CC BY
20
УДК 616-006.81:611.1:578.264.2 А.А. Вартанян, М.А. Барышникова, О.С. Бурова, Л.В. Эктова, Л.И. Смирнова, З.С. Шпрах БЛОКАТОР ВАСКУЛОГЕННОЙ МИМИКРИИ ВОССТАНАВЛИВАЕТ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РЕЗИСТЕНТНЫХ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ К ДНК-АЛКИЛИРУЮЩИМ АГЕНТАМ
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Контактная информация
Вартанян Амалия Арташевна, д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)324-10-65 e-mail: zhivotov57@mail.ru
Статья поступила 06.06.2016, принята к печати 14.06.2016.
Резюме
Методом искусственной стимуляции создана модельная клеточная линия меланомы Mel IlR, резистентная к апоптозу. Исследование фенотипа резистентных к аранозе клеток меланомы выявило снижение в 3 раза экспрессии CD63, в 86 раз - СБ54 и в 460 раз - CD117, что указывало на переход клеток в фазу агрессивного роста. Клетки Mel IlR оказались резистентны также к апоптозу, индуцированному стрептозотоцином. В отличие от клеток "дикого" типа, клетки Mel IlR формировали на Матригеле™ сосудисто-подобные структуры, что является in vitro тестом васкулогенной мимикрии. Соединение ЛХС1269, блокатор ВМ, восстанавливало чувствительность резистентных клеток и к аранозе, и к стрептозотоцину.
В работе впервые рассматривается возможность преодоления лекарственной резистентности к ДНК-алкилирующим агентам блокированием ВМ.
Ключевые слова: меланома, резистентность, ДНК-алкилирующие агенты, араноза, стрептозотоцин, апоптоз, васкулогенная мимикрия.
A.A. Vartanian, M.A. Baryshnikova, O.S. Burova, L.V. Ektova, L.I. Smirova, Z.S.Shprakh VASCULOGENIC MIMICRY INHIBITOR REVERSES SENSITIVITY OF RESISTANT MELANOMA CELLS TO DNA ALKYLATING AGENTS
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» Russian Ministry of Health, Moscow
Abstract
We established unique melanoma subline Mel IlR cells resistant to aranosa (DNA-alkylating agent, RF) from the parental Mel Il/WT cell line by continuous stepwise selection with increasing concentrations of aranoza. Herein we show the dramatic drop of CD117, CD54 and CD63 expression in resistant cells in 460; 86 and 3-fold as compared with parental cells indicating the transition of melanoma cells to invasive growth. Crossresistance of aranoza-resistant Mel IlR cells to streptozotocin was also observed. Mel Il/WT melanoma cells were unable to form сapillary-like structures (CLS) in Matrigel which is a reconstitution of vasculogenic mimicry in vitro. However, Mel IlR cells generated CLS. VM inhibition by the compound LCS1269 reverses sensitivity of resistant melanoma cells to aranosa or streptozocine.
In this study, we provide the experimental evidence that VM blockade can fight multidrug resistance for DNA alkylating agents.
Key words: melanoma, DNA alkylating agents, resistance, aranosa, streptozotocin, apoptosis, vasculogenic mimicry.
