CC BY
0
на генотоксичность в мозге и печени и на экспрессию генов, регулирующих метаболизм жирных кислот, у мышей / В. Г. Хорольская, А. П. Гуреев, Е. А. Шафоростова [и др.] // Биомедицинская химия. - 2019. - Т. 65. - № 5. -С.388-397.
4. Шабанов Д. И. Исследование влияния митомицина на уровень повреждений мито-хондриальной ДНК у мышей in vivo / Д. И. Шабанов, Г. А. Востроилова, Е. В. Михайлов [и др.] // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2023. - № 2(23). - С. 12-23.
5. Шлапакова Т. И. Активные формы кислорода: участие в клеточных процессах и развитии патологии / Т. И. Шлапакова, Р. К. Костин,
Е. Е. Тягунова // Биоорганическая химия. -2020. - Т. 46, № 5. - С. 466-485.
6. Gureev A. P. Simplified qPCR method for detecting excessive mtDNA damage induced by exogenous factors / A. P. Gureev, E. A. Shaforostova, A. A. Starkov, V. N. Popov // Toxicology. - 2017. -Vol. 382. - P. 67-74.
7. Jain A. K. In Vivo Micronucleus Assay in Mouse Bone Marrow / A. K. Jain, A. K. Pandey // Methods Mol Biol. - 2019. - 2031. P. 135 - 146.
8. Lehle S. LORD-Q: a long-run real-time PCR-based DNA-damage quantification method for nuclear and mitochondrial genome analysis / S. Lehle, D. G. Hildebrand, B. Merz [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol. 42(6). - P. e41.
DOI: 10.48612/sbornik-2024-1-73 УДК 57.084.1:616-006.6:619
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГИДРОФИЛЬНОЙ КРИОФРАКЦИИ СЕЛЕЗЁНКИ НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ КЛЕТОК МЫШЕЙ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА
Шабанов Дмитрий Игоревич Востроилова Галина Анатольевна, д-р. биол. наук Хохлова Нина Алексеевна, канд. вет. наук Корчагина Анастасия Андреевна, канд. вет. наук Морозова Диана Дмитриевна Некрасов Артём Валерьевич
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии, г. Воронеж, Российская Федерация
Нами было изучено влияние фармакологической субстанции, полученной из гидрофильной криофракции селезенки КРС, на цитогенетическую стабильность мышей с асцитной карциномой Эрлиха (АКЭ) в условиях противоопухолевой терапии антрациклиновым антибиотиком - доксорубицином. В ходе работы была определена частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, доля полихроматофильных эритроцитов в костном мозге животных-опухоленосителей и продолжительность их жизни. Совместное введение доксорубицина и гидрофильной криофракции селезенки КРС индуцировало снижение частоты микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей на 28,2 % относительно мышей с АКЭ, которые получили только противоопухолевый препарат. При этом отдельное введение гидрофильной криофракции селезенки КРС животным с АКЭ индуцировало значимое увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей на 68,81 %, что делает её перспективным объектом исследований в целях снижения побочных эффектов при химиотерапии животных со злокачественными опухолями.
Ключевые слова: гидрофильная криофракция селезёнки; генетическая стабильность; доксорубицин; асцитная карцинома Эрлиха; белые лабораторные мыши
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00034, https://rscf.ru/project/24-26-00034/
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF HYDROPHILIC CRYO FRACTION OF THE SPLEEN ON THE GENETIC STABILITY OF TUMOR-BEARING MOUSE CELLS UNDER THE CONDITIONS
OF DOXORUBICIN USE
Shabanov Dmitriy Igorevich Vostroilova Galina Anatolyevna, Dr. Biol. Sci. Khokhlova Nina Alekseevna, PhD Vet. Sci. Korchagina Anastasiya Andreevna, PhD Vet. Sci. Morozova Diana Dmitrievna Nekrasov Artem Valeryevich
All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy, Voronezh, Russian Federation
We studied the effect of a pharmacological substance derived from the hydrophilic cryoprecipi-tate of the spleen in cattle on the cyto-genetic stability of mice bearing ascitic Ehrlich carcinomas (ACE) in the context of antitumor treatment with the anthracycline antibiotic, doxorubicin. During the study, we determined the frequency of poly-chromatophilic red blood cells with micronuclei, the percentage of polychromatophilic cells in the bone marrow of tumor-bearing mice, and their life expectancy. The combination of doxorubicin and the hydrophilic fraction of the bovine spleen induced a reduction in the number of micronucleated polychromatophilic red blood cells in the bone marrow by 28.2% relative to mice with ACE treated with only the antitumor agent. At the same time, administering a separate hydrophilic cryoprecipitate fraction of the spleen to animals with ACE significantly increased the life expectancy of tumor-bearing animals, by 68.81%. This makes it a promising subject for research in order to minimize side effects during chemotherapy for animals with malignant tumors.
