CC BY
14
Для корреспонденции
Багрянцева Ольга Викторовна - доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии
и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания
и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания
и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Минздрава России (Сеченовский Университет)
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский
проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-54-05
E-mail: bagryantseva@ion.ru
https://orcid.org/00 0 0-0003-3174-2675
Багрянцева О.В.1, 2, Гмошинский И.В.1, Шипелин В.А.1, Шевелева С.А.1, Ригер Н.А.1, Шумакова А.А.1, Ефимочкина Н.Р.1, Маркова Ю.М.1, Цурикова Н.В.1, Смотрина Ю.В.1, Соколов И.Е.1, Колобанов А.И.1, Хотимченко С.А.1, 2
Оценка влияния ферментного препарата -комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из Aspergillus awamori Xyl T-15 на микробиом кишечника и иммунологические показатели крыс
Assessment of the influence of an enzymal preparation - a complex of glucoamylase and xylanase from Aspergillus awamori Xyl T-15 on the intestinal microbiom and immunological indicators of rats
Bagryantseva O.V.1 2, Gmoshinski I.V.1, Shipelin V.A.1, Sheveleva S.A.1, Riger N.A.1, Shumakova A.A.1, Efimochkina N.R.1, Markova Yu.M.1, Tsurikova N.V.1, Smotrina Yu.V.1, Sokolov I.E.1, Kolobanov A.I.1, Khotimchenko S.A.1, 2
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема Минобрнауки России № 0529-2019-0057). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Багрянцева О.В., Хотимченко С.А.; постановка эксперимента, сбор и обработка материала - Гмошинский И.В., Багрянцева О.В., Шипелин В.А., Шевелева С.А., Ригер Н.А., Шумакова А.А., Ефимочкина Н.Р., Маркова Ю.М., Цурикова Н.В., Смотрина Ю.В., Соколов И.Е., Колобанов А.И.; статистическая обработка данных - Гмошинский И.В.; написание текста, редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - Багрянцева О.В., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А.
Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам ВНИИПБТ - филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Косты-левой Е.В., Середе А.С., Великорецкой И.А., Игнатовой Н.И. за предоставление опытной партии ферментного препарата, использованной при проведении исследований.
Для цитирования: Багрянцева О.В., Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Шевелева С.А., Ригер НА., Шумакова А.А., Ефимочкина Н.Р., Маркова Ю.М., Цурикова Н.В., Смотрина Ю.В., Соколов И.Е., Колобанов А.И., Хотимченко С.А. Оценка влияния ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из Aspergillus awamori Xyl T-15 на микробиом кишечника и иммунологические показатели крыс // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 3. С. 42-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-3-42-52 Статья поступила в редакцию 08.04.2022. Принята в печать 04.05.2022.
Требования безопасности пищевой продукции, получаемой путем микробного синтеза, на сегодняшний день включают обязательность проведения токсикологических исследований - изучение различных биохимических и иммунологических маркеров токсического действия. Обязательность этих исследований объясняется возможным изменением структуры продуцируемых микробной клеткой пищевых ингредиентов и, следовательно, изменением их биологических свойств, а также возможным наличием в составе этих ингредиентов живых форм и/или ДНК штаммов-продуцентов, а также их токсичных метаболитов. Вместе с тем известно, что нутриентный состав пищевой продукции оказывает значимое влияние на состав и свойства микроорганизмов, входящих в состав кишечного микробиома, что, в свою очередь, обусловливает состояние иммунного статуса. Цель работы - обоснование включения в комплекс исследований безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, изучения состава кишечного микробиоценоза [на примере ферментного препарата (ФП) -комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из генно-инженерно-модифицированного штамма Aspergillus awamori Xyl T-15]. Материал и методы. В экспериментальных исследованиях, проводимых в течение 80 сут, использовали крыс линии Wistar (самцов и самок). Проведены исследования влияния ФП - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы - в дозах 10, 100 и 1000 мг на 1 кг массы тела (внутрижелудочно) из генетически модифицированного штамма Aspergillus awamori Xyl T-15 на микробиом слепой кишки и иммунный статус (содержание цитокинов и хемокинов: интерлейкинов 1a, 4, 6, 10, 17A, у-интерферона, фактора некроза опухоли a, цитокинов MCP-1, MIP-1a, регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток RANTES) экспериментальных животных.