Введение
Химиотерапия является основным, а при некоторых формах и стадиях распространения злокачественной опухоли - единственным методом лечения онкологических больных. Наиболее серьезным препятствием к повышению эффективности химиотерапии опухолей по-прежнему остается фенотип их МЛУ. Лекарственная устойчивость может реализоваться на разных этапах осуществления токсического действия химиопрепарата - от ограничения накопления лекарства интрацеллюлярно до отмены программы гибели клеток [1]. На начальном этапе взаимодействия препарата с опухолевой клеткой может
наблюдаться активация обратного транспорта (выброса) лекарственных веществ из клетки [2; 3]. Этот уровень защиты клеток от повреждающего действия биологически агрессивных химических соединений обеспечивается АТФ-зависимыми АВС-транспортерами и достаточно эффективно предотвращает последствия применения противоопухолевых химиотерапевтических средств. Устойчивость к цитотоксическому действию препарата может быть связана и с высокой активностью системы детокси-кации противоопухолевых препаратов внутри клетки или с повышением эффективности репарации ДНК [4; 5]. Следует отметить, что и детоксикация противоопухолевых препаратов внутри клетки, и выброс
лекарственных веществ из клетки АВС-транспортерами, и активированная система репарации ДНК направлены на предотвращение взаимодействия препарата с внутриклеточной мишенью или на скорейшую ликвидацию последствий такого взаимодействия. Если генотоксическое воздействие было слишком мощным, и система репарации не смогла восстановить ДНК, то поврежденная клетка должна быть элиминирована. Все необходимые для осуществления программированной клеточной гибели - апоптоза - компоненты конститутивно присутствуют в клетке. Нарушение регуляции генов, участвующих в апоптозе - последний этап становления МЛУ [6; 7]. Утрата программы клеточной гибели дает возможность клетке сохранять жизнеспособность в присутствии высоких концентраций противоопухолевых лекарств и формировать опухолевую ткань, абсолютно резистентную к лекарственному лечению. Достигнуть реактивации апоптоза в таких ОК становится практически невозможным.
Меланома, симптомы которой проявляются у пациентов в любом возрасте - чрезвычайно злокачественное новообразование.
Это уникальная опухоль, поскольку ее можно легко обнаружить на поверхности кожи (визуально), но вместе с тем весьма коварная. Поддающаяся лечению в горизонтальной фазе роста, меланома становится резистентной к противоопухолевой терапии в вертикальной его фазе. Так, 5-летняя выживаемость отмечается в 97,9 % случаев, если толщина опухоли <0,76 см, и снижается до 57,5 %, когда размеры опухоли >3 см [8]. Агрессивное распространение заболевания на ранних стадиях и резистентность меланомы к обычным методам лечения объясняют высокую летальность при меланоме [9; 10].
По мере того, как опухоль прогрессирует в более агрессивный фенотип, происходит постоянная селекция клеток, способных адаптироваться к быстро меняющемуся микроокружению: выживают те ОК, которые дают опухоли преимущество прогрессировать.
В последние годы накоплен экспериментальный материал, подтверждающий гипотезу частичной транс-дифференцировки ОК в эндотелий-подобные клетки, способные формировать васкулярные каналы [11; 12]. С одной стороны, в ОК наблюдается высокая экспрессия белков VEGF-рецептор-лигандной системы, Tie 1, Tie-2, EphA2, VE-кадгерина и ММР-2, необходимых для приобретения ОК эндотелий-подобных характеристик.
С другой стороны, наблюдается экспрессия Notch и его таргетного гена Nodal, что позволяет ОК имитировать поведение ангиобласта, и формировать примитивную микроциркуляцию, имитирующую кровоснабжение эмбриона. Формирование сети вас-кулярных каналов ОК внутри опухоли - васкулоген-ная мимикрия - может частично компенсировать недостаточно быстрое развитие в ней кровеносной микроциркуляторной сети и создать условия для выживания и пролиферации клеток. ВМ присутствует практически во всех злокачественных новообразованиях, и ее наличие связывают с плохим клиническим прогнозом [13; 14].
Целью настоящего исследования явилось получение культуры клеток меланомы, резистентной к ДНК-алкилирующим агентам, и изыскание возможностей преодоления лекарственной устойчивости. В работе впервые обсуждается роль блокирования ВМ как движущей силы восстановления чувствительности резистентных клеток меланомы к ара-нозе и стрептозотоцину.
Материалы и методы
В работе была использована клеточная линия меланомы кожи Mel II, полученная из опухолевого материала пациента, находившегося на лечении в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России [15]. Клетки растили в полной среде RPMI-1640 с 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, 2mM глутамина, 0,1мг/мл гентамицина на культуральных флаконах при +37 0С в атмосфере 5 % CO2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 2-3 дня.
Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ [16]. МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид (МТТ) в фиолетовые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окилительно-востановительных процессов в клетках культуры и является косвенной характеристикой жизнеспособности клетки. Клетки меланомы (5*104 клеток/мл) вносили в 96-луночный планшет в полной среде RPMI-1640. Спустя 24 ч наносили препарат в различных концентрациях и инкубировали с препаратом 24 ч, затем добавляли в каждую лунку по 10 мкл раствора МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл, (Sigma, Chemical Co, США). Клетки инкубировали еще 4 ч, далее осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об/мин в течение 2-3 мин, среду отбирали и добавляли к клеткам 200 мкл ДМСО. Клетки ресуспендировали и инкубировали 10 мин при +37 0С, после чего немедленно определяли оптическую плотность раствора формазана на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при длине волны 540 нм, используя ДМСО как нулевой контроль.
Формирование сосудисто-подобных структур проводили на Матригеле (BD Bioscience, США) [17]. 24-луночную плашку покрывали Матригелем™ (100 мкл/лунка, плотность 8,7 мг/мл) и инкубировали 2030 мин при комнатной температуре до его полной полимеризации в ламинаре и 1 ч при +37 0С в СО2-инкубаторе. Клетки меланомы (2*105 клеток/мл) инкубировали в полной среде RPMI-1640 с добавлением нецитотоксических доз препарата в течение 15 мин при +37 0С. Затем клетки переносили в лунки, покрытые Матригелем™, и инкубировали в СО2-инкубаторе от 4-6 до 20 ч. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в среде RPMI-1640 без добавления препарата.
Вещество оценивалось как соединение, блокирующее ВМ, если через 24 ч не наблюдалось формирование СПС-структур, подобных пчелиным сотам ("honey-like comb").
Количество апоптических клеток определяли методом двойного окрашивания аннексином V-FITC и пропидия йодидом [18].
Клетки рассаживали в 6-луночные планшеты в количестве 200 000/лунка в 4 мл полной среды RPMI-1640. Через сутки в лунки с клетками добавляли исследуемые препараты, аранозу и стрептозо-тоцин, в концентрациях 1XIC50 и 4xIC50. В контрольных лунках клетки росли без препарата.
Через 24 ч инкубации клетки снимали 500 мкл р-ра Версена, отмывали и помещали в пробирки по 100 000 клеток на пробирку в 100 мкл Annexin-связывающего буфера.
В пробирки добавляли по 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл пропидия йодида (PI). Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к пробам добавляли 400 мкл Annexin-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). Размер и форму клеток определяет прямое рассеивание света (FCS) - количество света в направлении лазерного пучка под углом 0°, тогда как боковое рассеивание (SSC) - под углом 90° по отношению к лазерному пучку определяет структурные особенности различных популяций клеток.
На цитограмме устанавливали соответствующее окно дискриминации (гейт), в котором на основании SSC и FCS вырезали основной пул клеток с целью удаления крупных (агрегаты) и мелких (деб-рис) частиц. Интенсивность флуоресценции проводилась с учетом анализа гистограмм.
Длина волны для красной флуоресценции (РЦ устанавливалась в канале РЕ- флуоресценции, а длина волны для зеленой флуоресценции устанавливалась в канале FITC. При анализе двойного окрашивания клеток в режиме «dot plot» Ännexin V-FITC в сочетании с PI были получены данные в логарифмическом измерении для обоих каналов.
Гистограммы строили на основании подсчета не менее 10 000 событий для каждого образца. Анализ гистограмм проводили с учетом интенсивности флюоресценции.
Фенотипирование антигенов клеточной поверхности проводили в реакции прямой иммуноф-луоресценции [19]. 1х105 клеток трижды промывали PBS pH=7,5 и ресуспендировали в PBS. В каждую пробирку добавляли моноклональные антитела, меченные FITS или PE, и инкубировали 30 мин при +4 °С. Клетки дважды отмывали от не связавшихся антител и ресуспендировали в 200 мкл PBS, содержащем 1 %-ный формалин. Экспрессию антигенов CD20, CD24, CD54, CD63, CD90, CD117, CD133, CD271 и ABCB5 на клеточной поверхности оценивали на проточном цитофлуоритме FACSCantoII (Becton Dickinson, США).
В каждой пробе анализировали до 10 000 событий. Анализируемый гейт устанавливали на основании комбинации светорассеивания и размера клеток.
