CC BY
67
DOI: 10.23868/202003006
оценка цитотоксичЕских и ГЕнотоксичЕских эффектов митомицинА с в культурах эндотелиальных клеток человека
М.Ю. Синицкий, А.Г. Кутихин, Д.К. Шишкова, М.А. Асанов, А.В. Понасенко
Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия
cYToToxic AND GENoToxic EFFEcts oF MIToMYcIN c TowARD human ENDoTHELiAL cELLs
M.Y. Sinitsky, A.G. Kutikhin, D.K. Shishkova, M.A. Asanov, A.V. Ponasenko
Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia
e-mail: [email protected]
Митомицин С — алкилирующий агент, относящийся к группе одноцентровых мутагенов и наиболее часто использующийся в экспериментах in vitro по моделированию мутагенеза. Целью работы было изучение цитотоксических и генотоксических эффектов митомицина С на эндотелиоциты артерий, в различной степени подверженных развитию атеросклероза, in vitro. С помощью колориметрического МТТ-теста была изучена цитоток-сичность различных концентраций митомицина С, а с использованием микроядерного теста проведена оценка генотоксических эффектов данного мутагена на культурах эндотелиальных клеток коронарной и внутренней грудной артерий человека, культивируемых в условиях индуцированного мутагенеза. После 6 ч. культивирования ни одна из концентраций митомицина С не вызывала значимого снижения количества жизнеспособных клеток по сравнению с контролем, а увеличение времени мутагенной нагрузки до 24 ч. приводило к достоверному (p<0,05) уменьшению количества жизнеспособных эндотелиоцитов коронарной и внутренней грудной артерий при концентрациях митомицина С выше 350 нг/мл и 200 нг/мл, соответственно. Кроме того, в культурах, обработанных митомицином С, было отмечено почти трехкратное превышение частоты цитогенетиче-ских повреждений по нескольким маркерам (количеству клеток с микроядрами, нуклеоплазменными мостами и ядерными про-трузиями) по сравнению с контролем (p<0,01), причем уровень повреждений ДНК в клетках внутренней грудной артерии был более высоким по сравнению с таковым в клетках коронарной артерии. Таким образом, было установлено, что эндотелиаль-ные клетки различных сосудов отличаются порогом чувствительности к цитотоксическому действию алкилирующего агента и характеризуются различным уровнем генотоксического стресса в ответ на действие мутагена.
ключевые слова: митомицин С, мутагенез, цитотоксич-ность, генотоксический стресс, микроядерный тест, эндоте-лиальные клетки, коронарная артерия, внутренняя грудная артерия.
Бведение
Митомицин С (ММС) — противоопухолевый антибиотик, выделенный в 1958 г. из кондиционированной среды при культивировании Streptomices caespitosis (класс Actinobacteria) и широко применяющийся в химиотерапии злокачественных новообразований [1]. По механизму действия ММС является алкилирующим агентом, содержащим две этилениминовые группы, и относится к одноцентровым мутагенам [2]. Воздействие ММС на клетки вызывает серьезные повреждения ДНК, в результате которых нарушаются процессы репликации, транскрипции и запускается механизм апоптоза [3]. Генотоксический эффект ММС достигается путем его восстановительной активации до митозена: в ходе реакции N-алкилирования ММС взаимодействует с y-N-гуаниновыми нуклеотидными остатками малой бороздки ДНК в месте расположения димеров CG, что приводит к образованию поперечных сшивок молекулы ДНК [4]. ММС также активно используется в качестве
Mitomycin C is the most used for in vitro mutagenesis modeling alkylating agent belonging to the single-site mutagens. In the presented study, the in vitro cytotoxic and genotoxic effects of mitomycin C in endothelial cells of different arteries differ in the level of atherogenesis were studied. MTT colorimetric assay was used for assessment of cytotoxicity of different concentrations of mi-tomycin C, cytokinesis-block micronucleus assay — for estimating of genotoxic effects in human coronary and internal thoracic artery endothelial cells exposed to mutagen. After 6-h cultivation no decrease in the viability of cell cultures exposed to all studied concentrations of mitomycin C was observed; an increasing time of mutagenic load to 24 hours resulted in a significant (p<0,05) decrease in the number of viable human coronary- and internal thoracic artery endothelial cells at concentrations of mitomycin C above 350 ng/mL and 200 ng/mL, respectively. Exposed cultures are characterized by three-fold increasing of cytogenetic damages (micronucleus, nucleoplasmic bridges and nuclear buds) compared to control (p<0,01); the cells of internal thoracic artery have a higher level of DNA lesions in comparison to coronary artery. Thus, endothelial cells of different arteries differ in the threshold of sensitivity to cytotoxic exposure of alkylating agents and the manifestation of genotoxic effects of mitomycin C.