Результаты. Показано, что ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 - в дозах от 100 мг/кг и более вызывает нарушения состава кишечного микробиоценоза умеренной степени выраженности. Вместе с тем данные нарушения оказывают статистически значимое иммуномодулирующее и иммунотоксическое действие на организм, которое проявляется в дозозависимом изменении профиля провоспалительных цитокинов и хемокинов в крови и селезенке. Действие ФП на организм, вероятно, обусловлено образованием метаболитов, не характерных для нормальных процессов ферментации пищевых субстратов в ходе пищеварения. Минимальная действующая доза (LOAEL) ФП составила 100 мг на 1 кг массы тела. В соответствии с установленными требованиями активность ФП не должна проявляться в готовой пищевой продукции. При условии соблюдения этого требования его количество, поступающее в организм, не может превысить установленный уровень LOAEL. Следовательно, ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы - может быть использован в пищевой промышленности при условии установления регламента «для технологических целей» в отношении штамма A. awamori Xyl T-15. Заключение. Полученные данные о взаимосвязи состояния микробиома и иммунного статуса при введении ФП указывают на необходимость включения показателей состояния кишечного микробиоценоза в протокол испытаний безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза.
Ключевые слова: генетически модифицированные микроорганизмы; ферментный препарат; продукция микробного синтеза; микробиом кишечника; иммунный статус
The requirements for the safety of food products obtained by microbial synthesis are including as obligation for to conduct toxicological studies - the study of various biochemical and immunological markers of toxic effects. The necessity of these studies is explained by a possible change in the structure of food ingredients produced by a microbial cell and, consequently, a change in their biological properties, as well as the possible presence of living forms and/or DNA of producer strains or of their toxic metabolites in these ingredients. At the same time, it is well known that the nutrient composition of foods has a significant impact on the composition and properties of microorganisms that make up the gut microbiome, which, in turn, determines the immune status.
The purpose of the research was to justify the analyses of gut microbiocenosis composition for inclusion in the protocol of safety investigation of foods obtained by microbial synthesis [on the example of an enzyme preparation (EP) - a complex of glucoamylase and xylanase from a genetically modified strain of Aspergillus awamori Xyl T-15].
Material and methods. In experimental studies carried out for 80 days, Wistar rats (males and females) were used. The study of the effect of EP (a complex of glucoamylase and xylanase from a genetically modified Aspergillus awamori Xyl T-15 strain) in dozes 10, 100 and 1000 mg/kg body mass on the cecum microbiome and the immune status (content of cytokines and chemokines: IL-1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, INF-y, TNF-a, MCP-1, MIP-1a and Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted - RANTES) was carried out. Results. It has been shown that EP - a complex of glucoamylase and xylanase from A. awamori Xyl T-15 at doses of 100 mg/kg or more causes mild disturbances in the composition of gut microbiocenosis. At the same time, these disorders have a significant immunomodulatory and immunotoxic effect on the body, which manifests itself in a dose-dependent change in the profile of pro-inflammatory cytokines and chemokines in blood and spleen. The adverse effect of EP on the body is probably due to the formation of metabolites that are not formed during usual digestive processes in the gastrointestinal tract. The minimum effective dose (LOAEL) of EP was 100 mg/kg body weight In accordance with established requirements, the activity of the EP should not appear in ready-to-use food. Subject to this requirement, amount of EP entering the body cannot exceed the established LOAEL level. Therefore, a complex of glucoamylase and xylanase can be used in food industry, subject to the establishment of regulations «for technological purposes» for A. awamori Xyl T-15 strain.
Conclusion. The data obtained on the relationship between the state of the microbiome and the immune status upon the introduction of EP indicate the need to include indicators of the state of gut microbiocenosis in the test protocol of safety.