Результаты и обсуждение
Классические подходы (химиотерапия и радиотерапия) в случае меланомы дают менее выраженные эффекты, чем в других опухолях: метастазы меланомы практически резистентны к такой терапии. Лекарственная устойчивость остается одной из основных причин клинического прогрессирования меланомы. Именно это свойство ОК обусловливает трудность лечения этой когорты больных: опухоль нечувствительна к химиотерапии независимо от комбинирования применяемых лекарств. Если при этом исчерпаны возможности других видов специального лечения - хирургического и лучевого - болезнь вступает в терминальную стадию.
Исследования молекулярных событий, лежащих в основе патогенеза меланомы, дают огромный материал для разработки подходов к воздействию на эти процессы [21-24]. Однако сегодня меланома по-прежнему остается резистентной и к химиотерапии, и к радиотерапии.
Целью данной работы явилось создание модельной клеточной линии меланомы, резистентной к ДНК-алкилирующим агентам для расширенного поиска и скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и веществ, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоп-тоза в резистентных к терапии клетках меланомы.
В качестве основы получения резистентных к аранозе клеток использовали культуру умеренно дифференцированных клеток меланомы Mel Il. Методом МТТ-теста по кривым «доза-эффект» были определены значения IC50, т.е. дозы аранозы, при которых погибало 50 % клеток меланомы. Основываясь на данных литературы о получении клеток, резистентных к тем или иным препаратам, к клеткам меланомы в логарифмической фазе роста добавляли аранозу в полной среде RPMI-1640 в дозе 1/3xIC50 [24]. Через 24 ч инкубации с аранозой среду заменяли на свежую, без аранозы, для восстановления устойчивого роста. Нормальная кинетика роста клеток восстанавливалась через 15-18 дней культивирования. Выжившие клетки вновь инкубировали 24 ч в среде с аранозой, повысив ее концентрацию в два раза; и далее две недели в среде без аранозы. Третий и четвертый циклы селекции выполнены аналогично, но концентрация аранозы в среде составляла 4/3 и 4XIC50. Количественный анализ апоптотических клеток проводили методом двойного прижизненного окрашивания Annexin V-FITC в комбинации с Р! Метод позволяет разделить и количественно охарактеризовать ранний и поздний апоптоз, а также некроз. Представленные в табл. 1 данные указывают на тот факт, что резистентные клетки Mel IlR практически не вступают в процесс апоптоза через 24 ч инкубации при концентрации аранозы 4xIC50 (5,2±1,1), в отличие от клеток линии "дикого" типа Mel Il/WT (24,7±3,2%, 0,5xIC50). Клетки Mel IlR оказались менее требовательны к условиям культивирования. Уровень спонтанного апоптоза клеток Mel IlR не превышал 5 %, в то время как в тех же условиях 810 % клеток "дикого "типа" были подвержены спонтанной гибели (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная характеристика апоптоза, индуцированного аранозой и стрептозотоцином в клеточных линиях Mel Il/WT и Mel IlR
Таблица 2
Сравнительная характеристика иммунологического фенотипа клеточных популяций линий Mel Il/WT и Mel IlR.
Клетки Mel IlR были способны длительное время (5 дней) оставаться без субкультивирования и смены среды. Следует отметить, что клетки Mel IlR были резистентны также к стрептозотоцину, другому ДНК-алкилирующему агенту: при концентрации стрептозотоцина 4*IC50 наблюдалось всего лишь 4,8±1,3 % апоптотических клеток (табл. 1). Таким образом, методом искусственной стимуляции апоп-тоза аранозой нами получена стабильная клеточная линия, сохраняющая морфологические признаки родительской линии, но резистентная к индукции апоптоза ДНК-алкилирующими агентами.
