цитогенетическую стабильность мышей с асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ) в условиях противоопухолевой терапии антрациклиновым антибиотиком - доксорубицином. В ходе работы была определена частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, доля полихроматофильных эритроцитов в костном мозге животных-опухоленосителей и продолжительность их жизни. Совместное введение доксорубицина и гидрофильной криофракции селезенки КРС индуцировало снижение частоты микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей на 28,2 % относительно мышей с АКЭ, которые получили только противоопухолевый препарат. При этом отдельное введение гидрофильной криофракции селезенки КРС животным с АКЭ индуцировало значимое увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей на 68,81 %, что делает её перспективным объектом исследований в целях снижения побочных эффектов при химиотерапии животных со злокачественными опухолями.
Ключевые слова: гидрофильная криофракция селезёнки; генетическая стабильность; доксорубицин; асцитная карцинома Эрлиха; белые лабораторные мыши
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00034, https://rscf.ru/project/24-26-00034/