Keywords: genetically modified microorganisms; enzyme preparation; production of microbial synthesis; gut microbiome; immune status
Funding. The work was carried out at the expense of a subsidy for the fulfillment of a state task within the framework of the Program for Fundamental Scientific Research (theme of the Ministry of Education and Science of Russia No. 0529-2019-0057). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. The concept and design of the study - Bagryantseva O.V., Khotimchenko S.A.; setting up the experiment, collecting and processing the material - Gmoshinski I.V., Bagryantseva O.V., Shipelin V.A., Sheveleva S.A., Riger N.A., Shumakova A.A., Efimochkina N.R., Markova Yu.M., Tsuri-kova N.V., Smotrina Yu.V., Sokolov I.E., Kolobanov A.I.; statistical data processing - Gmoshinski I.V.; writing the text, editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - Bagryantseva O.V., Gmoshinski I.V., Khotimchenko S.A.
Acknowledgments. We express our gratitude to the employees of VNIIPBT - filial of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Ignatova N.I. for providing an experimental batch of the enzyme used in the research. For citation: Bagryantseva O.V., Gmoshinski I.V., Shipelin V.A., Sheveleva S.A., Riger N.A., Shumakova A.A., Efimochkina NR., Markova Yu.M., Tsurikova N.V., Smotrina Yu.V., Sokolov I.E., Kolobanov A.I., Khotimchenko S.A. Assessment of the influence of an enzymal preparation - a complex of glucoamylase and xylanase from Aspergillus awamori Xyl T-15 on the intestinal microbiom and immunological indicators of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (3): 42-52. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-3-42-52 (in Russian) Received 08.04.2022. Accepted 04.05.2022.
Стремительный рост объемов производства пищевой продукции, изготавливаемой с использованием высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, которые создаются методами направленного мутагенеза и/или трансгенеза, делает необходимым совершенствование регламентов их безопасности для здоровья потребителей. Такие требования на сегодняшний день включают обязательность проведения токсикологических исследований, включая изучение различных биохимических и иммунологических показателей в условиях in vivo и in vitro [1-4].
Вместе с тем организм человека - это экологическая ниша для множества разнообразных микроорганизмов. Живые клетки этих микроорганизмов, их геном и продуцируемые ими метаболиты составляют кишечный микробиом. Важное влияние на организм хозяина оказывает состояние его кишечного микро-биома, что связано с выраженным влиянием последнего на иммунный статус. Это обусловлено действием эндо- и энтеротоксинов, продуцируемых кишечной микрофлорой, на ассоциированные с кишечником лимфоидные ткани (gut-associated lymphoid tissues -GALT). Поверхность тонкой и толстой кишки взрослого человека, контролируемая GALT, представляет собой структуру площадью 32 м2, которая включает ~1014 колониеобразующих единиц (КОЕ) комменсальных микроорганизмов [5-7].
В состав GALT входит целых ряд иммунных клеток, включая T- и B-лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги. В эпителии кишечника находятся интра-эпителиальные лимфоциты, которые взаимодействуют с различными микроорганизмами и клетками кишечника. В микроскладках фолликул-ассоциированного эпителия, покрывающего поверхности лимфоидных тканей кишечника, находятся M-клетки, играющие ключевую роль в захвате микробных клеток и антигенов из просвета кишечника, впоследствии распознаваемых дендритными клетками и далее взаимодействующих с Т- и В-лимфоцитами, что приводит к развитию воспалительной реакции и секреции иммуноглобулина A (IgA). Состояние микробиома кишечника во многом определяется свойствами поступающих в составе рациона пищевых ингредиентов [5-7].