Иммунофенотипы клеток меланомы Mel Il/WT и Mel IlR определяли методом цитофлуориметриче-ского анализа. Нас интересовали изменения в экспрессии антигенов дифференцировки меланоцитов, молекул клеточной адгезии, экспрессии СD117 и маркеров СКМ в резистентных клетках по сравнению с родительским фенотипом. Потеря экспрессии тканеспецифического антигена CD63, который в норме обнаруживается в меланоцитах [25], в три раза по сравнению с «диким» типом указывало на повышение агрессивности резистентных клеток. Экспрессия СD54, молекулы адгезии, осуществляющую интегрин-опосредованную коммуникацию клеток, в резистентных клетках снижалась в 86 раз. Поскольку метастатические клетки меланомы практически негативны по СD54 [26], резкое снижение экс-
прессии СБ54 в резистентных к аранозе клетках указывало на то, что клетки перешли в фазу инвазивно-го роста. Подтверждением этого заключения явилось снижение в 460 раз экспрессии CD 117 в резистентных клетках Mel IlR. СD117 или c-Met, или "scatter factor", интернализуемый рецептор эктодермального происхождения, является рецептором стволового фактора роста. Ранее было показано, что метастатическая меланома не экспрессирует СD117, в то время как первичная опухоль может быть положительной по этому антигену [27].
Еще одним подтверждением селекции популяции высоко агрессивных клеток меланомы в условиях искусственной стимуляции апоптоза аранозой служило снижение экспрессии СD105 в резистентных клетках в 2,5 раза (табл. 2). Экспрессия CD105, или эндоглина, на ОК ассоциируется с цитоскелет-ными реорганизациями клетки [28].
Чрезвычайно интересным нам представлялось проследить изменения в экспрессии маркеров СКМ в резистентных к аранозе клетках меланомы. До недавнего времени предполагалось, что все клетки ме-ланомы обладают одинаковой способностью инициировать опухоль и формировать метастазы. Сегодня достоверно показано, что такими свойствами обладает небольшая популяция особых самообновляющихся клеток опухоли, называемых стволовыми [29]. Именно эта клеточная популяция меланомы наиболее агрессивна и инициирует опухоль.
Такие клетки обладают значительной устойчивостью к практически всем видам используемой химиотерапии. На сегодняшний день обнаружено и охарактеризовано несколько поверхностных маркеров СКМ: CD20, CD133, CD271 и ABCB5 [30,31]. В резистентных к аранозе клетках меланомы не экс-прессировался ни один из перечисленных маркеров СКМ (табл. 2).
В развитии резистентности клеток меланомы к аранозе свой вклад могли внести и маркеры злокачественности, характерные для других типов опухолей. В частности, мы следили за изменениями в экспрессии СD24, участвующего в злокачественном перерождении клеток за счёт привлечения в мембрану киназ Src-семейства и активации сигнального пути MAPK [32] и СD44-интегрального клеточного гликопротеина, играющего важную роль в клеточной адгезии и миграции [33]. Резистентные клетки меланомы, также как и клеток родительского типа, не экспрессировали ни один из этих белков (ibid.). Аналогичная закономерность наблюдалась и с экспрессией СD90 - маркера мезенхи-мальных стволовых клеток [34]. Основная функция экспрессии этого антигена сводится к взаимодействиям ОК с внеклеточным матриксом. Становилось очевидным, что по мере приобретения резистентности к ДНК-алкилирующим агентам клетки меланомы теряли тка-не-специфичные антигены и резко снижали экспрессию CD54, c-Met и СD90. Подобный сценарий может реализоваться при переходе клеток в агрессивную фазу роста - «phenotype switching". Последовательное повышение дозы аранозы, направленное на утрату клетками программы клеточной гибели, привело к селекции популяции клеток меланомы, существенно отличающих их от родительской линии.
Время инкубации клеток Mel Il/WT Mel IlR
% апоптотических клеток
Интактный контроль, 24 ч 8±2 4±1
Араноза, 1*IC50, 24 ч 24±3 5±1
Араноза, 4*IC50, 24 ч - 5±1
Стрептозотоцин, 4*IC50, 24 ч - 4±1
Антиген Доля антигенположительных клеток, %
Mel Il/WT Mel IlR
CD54 69±8 0,8±0,1
CD24 0,1±0,05 0,1±0,05
CD44 99±11 99±11
CD63 10±2 3±1
CD 105 83±5 31±3
CD20 1,0±0,05 1,1±0,05
CD 117 90±10 0,2
CD133 0,4±0,05 0,7±0,05
CD271 0,2±0,05 0,2±0,05
ABCB5 0,4±0,05 0,2±0,05
Рис. 1. Формирование СПС клетками меланомы:
А - клетки Mel II дикого типа не формируют СПС на Матригеле; В - резистентные к аранозе Mel IlR клетки способны к организации в СПС;
С - соединение ЛХС1269 в концентрации 1*10"7М блокирует формирование СПС резистентными Mel IlR клетками. Увеличение *10.