Key words: hydrophilic cryo fraction of the spleen; genetic stability; doxorubicin, ascitic carcinoma of Ehrlich; white laboratory mice
The research was carried out at the expense 00034, https://rscf.ru/project/24-26-00034/
Химиотерапия является одним из основных методов лечения рака у людей и животных. Однако применение химиотерапев-тических препаратов может оказать не только противоопухолевое воздействие, но и вызвать негативные побочные эффекты на организм в целом. Один из таких побочных эффектов - нарушение цитогенетической стабильности клеток, что может привести к генетическим изменениям в клетках организма, развитию патологий и изменению чувствительности опухоли к терапии [9].
Одним из подходов, сохранения стабильности генома является применение лекарственных средств с антимутагенным действием, которые способны улучшить цитоге-нетическую стабильность клеток. Эти средства могут влиять на различные механизмы поддержания генетической целостности, такие, как репарация ДНК, регуляция клеточного цикла и антиоксидантная активность [7]. Одним из перспективных составов, обладающих антимутагенным и антиоксидантным
of a grant Russian Science Foundation No. 24-26-
действием является гидрофильная крио-фракция селезенки КРС (ГКСК), способная оказывать антиоксидантное действие [2]. Из-за ограниченного количества клинических исследований по влиянию антиоксидантов на моделях лечения злокачественных опухолей [4], в настоящее время не существует устоявшегося консенсуса по эффективности их применения в противоопухолевой терапии, поскольку антиоксиданты могут снижать эффективность химиотерапии, предотвращая гибель раковых клеток в результате воздействия активных форм кислорода (АФК) [3]. Однако другие экспериментальные исследования показали, что витамины-антиоксиданты и некоторые вещества биологического происхождения избирательно вызывают апоптоз в раковых, но не в нормальных клетках, а также предотвращают ангио-генез и распространение метастаз [4]. Кроме того, была отмечена повышенная эффективность многих химиотерапевтических агентов, а также снижение токсических побочных эф-
фектов при совместном приёме химиотера-певтических препаратов с антиоксидантами
[3], что позволяет предположить потенциальную роль антиоксидантов в качестве вспомогательных средств при терапии рака
[4].
Многие химиотерапевтические агенты могут вызывать устойчивую ремиссию у значительного количества онкологических больных. Среди таких препаратов антрацик-линовый антибиотик - доксорубицин, считающийся одним из наиболее эффективных противоопухолевых средств. Однако его побочные эффекты, такие как миелосупрессия, гепатотоксичность, нефротоксичность и, особенно, кардиомиопатия, связанные с окислительным повреждением нормальных клеток, могут ограничивать его клиническое применение в терапии. Следовательно, развитие терапевтических стратегии снижения токсичности химиотерапии представляют собой большой интерес в исследованиях онкологических заболеваний человека и животных [5].
Поэтому целью данной работы явилось исследование влияния гидрофильной крио-фракции селезенки крупного рогатого скота на цитогенетическую стабильность костного мозга мышей-опухоленосителей в условиях противоопухолевой терапии антрациклино-вым антибиотиком - доксорубицином.
Методика исследований. Работа была выполнена в соответствии с требованиями действующих международных и российских
После эвтаназии изготавливали препараты костного мозга, которые окрашивали по Романовскому-Гимзе. Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа Микромед-3 (Микромед, Китай) при увеличении х1000 [1].
законодательных актов и «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [1], а также комиссии по биоэтике института. Исследования проводили на здоровых белых беспородных самцах белых лабораторных мышей разведения вивария ФГБНУ «ВНИВИПФиТ». В качестве противоопухолевого препарата использовали доксорубицин (Доксорубицин-Ферейн®, ПАО «Брынцалов-А», РФ) Объектом исследования служила гидрофильная криофракция селезенки крупного рогатого скота, полученная в лаборатории доклинических исследований и моделирования биологических систем ФГБНУ «ВНИВИПФиТ».