Показано, что грамнегативные микроорганизмы (например, представители семейства Enterobacteriaceae spp.) являются активаторами врожденного (гуморального) иммунного ответа и вызывают развитие про-воспалительной реакции. Некоторые грампозитивные бактерии (например, принадлежащие к родам Bacte-roides spp., Clostridium spp. и Bacillus spp.), в состав капсулы которых входят полисахариды, распознаются дендритными клетками и способствуют развитию противовоспалительного ответа и высвобождению интер-лейкина-10 (ИЛ-10), который в основном продуцируется в кишечнике Т-регуляторными лимфоцитами (Treg). Плесневые грибы вызывают синтез IgA B-клетками. В случае нарушения баланса в составе микрофлоры кишечника развивается Т1г2-иммунный ответ на аллер-
гены. Основными «инструментами», определяющими специфичность различных механизмов защиты в данном случае, становятся факторы гуморального иммунитета (IgA и IgE), а основными регуляторными факторами при этом типе иммунного ответа признаны ИЛ-4 и ИЛ-5 [5, 7, 8].
Наличие в составе пищевой продукции живых форм штаммов-продуцентов и/или их ДНК, пищевых ингредиентов с измененной биохимической структурой молекул и, следовательно, с измененной биологической активностью может негативным образом повлиять на состояние кишечного микробиома, иммунный статус и метаболизм организма. Кроме того, используемые в пищевой промышленности ферментные препараты в большинстве являются пищеварительными ферментами. Их концентрация и активность играют важнейшую роль в метаболизме организма. Избыточное поступление в организм ферментных препаратов в составе пищевой продукции может вызвать такие негативные эффекты, как снижение продукции эндогенных пищеварительных ферментов; изменение константы Миха-элиса, определяющей сродство фермента к субстрату в процессе переваривания пищи; нарушение аллосте-рического контроля активности фермента; нарушение функций гормонов, регулирующих продукцию эндогенных ферментов [9, 10]. Например, при нарушении экзо-кринной функции поджелудочной железы (повышении или снижении концентрации протеолитических ферментов, липазы и амилазы) снижается толерантность организма к глюкозе. Избыточное поступление ферментов в желудочно-кишечный тракт в составе пищевой продукции может привести к раздражению слизистой оболочки кишки, дисбалансу кишечного микробиома, изменению метаболического и иммунного статуса организма [11, 12].
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что качественный и количественный состав кишечного микробиома может являться одним из важнейших биомаркеров токсического действия пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза.
Цель работы - обоснование включения в комплекс исследований безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, изучения состава кишечного микробиома (на примере ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из генно-инженерно-модифицированного штамма Aspergillus awamori Xyl T-15).
Материал и методы
В соответствии с паспортом, генетически модифицированный (ГМ) штамм A. awamori Xyl Т-15 получен на основе мутантного штамма-реципиента A. awamori ВУДТ-2 1000У (ВКМ F 3765), являющегося продуцентом глюкоамилазы, путем встраивания гена ксиланазы из штамма-донора Penicillium canescens (XylA). Штамм Aspergillus
Таблица 1. Схема посева содержимого слепой кишки Table 1. Scheme of inoculation of the contents of the cecum
Группа микроорганизмов Group of microorganisms Наименование среды Medium Номер разведения Dilution number Количество засеваемого материала, см3 The amount of sown material, cm3 Время инкубации Incubation time
Бифидобактерии Bifidobacterium spp. Среда ГМК Corn-lactose medium 5; 7; 9 1,0 24-72 ч 24-72 h
Лактобактерии Lactobacterium spp. МРС-4 MRS agar 5; 7; 9 0,05 24-48 ч 24-48 h
Бактероиды Bacteroides spp. Желчно-эскулиновый агар для бактероидов Bacteroides bile esculin agar 5; 7; 9 0,05 24 ч 24 h
Клостридии Clostridium spp. Железосульфитная среда Iron sulfite medium 1; 3; 5 1,0 24-72 ч 24-72 h
Энтеробактерии Enterobacteriaceae Среда Эндо Endo agar 5; 7; 9 0,05 24 ч 24 h
Энтерококки Enterococcus spp. Азидный агар с канамицином и эску-лином Kanamycin esculin azide agar 1; 3; 5 0,05 24-72 ч 24-72 h
Дрожжеподобные и плесневые грибы Yeast-like and mold fungi Среда Сабуро с хлорамфениколом (0,1 г/л) Sabouraud agar with chloramphenicol (0.1 g/l) 1; 3; 5 0,05 2-5 сут 2-5 days
П р и м е ч а н и е. Инкубирование анаэробных микроорганизмов осуществляли с использованием пакетов для химического связывания кислорода «Oxoid™ AnaeroGen™» (Thermo Scientific, США).