Keywords: mitomycin C; mutagenesis; cytotoxicity; genotoxic stress; micronucleus assay; endothelial cells; coronary artery; internal thoracic artery.
мутагена в экспериментах по моделированию мутагенеза in vitro, что обусловлено рядом его свойств: легкой растворимостью в воде и физиологическом растворе, стойкостью растворов, сохранением цитогенетической активности при температурах до 37°C в течение нескольких часов.
Поперечные сшивки молекулы ДНК могут возникать не только в результате действия антибиотиков и противоопухолевых препаратов, их также могут инициировать различные эндогенные и экзогенные факторы, обладающие сходным с ММС действием на генетический материал. К группе эндогенных факторов относят бифункциональные альдегиды (например, малоновый диальдегид), образующиеся в организме человека в результате перекисного окисления липидов и биосинтеза простогландинов [5]; азотистую кислоту, являющуюся побочным продуктом метаболизма нитритов, поступивших в организм с пищей, а также образующуюся в результате взаимодействия с водой
оксида азота, синтезирующегося в организме человека и выполняющего ряд важнейших функций [6]; и свободные радикалы, образующиеся в результате окси-дативного стресса [7]. В группу экзогенных факторов входят различные химические соединения, такие как альдегиды (формальдегид, ацетальдегид, кротоновый альдегид и акролеин, присутствующие в пищевых добавках, пестицидах, табачном дыме и выхлопных газах) [5], алкилгалогениды, алкены, спирты, кетоны, эфиры и сульфиды, присутствующие в производственных циклах различных промышленных предприятий и поступающие в окружающую среду с промышленными отходами, а также ионизирующая радиация [8].
На сегодняшний день известно, что атеросклероз, являющийся причиной большинства смертей от заболеваний сердечно-сосудистой системы, имеет, в том числе, и неопластическую природу, а разные сосуды в силу своих физиологических и гидродинамических особенностей характеризуются различной чувствительностью к атерогенезу [9]. Например, коронарная артерия наиболее часто поражается атеросклерозом, в то время как атеросклеротическое поражение внутренней грудной артерии встречается достаточно редко [10]. Принято считать, что атеросклеротические бляшки образуются в результате дисфункции эндотелия [11], которая возникает не только при воздействии различных факторов риска, но и в ответ на соматические мутации, вызванные наследственными факторами и генотоксическими агентами окружающей среды [12]. Было показано, что некоторые факторы риска развития атеросклероза (диабет, курение) и влияние экзогенных токсических веществ повышают уровень образования активных форм кислорода в сосудистом русле и способствуют атерогенезу [13]. Интима сосудов характеризуется более высоким уровнем повреждения ДНК — содержание 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина в ней в 2,8 раза выше по сравнению с медией, что объясняется воздействием на эндотелий мутагенных агентов, циркулирующих в крови [14]. Таким образом, представляется актуальным изучение геноток-сических и цитотоксических эффектов алкилирующих агентов на эндотелиальные клетки различных сосудов, однако таких работ крайне мало.
Целью работы было изучение цитотоксических и генотоксических эффектов ММС на эндотелиоциты артерий, в различной степени подверженных развитию атеросклероза, in vitro.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Изучение цитотоксического и генотоксического эффектов было выполнено на коммерческих культурах эндотелиальных клеток коронарной (Human Coronary Artery Endothelial Cells, HCAEC, кат. № 300-05a) и внутренней грудной (Human Internal Thoracic Artery Endothelial Cells, HITAEC, кат. № 308-05a) артерий (Cell Applications Inc., США). Все манипуляции с клеточными культурами проводили в асептических условиях в боксе с абактериальной воздушной средой БАВп-01-«Ламинар-С»-1,8 класса II/типа А2 биологической безопасности (Lamsystems, Миасс, россия) в соответствии с протоколом, рекомендуемым поставщиком клеточных культур. После размораживания клетки переносили в культуральные флаконы Т-75 (Greiner, Австрия, кат. № 658170), культивировали в Ш2-инкубаторе Sanyo MCO-19AIC (Япония) при температуре 37°C, 5% CO2 и повышенной влажности в питательной
среде для роста клеток Human MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications Inc., США, кат. № 212-500) до образования 90% субконфлюентного монослоя, пересевали с помощью трипсин/ЭДТА (Cell Applications Inc., США, кат. № 070-100) и продолжали культивировать. Клетки 4 пассажа (общее время культивирования 7 сут.) рассевали с концентрацией 2х104 клеток на лунку в два 96-луночных (Eppendorf, Германия, кат. № 0030730119) и с концентрацией 2х105в четыре 6-луночных (Eppendorf, Германия, кат. № 0030720113) ТС-планшета для каждой клеточной линии, культивировали в течение 1 сут. и далее определяли цитоксичность и генотоксичность ММС.