В качестве экспериментальной опухолевой модели использовали асцитную карциному Эрлиха (АКЭ), которую перевивали путем инъекции в перитонеальную полость семидневной суспензии опухолевых клеток в количестве 3x106 на мышь, разведенных до 0,5 мл раствором Хэнкса (рН 7,4).
В экспериментальной работе было сформировано 4 группы белых беспородных самцов мышей массой 25,0±2,0 г по п=12 в каждой. Дизайн эксперимента представлен в таблице 1. На 10 сутки опухолевого роста по 6 животных из каждой группы эвтанизировали путем передозировки СО2 для получения образцов тканей. За остальными животными вели наблюдение в течение 50 дней для определения продолжительности их жизни.
Для оценки эффективности противоопухолевой терапии получали кривые выживаемости мышей (кумулятивной доли выживших) Каплана-Майера, группы сравнивали с помощью Лог-ранк теста. и-тест Майна-Уитни применяли для сравнения других ис-
Таблица 1 - Дизайн экспериментальной работы
Экспериментальные группы Препараты и условия применения
I Клетки АКЭ 3-106 кл/мл интраперитонеально в объеме 0,5 мл.
II Клетки АКЭ 3-106 кл/мл интраперитонеально в объеме 0,5 мл. Доксорубицин 3,5 мг/кг интраперитонеально на 2 и 4 сут в объеме 0,2 мл
III Клетки АКЭ 3-106 кл/мл интраперитонеально в объеме 0,5 мл. Гидрофильная криофракция селезенки КРС 0,5 мл/кг внутримышечно на 2 и 4 сут в объеме 0,2 мл
IV Клетки АКЭ 3-106 кл/мл интраперитонеально в объеме 0,5 мл. Доксорубицин 3,5 мг/кг интраперитонеально и гидрофильная криофракция селезенки КРС 0,5 мл/кг внутримышечно на 2 и 4 сут в объеме 0,2 мл
следуемых показателей между группами животных, с помощью программы STATISTICA 10 (Statsoft, USA). Различия между группами считали значимыми при p<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе исследования нами были определены частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (MNPCE) и отношение полихроматофильных эритроцитов к нормохромным (PCE/NE) в костном мозге мышей исследуемых групп (рис. 1). На 10 сут-
А
ки опухолевого роста частота MNPCE в костном мозге мышей с АКЭ (группа I) составила 0,89±0,09 %. Введение доксорубицина (группа II) и ГКФСК (группа III) по отдельности не приводило к значимому изменению частоты MNPCE относительно группы I. При этом совместное применение доксорубицина и ГКФСК (группа IV) индуцировало значимое снижение частоты MNPCE на 37,1; 28,2 и 42,3 % относительно групп I, II и III соответственно. Частота MNPCE в группе IV составила 0,56±0,06 %.
MNPCE, %
1,4
1,2
1
0,8 ■
0,6 ■
0,4 ■
0,2 ■
0
PCE/NE, % 60
111
*
1
50 40 30 20 10 0
Б
■III
III
IV
III
IV
Рисунок 1 - Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (А) и отношение полихроматофильных эритроцитов к нормохромным (Б) в костном мозге мышей, исследуемых групп: I-V - экспериментальные группы; МЯПХЭ - частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, %; PCE/NE - отношение полихроматофильных эритроцитов к нормохромным; *- статистически значимое отличие от группы I при p<0,05; M±SE - среднее арифметическое ±
стандартная ошибка
Доля ПХЭ в костном мозге у мышей группы I составила 38,85±0,31 %. Применение доксорубицина отдельно (группа II) и вместе с исследуемой субстанцией (группа IV) не приводило к статистически значимым изменениям в содержании ПХЭ в костном мозге мышей с АКЭ. Так доля ПХЭ составила 40,12±1,06 и 39,12±0,24 % в группе II и IV соответственно. При этом отдельное введение
о Complete -i- Censored
ГКСК индуцировало повышение PCE/NE на 16,1 % относительно мышей из группы I до 45,12±3,70 %.
Для оценки эффективности противоопухолевой терапии нами были построены кривые выживаемости Каплана-Маера мышей с АКЭ, а также определены средние сроки жизни животных.
л m в; № X
m s
I-
&
s
£
f Ï
I _ 1 ---- г !
*
*i 1
< J V
< { 1 A.....