N o t e. Incubation of anaerobic microorganisms was carried out using bags for chemical oxygen binding «Oxoid™ AnaeroGen™» (Thermo Scientific, USA).
awamori Xyl T-15 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН за № 4278D [13, 14].
В исследованиях использовали самцов крыс аутбред-ной линии Wistar, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Работу выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и международными рекомендациями по гуманному обращению с животными [15].
В эксперименте по изучению влияния ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы (далее - ФП), полученного с использованием ГМ-штамма Aspergillus awamori Xyl T-15, на микробиологические показатели и продукцию цитокинов использовали 4 группы по 10 самцов крыс исходной массой тела 80±10 г. После недельной адаптации все крысы получали в течение последующих 80 сут полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93M и воду в условиях неограниченного доступа и внутрижелудочно ежесуточно ФП в расчетных дозах 0 (контроль); 10, 100 и 1000 мг на 1 кг массы тела в 0,15 М растворе NaCl. Воду для питья крыс получали в установке обратного осмоса «Milli-RO» (Waters, США).
Животных выводили из эксперимента на 80-е сутки после 16-часового голодания путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. Кровь, селезенку и слепую кишку отбирали у животных в асептических условиях. Лизаты клеток селезенки готовили в 0,1 М трис-НС!-буфере, охлажденном до 0-2 °C, в соотношении 1 : 4 по массе непосредственно перед проведением анализа. Сыворотку крови отделяли и хранили ее до исследования при -20 оС.
Состав кишечного микробиоценоза изучали путем посева (10-кратных разведений) содержимого слепой кишки, выделенного в стерильных условиях во время выведения животных из эксперимента, на специфические питательные среды. Исследование микробного пейзажа содержимого слепой кишки включало выявление клостридий, бактероидов, бифидобактерий, лактобацилл, энтерококков, энтеробактерий, дрожжепо-добных и плесневых грибов (табл. 1).
Анаэробы и мезофильно-факультативные анаэробы были идентифицированы до рода по морфологии колоний клеток, аэротолерантности и каталазной активности. Факультативные анаэробы идентифицировали общепринятыми методами согласно [16].
Количество колониеобразующих единиц микроорганизмов, выросших на питательных средах, выражали в lg КОЕ/г в массе содержимого слепой кишки. Идентификацию микроорганизмов проводили путем изучения морфологии колоний, микроскопии мазков и определения дифференциально-диагностических биохимических свойств в соответствии с [17, 18].
Для определения уровня цитокинов и хемокинов [ИЛ-1а, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17А, интерферона-у, фактора некроза опухоли а (ФНОа), цитокинов MCP-1, MIP-1a, регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток RANTES] в сыворотке крови и лизатах селезенки использовали базовый коммерческий набор Bio-Plex Pro™ Reagent Kit V, дополненный реагентами Bio-Plex Pro™ (Pro-Rat 33-Plex Standarte, Rat Cytokine IL-1a Set, Rat Cytokine IL-4 Set, Rat Cytokine IL-6 Set, Rat Cytokine IL-10 Set, Rat Cytokine IL-17A Set, Rat Cytokine IFN-g Set, Rat Cytokine TNF-a Set, Rat Cytokine
MCP-1 Set, Rat Cytokine MIP-1a Set, Rat Cytokine RAN-TES Set) («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Измерения проводили на мультиплексном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Изучение влияния ФП на аллергическую чувствительность и ответ специфических антител IgG проводили на модели системной анафилаксии. В работе использовали самцов крыс Wistar с исходной массой тела 180 г, которых сенсибилизировали овальбумином (ОВА) куриного яйца (Sigma-Aldrich, Германия). Сенсибилизацию проводили путем внутрибрюшинного введения на 1-е, 3-и и 5-е сутки эксперимента по 100 мкг ОВА, адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия в стерильном