Рис. 2. Распределение опухолевых клеток Mel IlR, окрашенных Annexin V-FITC/PI по флуоресценции:
А - контроль, клетки росли без добавления цитотоксического препарата;
В - клетки инкубировали в течение 15 мин с 1х 10"7М соединения ЛХС1269, а затем добавляли 1xIC50 аранозы. Апоп-тоз детектировали через 48 ч.
С - клетки инкубировали в течение 15 мин с 1х10-7М соединения ЛХС1269, а затем добавляли 1xIC50 стрептозотоци-на. Апоптоз детектировали через 48 ч.
Наблюдалось:
1. снижение экспрессии CD54, c-Met, CD63 и СD90,
2. клетки оказались резистентны к индуцирующим апоптоз алкилирующим агентам - аранозе и стрептозотоцину.
Ранее нами показано, что диссеминированная меланома, также как и увеальная меланома, может приобретать некоторые эндотелий-подобные характеристики при росте на Матригеле™ и вовлекаться в ВМ [17].
Биомеханическая способность клеток мела-номы формировать СПС зависела от индивидуальных характеристик ОК и ее инвазивного потенциала. Анализ фенотипа резистентных к ДНК-алкилирующим агентам клеток меланомы Mel IlR позволил нам предположить, что они могут формировать СПС на Матригеле™.
Первые же эксперименты подтвердили возможность реализации нашей гипотезы. В отличие от клеток "дикого" типа, клетки Mel IlR формировали на Матригеле™ СПС. Эти структуры были стабильны в течение 18-20 ч (рис. 1, А-B).
Целью следующей части работы стало исследование поведения резистентных к ДНК-алкилирующим агентам клеток меланомы в ответ на цитотоксический агент в условиях блокирования ВМ. Соединение ЛХС1269, блокатор ВМ, было отобрано нами при скрининге ряда индолкарбазолов на их способность ингибировать формирование СПС на Матригеле™ [35]. Когда резистентные клетки росли в присутствии соединения ЛХС1269, они полностью теряли способность к коммуникации, необходимую для формирования СПС (рис. 1, В). Далее к клеткам Mel IlR в стадии экспоненциальной фазы роста добавляли 1 10-7М (не цитотоксическая концентрация) соединения ЛХС1269 и инкубировали в течение 15 мин в полной среде RPMI 1640 при +37 0С в атмосфере 5 % CO2. Затем к клеткам добавляли аранозу и стрептозотоцин при концентрации 1XIC50 и определяли количество апоптотических клеток. Доля клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, являющаяся критерием интенсивности апоптоза, в присутствии соединения ЛХС1269 достигала 18±1% к 24 ч культивирования резистентных клеток и возрастала до 31±3 % к 48 ч инкубации клеток с аранозой и
16±1 % и 38±3 % со стрептозотоцином, соответственно (рис. 2, А-В). В резистентных клетках без бло-катора ВМ процент апоптотических клеток оставался на уровне интактного - 5,7±1,1 % при 48 ч инкубации с 2*1С50 аранозы или стрептозотоцина. Представленные результаты позволяют заключить, что соединение ЛХС1269 восстанавливает чувствительность резистентных клеток меланомы к апоптозу, индуцированному ДНК-алкилирующими агентами. Становится очевидным, что свой вклад в становление лекарственной резистентности вносят взаимодействия клеток с высокозлокачественным фенотипом друг с другом, а также со стромальным микроокружением.