Оценка цитотоксичности митомицина С
В каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли свежую культуральную среду, содержащую ММС (AppliChem, Испания, кат. № A2190,0002) в финальных концентрациях 50 нг/мл, 200 нг/мл, 350 нг/ мл, 500 нг/мл, 650 нг/мл, 800 нг/мл и 950 нг/ мл (12 лунок на каждую концентрацию мутагена, эксперимент), или не содержащую ММС (12 лунок, контроль), инкубировали в течение 6 ч. и 24 ч. (по 2 планшета для каждой экспозиции: в одном планшете культура клеток HCAEC, в другом — HITAEC) и оценивали цитотоксич-ность изучаемых концентраций ММС с помощью набора Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, США, кат. № V13154). В лунки планшетов с 6 ч. экспозицией через 2 ч., а в лунки планшетов с 24 ч. экспозицией через 20 ч. инкубирования добавляли раствор МТТ, инкубировали 4 ч., вносили смесь SDS/HCl, инкубировали еще 4 ч. в стандартных условиях и измеряли оптическую плотность клеточных культур при длине волны 570 нм на спектрофотометре АИФр-01 УНИПЛАН (зАО «Пикон», Москва, россия).
Оценка генотоксичности митомицина С
В лунки двух 6-луночных планшетов (в одном планшете культура клеток HCAEC, в другом — HITAEC) добавляли свежую культуральную среду, содержащую ММС в финальной концентрации 500 нг/мл [15, 16] (эксперимент), в лунки 2 других планшетов — свежую среду без ММС (контроль). Клетки культивировали в течение 6 ч. в соответствии с имеющимися рекомендациями [17, 18], после чего производили смену культуральной среды, в лунки всех планшетов добавляли цитоха-лазин б (AppliChem, Испания, кат. № 765790010) в финальной концентрации 6 мкг/мл и инкубировали в течение 1 сут. Далее клетки фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа) и готовили цитогенетические препараты по стандартному протоколу микроядерного теста с блоком цитокинеза [19] с модификациями для эндотелиоцитов [20]. Препараты анализировали под микроскопом при увеличении х 1000. На каждом препарате подсчитывали 1000 двуядерных клеток, в которых, согласно общепринятым критериям [19], выявляли маркеры цитогенетических повреждений: микроядра, нуклеоплазменные мосты и ядерные протрузии.
Статистический анализ
Статистическая обработка результатов была выполнена в программах StatSoft sTaTISTICA 10 с помощью блока непараметрической статистики и GraphPad Prism 7. Для количественных показателей рассчитывали
д Концентрация ММС, нг/мл б Концентрация ММС, нг/мл
Рис. 1. Оптическая плотность (ОП) клеточных культур эндотелиальных клеток коронарной (НСАЕС) и внутренней грудной (Н1ТАЕС) артерий человека, культивированных в присутствии различных концентраций митомицина С: А — время культивирования 6 ч.; Б — 24 ч.
*различия статистически значимы при сравнении с контролем (0 нг/мл), р<0,05
медиану (m) и межквартильный размах (IQR). Различия между группами оценивали с помощью рангового U-критерия Манна-Уитни. Для определения взаимосвязей между показателями рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Различия между группами считали статистически значимыми при значениях р<0,05.