апирогенном 0,15 М NaCl. На 21-е сутки крысам вводили дополнительно 10 мкг ОВА в тех же условиях. На протяжении всего периода сенсибилизации в течение 28 сут крысы опытной и контрольной групп получали общевиварный рацион и воду в режиме неограниченного доступа. ФП вводили крысам опытной группы ежедневно внутрижелудочно в дозе 100 мг на 1 кг массы тела (по белку). Крысам контрольной группы вводили 0,15 M раствор NaCl. Реакцию анафилаксии воспроизводили на 29-е сутки путем внутривенного введения ОВА в дозе 6 мг на 1 кг массы тела (по белку) в 0,15 М растворе NaCl. Раствор антигена для внутривенного введения стерилизовали пропусканием через фильтр «Millipore» с диаметром пор 0,22 мкм. Непосредственно перед введением разрешающей дозы отбирали кровь из вены для определения антител IgG. Тяжесть реакции системной анафилаксии в течение 24 ч после введения разрешающей дозы антигена оценивали в баллах согласно МУ 2.3.2.2306-07 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения». Концентрацию IgG антител в сыворотке крови сенсибилизированных ОВА крыс определяли методом непрямого твер-
дофазного иммуноферментного анализа на полистироле с использованием в качестве вторичных антител меченных пероксидазой кроличьих антител против IgG (1+4) крысы (Sigma-Aldrich, Израиль) в соответствии с МУ 2.3.2.2306-07.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета SPSS 20.0 (IBM, США). Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки. Вероятность принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок устанавливали согласно критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и ANOVA. Достоверность различия долевых показателей оценивали с использованием точного U-критерия Фишера и многомерного критерия х2 Пирсона. Различия признавали значимыми при р<0,05.
Результаты
Влияние ферментного препарата на кишечный микробиом
Как показали результаты исследований, в содержимом слепой кишки (табл. 2) при внутрижелудочном введении крысам ФП в дозе 10 мг на 1 кг массы тела наблюдалась тенденция к росту содержания бактероидов, а в дозе 100 мг/кг - статистически значимый рост содержания бактероидов с 3,5 КОЕ/г (контрольная группа) до lg 6,7 КОЕ/г по нижней границе интервала измерений. По верхней границе интервала полученных значений никаких изменений в анализируемом количестве бактероидов во всех опытных группах отмечено не было. Отмечена тенденция к увеличению содержания энтерококков в содержимом слепой кишки по нижней границе интервала измерений с lg 2,3 до lg 5,3 КОЕ/г. При дозе 1000 мг/кг отмечался статистически значимый рост содержания плесневых грибов (рис. 1) и тенденция снижения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 2. Содержание представителей микробиоты в слепой кишке крыс 1-4-й групп на 92-е сутки эксперимента (Ме, lg КОЕ/г содержимого, n=9)
Table 2. Levels of microbiota representatives in the cecum of rats of groups 1-4 on day 92 of the experiment (Me, lg CFU/g of content, n=9)
Показатель Indicator Группа/ Group р*
1-я (контроль) (control) 2-я 3-я 4-я
Бифидобактерии / Bifidobacterium spp. 7,0 8,0 8,0 8,0 >0,1
Лактобациллы / Lactobacillus spp. 7,6 7,8 7,6 7,6 >0,1
Бактероиды / Bacteroides spp. 7,43 7,5 >9,31 >9,3 0,087
Энтеробактерии / Enterobacteriaceae spp. 7,4 8,3 5,2 7,3 >0,1
Энтерококки / Enterococcus spp. 6,5 6,6 6,6 5,8 >0,1
Сульфит-редуцирующие клостридии Clostridium spp. (sulphite-reducing) 5,4 3,0 5,0 4,0 >0,1
Дрожжи / Yeast <2,0 в пределах чувствительности анализа во всех группах
Плесени / Molds 2,6 2,6 2,7 3,0 0,003
П р и м е ч а н и е. Надстрочные индексы - номера групп, различие с которыми статистически значимо (p<0,05) согласно U-критерию Манна-Уитни; * - статистическая значимость различий для групп 1-4 согласно критерию Краскела-Уоллиса. N o t e. The superscripts - nos of groups differing significantly, Mann-Whitney U-test p<0.05; * - Kruskall-Wallace critérium for groups 1-4.