,,, J h
* ! 1 i О it
< <t
*
20 25 30 35
Время, сут
— IV
Рисунок 2 - Кривые выживаемости Каплана-Майера мышей с АКЭ; I—IV - исследуемые группы
*
II
II
Средняя продолжительность жизни мышей с АКЭ (группа I) составила 19,67±2,02 сут. Продолжительность жизни в группах II и III статистически значимо возрастала на 56,78 и 68,81 % соответственно относительно группы I. При этом в группе IV, хотя, средняя продолжительность жизни мышей и составляла 27,33±3,18 сут., статистически значимых отличий в выживаемости мышей относительно животных группы I выявлено не было.
Таким образом, отдельное применение противоопухолевого препарата и ГКСК приводило к увеличению продолжительности мышей с АКЭ, вероятно, за счет опухолестата-тического действия доксорубицина и имму-номодулирующего действия ГКСК [2, 6]. Отсутствие такого эффекта при комбинации этих веществ в группе IV, возможно, связано с антиоксидантным снижением ГКСК свобод-норадикального стресса, индуцированного доксорубицином [3]. Вместе с тем, снижение частоты MNPCE в костном мозге мышей группы IV может свидетельствовать об антимутагенном действии ГКСК, которое проявлялось при совместном введении с доксорубицином. При этом, поскольку отдельное введение ГКСК при относительно большом уровне MNPCE не приводило к изменению частоты MNPCE, антимутагенный эффект ГКСК проявлялся по отношению к доксорубицину, что, вероятно, может быть связано с механизмом повреждения ДНК ксенобиотиком. Увеличение PCE/NE у мышей из группы III относительно животных с АКЭ может свидетельствовать о стимуляции гемопоэза и, вероятно, о снижении токсического действия на организм со стороны опухоли [8].
Выводы. Введение животным-опухоленосителям гидрофильной криофрак-ции селезенки КРС индуцировало увеличение гемопоэза в костном мозге мышей, которое сопровождалось увеличением продолжительности жизни животных. В ходе экспериментов обнаружено снижение частоты микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей с асцитной карциномой Эрлиха в условиях сочетанной химиотерапии животных доксобубицином и фармакологической субстанцией, полученной из гидрофильной криофракции селезенки КРС, что делает её перспективным объектом исследований в целях снижения побочных эффектов при химио-
терапии животных со злокачественными опухолями.
Список литературы
1. Миронов А. Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К. - 2012. -944с.
2. Шабунин С. В. Антикластогенная активность аминоселетона при воздействии цик-лофосфамида на костный мозг мышей / С. В. Шабунин, Г. А. Востроилова, П. А. Паршин [и др.] // Сельскохозяйственная биология. -2021. - Т. 56. - № 4. - С. 763-771.
2. Akbas H. S. Concurrent use of antioxidants in cancer therapy: an update / H. S. Akbas, M. Ti-mur, T. Ozben // Expert Review of Clinical Immunology. - 2006. - №2 (6). - pp. 931-939.
3. Borek C. Dietary antioxidants and human cancer. Integrative Cancer Therapies. - 2004. -№3(4). - Р. 333-341.
4. Miranda-Vilela A. L. Oil rich in carotenoids instead of vitamins C and E as a better option to reduce doxorubicin-induced damage to normal cells of Ehrlich tumor-bearing mice: hematological, toxicological and histopathological evaluations / A.L. Miranda-Vilela, C.K. Grisolia, J.P.F. Longo [et al.] // Journal of Nutritional Biochemistry. - 2014. - №25 (11). - Р. 1161-1176.
5. Chanan-Khan A. A. Pegylated liposomal doxorubicin and immunomodulatory drug combinations in multiple myeloma: rationale and clinical experience / A. A. Chanan-Khan, K. Lee // Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia - 2007. - Suppl. 4. - Р. 163-169.
6. Sloczyñska K. Antimutagenic compounds and their possible mechanisms of action / K. Sloczyñska, B. Powroznik, E. P^kala [et al.] // Journal of Applied Genetics. 2014. - №55. - Р. 273-285.
7. Suzuki Y. The micronucleus test and eryth-ropoiesis. Effects of erythropoietin and a muta-gen on the ratio of polychromatic to normochro-matic erythrocytes (P/N ratio) / Y. Suzuki, Y. Na-gae, J. Li, H. Sakaba, K. Mogawa, A. Takahashi, H. Shimizu // Mutagenesis. - 1989. - №4(6). - Р. 420-424.
8. Vargas-Rondón N. The Role of Chromosomal Instability in Cancer and Therapeutic Responses / N. Vargas-Rondón, V. E. Villegas, M. Rondón-Lagos // Cancers. - 2018. - №10. - Р. 4.