Результаты и обсуждение
В эксперименте для оценки цитотоксичности изучаемых концентраций ММС были выбраны две временные точки. Выбор первой точки (6 ч.) был обусловлен тем, что согласно общепринятым рекомендациям по изучению особенностей проявления кластогенных эффектов различных соединений в экспериментах in vitro, воздействие на клеточные культуры мутагенами проводится именно в течение 6 ч. [17, 18], поэтому важно понимать, насколько цитотоксические эффекты ММС проявляются в культурах эндотелиальных клеток, культивируемых в течение данного времени. Вторая временная точка (24 ч. культивирования в условиях мутагенной нагрузки) была использована для оценки динамики проявления цитотоксических эффектов различных концентраций ММС на этапе завершения удвоения количества эндотелиальных клеток в культуре. Выбор концентраций ММС, использованных в эксперименте, был осуществлен также согласно общепринятым рекомендациям [1 8]. Было установлено, что после 6 ч. культивирования ни одна из концентраций ММС не вызывала значимого снижения количества жизнеспособных клеток по сравнению с контролем (рис. 1А), а увеличение времени мутагенной нагрузки до 24 ч. приводило к достоверному (р<0,05) снижению количества жизнеспособных клеток в культурах HCAEC и HITAEC, обработанных ММС в концентрациях 350-950 нг/мл и 200-950 нг/мл, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 1 Б).
Также была отмечена отрицательная корреляция между количеством жизнеспособных клеток и концентрацией ММС (г=-0,63, р<0,0001 для культуры HCAEC и г=-0.67, р<0,0001 для культуры HITAEC). ММС на сегодняшний день широко используется в терапии злокачественных новообразований, а его цитотоксические эффекты на клетки различных типов опухолей достаточно хорошо изучены [21-23], но токсичность данного мутагена для эндотелиальных клеток была исследована только в 2 работах [24, 25].
С. Ноогп с соавт. (1995), оценивая воздействие ММС на культуры эндотелиальных клеток легочной артерии свиньи, установили, что однократное внесение ММС (в концентрациях 0 мкМ, 0,1 мкМ, 1мкМ и 10 мкМ) в монослойную культуру эндотелиоцитов запускало цитолитическое повреждение клеток, интенсивность которого прямо коррелировала с концентрацией мутагена и временем экспозиции [24]. Резкое уменьшение количества жизнеспособных клеток наблюдали через 1 сут. культивирования в присутствии 10 мкМ ММС, а уменьшение концентрации мутагена приводило к увеличению времени, в течение которого клетки сохраняли свою жизнеспособность. При обработке субконфлюэнт-ных культур клеток ММС происходило ингибирование их пролиферативной активности. Низкие концентрации мутагена (от 0,01 до 1 мкМ) вызывали образование поперечных сшивок ДНК, останавливали деление клеток, но практически не оказывали цитотоксических эффектов [24]. Сходные данные были получены в более поздней работе К. Wu с соавт. (2008) на клеточных линиях заднего эпителия роговицы глаза, обработанных ММС в концентрациях от 0 до 0,1 мг/мл [25]. Значения оптической плотности клеточных культур, измеренной с помощью МТТ-теста, были обратно пропорциональны концентрации мутагена, а увеличение времени мутагенной нагрузки с 15 до 24 ч. коррелировало с увеличением интенсивности процессов апоптоза в клеточных культурах [25]. Описанные результаты согласуются с данными, полученными в нашей работе.
результаты изучения генотоксических эффектов на клеточных линиях НСАЕС и Н1ТАЕС, культивируемых в условиях генотоксической нагрузки, представлены в таблице. В культурах, обработанных ММС, было выявлено достоверное (р<0,01) превышение всех изученных цитогенетических маркеров генотоксического воздействия (количество клеток с микроядрами, образовавшимися из ацентрических хромосомных фрагментов; количество клеток с нуклеоплазменными мостами, представляющие собой дицентрические хромосомы, во время митоза разошедшиеся к различным полюсам клетки; количество клеток с ядерными протрузиями, являющимися следствием удаления из клетки избыточно амплифицированного генетического материала) по сравнению с контролем.