Бифидобактерии / Bifidobacterium spp.
12,0-
10,0 § 8,0
- 6,0 Ш
§ 4,0
2,0 0,0
10
18 ^ о Сп 6
О
9,0 10,0 9 0
О О 8,0 ГЛ
А • • А
6,0 7,0 7,0 V 6,0
1
Бактероиды / Bacteroides spp.
О О о о
• •
• 6,7 6,5
• 3,5 4,9
10 8
Лактобактерии / Lactobacterium spp.
8,9
f cm 6
о
2 0
3,1
13 £ 2,9
о
2,7 2,6
8,7 8,9 8 4 8,8
о о А О
7,3
6,4
5,3
6,1
12 3 4 Плесневые грибы / Molds
3,0
2,64 2,64
• •
2,74
О
Группа животных / Group of animals
О Верхняя граница интервала измерений / Upper limit of the measurement interval ф Нижняя граница нижней границе интервала измерений / Lower limit of the measurement interval ф Средние значения / Mean
Рис. 1. Влияние различных доз ферментного препарата на содержание отдельных групп микроорганизмов в содержимом слепой кишки крыс на 80-е сутки эксперимента
Fig. 1. The effect of different doses of the enzyme preparation the levels of certain groups of microorganisms in the contents of the cecum of rats on the 80th day of the experiment
4
4
5
Ферментный препарат при введении в дозе 10 мг/кг вызывал увеличение количества бифидобактерий и лактобактерий в содержимом слепой кишки. Вместе с тем по мере дальнейшего увеличения дозы ФП наблюдалась тенденция снижения количества этих микроорганизмов (см. рис. 1). Следует отметить, что, поскольку состав микробиома зависит от множества факторов и, как правило, характеризуется высокой вариабельностью у различных особей, отмеченные тенденции в изменении количества микроорганизмов являются значимыми для организма и свидетельствуют о невыраженном, но негативном воздействии ФП в указанных дозировках на организм подопытных животных.
Влияние ферментного препарата на уровень и продукцию цитокинов и хемокинов
В сыворотке крови крыс (рис. 2) под воздействием средней дозы ФП (100 мг/кг) произошло статистически значимое увеличение уровня М1Р-1а и снижение РАИТЕв, а при наибольшей дозе (1000 мг/кг) возросли
уровни ИЛ-4 и ИЛ-10 и многократно снизился уровень РАИТЕв. Отношение ИЛ-10/ИЛ-17А, характеризующее сравнительную активность субпопуляций Тгед- и ТИ17-лимфоцитов [19, 20], демонстрирует тенденцию к росту в зависимости от дозы ФП ^<0,05, критерий Краскела-Уоллиса для 1, 3, 4-й групп), хотя и не различается достоверно при попарном сравнении групп. При этом сам уровень ИЛ-17А остается без видимых изменений.
В селезенке (рис. 3) крыс внутрижелудочное введение ФП привело к статистически значимому возрастанию содержания ИЛ-1а, ИЛ-10 при дозе 1000 мг/кг, а ИЛ-17А -уже при дозе 100 мг/кг. При этом соотношение ИЛ-10/ ИЛ-17 статистически значимо снизилось при наибольшей из доз ФП. В противоположность сыворотке крови наименьший уровень М1Р-1а в селезенке отмечался при дозе ФП 100 мг/кг ^<0,01 по сравнению с контролем). Полученные данные о составе цитокинов и хемокинов в крови и селезенке подопытных животных свидетельствуют об усилении аллергического ответа и воспалительных процессов при введении ФП в дозах 100 мг/кг и выше.