Как отмечалось ранее, лекарственная устойчивость может определяться включением различных биологических систем, контролирующих разные этапы токсического действия химиопрепарата. Понятно, что преодолеть лекарственную резистентность, вызванную функционированием нескольких систем защиты клетки, используя лишь один специфический ингибитор невозможно. Неэффективность такого подхода при лечении резистентных опухолей уже неоднократно демонстрировалась в клинических исследованиях. На наш взгляд, успешным может оказаться воздействие на характеристику, общую
для большинства злокачественных новообразований. Тот факт, что ВМ встречается в различных типах агрессивных опухолей - при раке молочной железы, простаты, яичника, легкого, почки, саркоме мягких тканей, а также при онкогематологических заболеваниях - говорит о том, что, по всей видимости, мы имеем дело с новой характеристикой агрессивной опухоли. Мы не исследовали в деталях мишени, на которые действует соединение ЛХС1269, восстанавливая чувствительность резистентных клеток мела-номы к ДНК-алкилирующим агентам. Мы также не подтверждали полученные in vitro результаты в модели меланомы на экспериментальных животных. Тем не менее, полученные нами результаты по преодолению лекарственной резистентности при блокировании ВМ позволяют рассматривать вопрос о возможности нового терапевтического подхода в лечении меланомы.
Авторы благодарят Красильникова М.А. и Блохина Д.Ю. за ценные советы и помощь в обсуждении полученных результатов.
Работа выполнена при поддержке Государственного контракта № 13411.1008799.13.120 от 24 июня 2013г.
Список литературы
1. Housman G., Byler S., Heerboth S. Drug resistance in cancer: an overview //Cancers (Basel). - 2014. - Vol 6, N 3. - P. 1769-1792.
2. Kathawala R.J., Gupta P., Ashby C.R. The modulation of ABC transporter-mediated multidrug resistance in cancer: a review of the past decade //Drug Resist Updat. -2015. -Vol. 18. - P. 1-17.
3. Choi Y.H., Yu A.M. ABC transporters in multidrug resistance and pharmacokinetics, and strategies for drug development //Curr Pharm Des. - 2014. - Vol 20, N 5. - P. 793-807.
4. O'Grady S., Finn S.P., Cuffe S. The role of DNA repair pathways in cisplatin resistant lung cancer // Cancer Treat Rev. - 2014. - Vol 40, N 10. - P. 1161-1170.
5. Guillotin D., Martin S.A. Exploiting DNA mismatch repair deficiency as a therapeutic strategy //Exp Cell Res. - 2014. - Vol 329, N 1. - P. 110-115.
6. Kartal-Yandim M., Adan-Gokbulut A., Baran Y. Molecular mechanisms of drug resistance and its reversal in cancer //Crit Rev Biotechnol. - 2015. - Vol 11. - P.1-11.
7. Kamal A., Faazil S., Malik M.S. Apoptosis-inducing agents: a patent review (2010 - 2013) //Expert Opin Ther Pat. - 2014. - Vol 24, N 3. - P. 339-354/
8. Barnhill R.L., Fine J.A., Roush G.C. Predicting five-year outcome for patients with cutaneous melanoma in a population-based study. // Cancer 1996. Vol 78. - P. 427-432.
9. Rother J., Jones D. Molecular markers of tumor progression in melanoma // Curr Genomics. - 2009. - Vol 10, N 4. - P. 231-239.
10. Hussein M.R. Genetic pathways to melanoma tumorigenesis // J Clin Pathol. - 2004. - Vol 57, N 8. - P. 797801.
11. maniotis a.j., folberg r., hess a. vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vas-culogenic mimicry. // am j pathol. 1999. vol 155, n 3. p. 739-752.
12. sun b., zhang d., zhan s. hypoxia influences vasculogenic mimicry channel formation and tumor invasion-related protein expression in melanoma // cancer . 2007. vol 249. p. 188-197.
13. paulis y.w., soetekouw p.m., verheul h.m. signalling pathways in vasculogenic mimicry. // biochim biophys acta. 2010. vol 1806, n 1. p. 18-28.
14. fan, y., sun, w. molecular regulation of vasculogenic mimicry in tumors and potential tumor-target therapy //world j gastrointest. - 2010. - vol 2, n 4. - p. 117-127.