Следует отметить, что в целом клетки внутренней грудной артерии имели более высокий уровень цитогенетиче-ских повреждений, как в контроле, так и в эксперименте,
таблица. Уровень цитогенетических повреждений (%%, Me±IQR) эндотелиоцитов артерий после воздействия митомицина С
Клеточная линия, группа Двуядерные клетки с микроядрами Двуядерные клетки с нуклеоплазменными мостами Двуядерные клетки с ядерными протрузиями
HCAEC Контроль 12,0±4,5 13,0±4,5 12,5±5,0
Эксперимент 38,0±13,51 49,5±16,51 24,0±16,51
HITAEC Контроль 16,0±3,5 46,5±10,02 15,0±4,0
Эксперимент 46,5±6,51 147,5±12,0Г 2 34,0±6,01
Примечание: 1различия статистически значимы при сравнении с контролем, р<0,01; 2различия статистически значимы при сравнении с НСАЕС, р<0,01; Ме — медиана; ЮЯ — межквартильный размах; НСАЕС -эндотелиальные клетки коронарной артерии; Н1ТАЕС — эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии
по сравнению с клетками коронарной артерии, однако данные различия, за исключением различий по количеству клеток с нуклеоплазменными мостами, не достигали порога достоверности. Работ по оценке генотоксических эффектов алкилирующих агентов на клеточных культурах очень мало, а наибольшее внимание уделяется экспериментам in vivo, что, по мнению некоторых ученых, не совсем корректно с методологической точки зрения [17]. В ряде исследований было показано, что ММС в действующих концентрациях 500 нг/мл вызывал значимые генотоксические эффекты в различных клеточных культурах [15-17, 26, 27], однако оценка ответа эндотелиальных клеток на действие алкилирующих агентов в экспериментах in vitro до настоящего момента не проводилась. Вместе с тем было доказано, что воздействие химических веществ, вызывающих образование свободных радикалов [20], и ионизирующей радиации [28], ассоциировано с генотоксическими эффектами в культурах эндотелиальных клеток.
Полученные в нашем эксперименте различия по значению минимальной концентрации ММС, вызывающей цитотоксические эффекты в эндотелиальных клетках различных артерий, а также по степени проявления генотоксических эффектов, могут представлять особый интерес, так как свидетельствуют о дифференциальной чувствительности различных сосудов на действие алкилирующих агентов. Известно, что коронарная артерия наиболее часто поражается атеросклерозом в силу гидродинамических особенностей тока крови, а внутренняя грудная артерия, наоборот, в наименьшей степени подвержена атерогенезу благодаря более активному синтезу оксида азота, обладающего атеро-протективным действием за счет угнетения утолщения интимы сосудов, агрегации тромбоцитов и адгезии тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию [29]. Вместе с тем, наши результаты свидетельствуют о более высокой чувствительности эндотелиоцитов внутренней грудной артерии к действию алкилирующих агентов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yurttas C., Hoffmann G., Tolios A. et al. Systematic review of variations in hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) for peritoneal metastasis from colorectal cancer. J. Clin. Med. 2018; 7(12): 567.
2. Бочков Н.П., Чеботарёв А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. М.: Медицина; 1989. [Bochkov N.P., Chebotaryov A.N. Human heredity and environmental mutagens. M.: Medicine, 1989].
3. Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L. et al. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis 2006; 27(3): 446-53.
4. Rink S.M., Lipman R., Alley S.C. et al. Bending of DNA by the mitomycin C-induced, GpG intrastrand cross-link. Chem. Res. Toxicol. 1996; 9(2): 382-9.
5. Stone M.P., Cho Y.J., Huang H. et al. Interstrand DNA cross-links induced by alpha, beta-unsaturated aldehydes derived from lipid peroxidation and environmental sources. Acc. Chem. Res. 2008; 41(7): 793-804.
6. Caulfield J.L., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R. Nitric oxide-induced interstrand cross-links in DNA. Chem. Res. Toxicol. 2003; 16(5): 571-4.
Эта особенность, вероятно, связана с тем, что активно синтезируемый эндотелиальными клетками внутренней грудной артерии оксид азота взаимодействует с водой, что приводит к образованию азотистой кислоты, также являющейся алкилирующим агентом [6]. Дополнительная нагрузка клеточных культур HITAEC мутагеном усугубляет действие на них азотистой кислоты, что проявляется в усилении цитотоксических и генотоксических эффектов в данной культуре.
Таким образом, нами впервые были получены данные об особенностях проявления цитотоксических и геноток-сических эффектов ММС — мутагена с алкилирующим механизмом действия, на эндотелиальных клетках коронарной и внутренней грудной артерий. Эти результаты могут быть использованы в дальнейших экспериментах по моделированию мутагенеза в эндотелиоцитах in vivo, а также вносят вклад в понимание фундаментальных основ атерогенеза в различных артериях.
Важно подчеркнуть, что концентрации ММС, использованные в нашей работе, выбраны только для in vitro моделирования мутагенеза в культурах эндотелиальных клеток, а дизайн эксперимента предполагает изучение фундаментальных механизмов действия алкилирующих агентов на эндотелиальные клетки. Для экстраполяции полученных результатов на организм человека необходимо проведение дополнительных исследований на моделях in vivo.
конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546-2019-0003.
7. Cadet J., Davies K.J.A., Medeiros M.H. et al. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic. Biol. Med. 2017; 107: 13-34.
8. Colis L.C., Raychaudhury P., Basu A.K. Mutational specificity of gamma-radiation-induced guanine-thymine and thymine-guanine intrastrand cross-links in mammalian cells and translesion synthesis past the guanine-thymine lesion by human DNA polymerase eta. Biochemistry 2008; 47(31): 8070-9.
9. Aboyans V., Lacroix P., Criqui M.H. Large and small vessels atherosclerosis: similarities and differences. Prog. Cardiovasc. Dis. 2007; 50(2): 112-25.
10. Sims F.H. A comparison pf coronary and internal mammary arteries and implications of the results in the etiology of atherosclerosis. Am. Heart J. 1983; 105(4): 560-6.
11. Gray K., Bennett M. Role of DNA damage in atherosclerosis-bystander or participant? Biochem. Pharmacol. 2011; 82: 693-700.
12. Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний 2017; 6(1): 92-101. [Kutikhin A.G., Sinitsky M.Y., Ponasenko A.V. Role of mutagenesis in atherosclerosis. Complex Issues of Cardiovascular Diseases 2017; 6(1): 92-100].
13. Borghini A., Cervelli T., Galli A. et al. DNA modifications in atherosclerosis: from the past to the future. Atherosclerosis 2013; 230(2): 202-9.
14. Nair J., De Flora S., Izzotti A. et al. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat. Res. 2007; 621(1-2): 95-105.
15. Hude W., Kalweit S., Engelhardt G. et al. In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutat. Res. 2000; 468(2): 137-63.
16. Rosefort C., Fauth E., Zankl H. Micronuclei induced by aneugens and clastogens in mononucleate and binucleate cells using the cytokinesis block assay. Mutagenesis 2004; 19(4): 277-84.
17. Speit G. Does the recommended lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for human biomonitoring actually detect DNA damage induced by occupational and environmental exposure to genotoxic chemicals? Mutagenesis 2013; 28(4): 375-80.
18. OECD. Guidelines for the testing of chemicals no. 487: in vitro mammalian cell micronucleus test (Mnvit). OECD: Paris, France; 2010.
19. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat. Protoc. 2007; 2(5): 1084-104.
20. Scarpato R., Gambacciani C., Svezia B. et al. Cytotoxicity and geno-toxicity studies of two free-radical generators (AAPH and SIN-1) in Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1) and human peripheral lymphocytes. Mutat. Res. 2011; 722(1): 69-77.
21. Cheng S.Y., Vargas A., Lee J.Y. et al. Involvement of Akt in mitomycin C and its analog triggered cytotoxicity in MCF-7 and K562 cancer cells. Chem. Biol. Drug. Des. 2018; 92(6): 2022-34.
22. Al-Otaibi W.A., Alkhatib M.H., Wali A.N. Cytotoxicity and apoptosis enhancement in breast and cervical cancer cells upon coadministration of mitomycin C and essential oils in nanoemulsion formulations. Biomed. Pharmacother. 2018; 106: 946-55.
23. Tung S.Y., Lin C.T., Chen C.N. et al. Effect of mitomycin C on X-ray repair cross complementing group 1 expression and consequent cytotoxicity regulation in human gastric cancer cells. J. Cell. Biochem. 2019; 120: 8333-42.
24. Hoorn C.M., Wagner J.G., Petry T.W. et al. Toxicity of mitomycin C toward cultured pulmonary artery endothelium. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1995; 130(1): 87-94.
25. Wu K.Y., Wang H.Z., Hong S.J. Mechanism of mitomycin-induced apoptosis in cultured corneal endothelial cells. Mol. Vis. 2008; 14: 1705-12.
26. Matsushima T., Hayashi M., Matsuoka A. et al. Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster Lung Cell Line (CHL/ IU). Mutagenesis 1999; 14(6): 569-80.
27. Speit G., Linsenmeyer R., Schütz P. et al. Insensitivity of the in vitro cytokinesis-block micronucleus assay with human lymphocytes for the detection of DNA damage present at the start of the cell culture. Mutagenesis 2012; 27(6): 743-7.
28. Raicu M., Vral A., Thierens H. et al. Radiation damage to endothelial cells in vitro, as judged by the micronucleus assay. Mutagenesis 1993; 8(4): 335-9.
29. Dessy C, Ferron O. Pathophysiological roles of nitric oxide: in the heart and the coronary vasculature. Anti Inflamm. Anti Allergy. Agents Med. Chem. 2004; 3:207-16.
Поступила: 08.08.2019