15. михайлова и.н., лукашина м.и., барышников а.ю. клеточные линии меланомы как основа для получения вакцин //вест росс аккад мед наук. - 2005. - vol 7. - p 37-40.
16. bellamy w.t. prediction of response to drug therapy of cancer. a review of in vitro assays//drugs. - 1992. -vol 44, n 5. - p. -:690-708.
17. vartanian а.а., burova o.s., stepanova e.v. the involvement of apoptosis in melanoma vasculogenic mimicry //mel res. - 2007. - p. 1-7.
18. vermes i, haanen c, steffens-nakken h, reutelingsperger c. a novel assay for apoptosis. flow cytometric detec-
tion of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin v. //j immunol methods. - 1995. - vol 18, n4. - p. 39-51.
19. serke s., van lessen a., huhn d. quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence // cytometry. - 1998. - vol 33, n 2. - p. 179-187.
20. Verez, N.F., Tsao H. Pathways to melanoma. // Semin Cutan Med Surg.—2010.—Vol. 29, N 4.—P. 210-217.
21. Meier F. Schittek S. Burchet K The RAS/RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways present molecular targets for effective treatment of advanced melanoma //Front Biosci.—2005.—Vol. 10.—P. 2986-3001.
22. Roring, M., Brummer T. Aberrant B-RAF signaling in melanoma. // Crit Rev Oncol.—2012.—Vol. 17, N 1.— P. 97-121.
23. Populo H., Soares P., Lopes J.M. Insight into melanoma: targeting mTOR pathway for therapeutics //Expert Opin Ther Targets.—2012.—Vol. 16, N 7.—P. 689-705.
24. philchenkov a., zavelevich m., savinska l. jurkat/a4 cells with multidrug resistance exhibit reduced sensitivity to quercetin //exp oncol. - 2010. - vol 32, n 2. - p. 76-80.
25. ordonez n.g. value of melanocytic-associated immunohistochemical markers in the diagnosis of malignant melanoma: a review and update //hum pathol. - 2014. - vol 45, n 2. - p. 191-205.
26. weishaupt c., munoz k.n., buzney e. t-cell distribution and adhesion receptor expression in metastatic melanoma //clin cancer res. - 2007. - vol 13, n 9. - 2549-2556.
27. sviatoha v, kleina r, tani e skoog l. expression of the cd117, cox-2 and hsp90 antigens and cell proliferation in fine-needle-aspirated cells from metastatic melanomas // anticancer res/ - 2009. - vol 29, n 11. - p. 4345-4352.
28. sanz-rodriguez f., guerrero-esteo m., botella l.m. endoglin regulates cytoskeletal organization through binding to zrp-1, a member of the lim family of proteins //the journal of biological chemistry. - 2004. - vol 279, n 31. -p.32858-32868
29. Murphy G.F., Wilson B.J., Girouard S.D. Stem cells and targeted approaches to melanoma cure //Mol Aspects Med. - 2014. - Vol 39. - P. 33-49.
30. fang d., nguyen t.k., leishear k. a tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas /dancer res. - 2005. - vol 65, n 20. - p. 9328-9337.
31. klein w.m., wu b.p., zhao s. increased expression of stem cell markers in malignant melanoma //mod pathol. -2007. - vol 20, n 11, - p.102-107.
32. fang x., zheng p., tang j., liu y. cd24: from a to z// cell mol immunol — 2010.— vol. 7, n 2.— p. 100—103.
33. williams k., motiani k., giridhar p. v., kasper s. cd44 integrates signaling in normal stem cell, cancer stem cell and (pre)metastatic niches// exp biol med (maywood).— 2013. — vol. 238, n 3.— p. 324—338.
34. rege t.a., hagood j.s. cd90 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apop-tosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis// faseb j. - 2006. - vol 20, n 8. -p. 1045-1054.
35. вартанян а, барышникова м. эктова л. производные индолкарбазолов, блoкирующие васкулогенную мимикрию в опухоли //патент рф №2557554. - бюлл №21, 2015.