IL-4
IL-10
а
о с о
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
1,6-| 1,20,80,40,0-
1
3
IL-17A
1 3
MIP-1a
4
0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
30 -, 20100
1
IL-10/IL-17
3
RANTES
I I
Группа животных / Group of animals Рис. 2. Уровни цитокинов и хемокинов в плазме крови крыс 1, 3 и 4-й групп (M±m, n=9 в каждой группе)
* - статистически значимое различие (p<0,05) для сравниваемых групп согласно U-критерию Манна-Уитни. Данные для 2-й группы не были получены. Здесь и на рис. 3, 4: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Fig. 2. Plasma levels of cytokines and chemokines in rats of groups 1, 3 and 4 (M±m, n=9 in each group)
* - p<0.05 for compared groups, Mann-Whitney U-test. Data for group 2 were not available. Here and in fig. 3, 4: abbreviations are given in the text.
*
*
4
4
4
1
1
1
Исследование иммуномодулирующего и аллергенного действия ферментного препарата
При изучении аллергенного и иммуномодулирующего действия ФП на модели системной анафилаксии на протяжении всего периода сенсибилизации крысы опытной и контрольной групп практически с равной скоростью прибавляли в массе тела (р>0,1, АЫОУА).
После введения разрешающей дозы на 29-е сутки в опытной и контрольной группах крыс наблюдали развитие реакции анафилаксии. Как следует из представленных данных (рис. 4), внутрижелудочное введение крысам ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела не изменяло их чувствительность к развитию реакции системной анафилаксии (уровень значимости различия распределений p>0,05 согласно многомерному критерию х2). В табл. 3
Таблица 3. Уровень специфических антител IgG к овальбумину у сенсибилизированных крыс контрольной и опытной групп (M±m) Table 3. The level of specific IgG antibodies to ovalbumin in sensitized rats of the control and experimental groups (M±m)
Группа / Group n Показатель / Indicator
D492* IgG, мг/мл / IgG, mg/ml Ig (IgG), мг/мл / Ig (IgG), mg/ml
Контрольная группа (введение раствора NaCl) Control group (administration of NaCl solution) 26 0,840±0,047 0,78±0,10 -0,203±0,063
Опытная группа (введение ФП) Experimental group (EP introduction) 25 0,830±0,019 0,63±0,03 -0,215±0,023
Однородность распределения, р, ANOVA Distribution uniformity, p, ANOVA >0,05 >0,05 >0,05
Достоверность различия, р, непараметрический тест Манна-Уитни Significance of difference, p, nonparametric Mann-Whitney test >0,05
* - оптическая плотность при À=492 нм.
* - optical density at Л=492 nm.
IL-1a
IL-10
а
о с о
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
1 2 3
IL-17A
12-1 1086420-
0,02 0,01 0,00
2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 -, 0,0
MIP-1a
2 3 IL-10/IL-17
12 3 4 Группа животных / Group of animals
Рис. 3. Уровни цитокинов и хемокинов в лизатах селезенки крыс 1-4-й групп (M±m, n=9 в каждой группе)
Статистически значимое различие для сравниваемых групп, согласно U-критерию Манна-Уитни: * - p<0,05, ** - p<0,01.
Fig. 3. Levels of cytokines and chemokines in spleen lysates of rats from groups 1-4 (M±m, n=9 in each group). * - p<0.05; ** - p<0.01 for compared groups, Mann-Whitney U-test.
приведены результаты определения уровня специфических антител IgG (1+4) к ОВА у сенсибилизированных крыс контрольной и опытной групп. Данные определения показывают, что достоверное влияние внутрижелудочно вводимого ФП на ответ антител к ОВА отсутствует. В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела не изменяет гуморальный иммунный ответ и не увеличивает тяжесть реакции крыс на введение разрешающей дозы антигена на модели системной анафилаксии.
Обсуждение
Предыдущими исследованиями показано, что ФП -комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 - в используемых в эксперименте дозах не обладал острой токсичностью, не оказывал неблагоприятного влияния на когнитивную функцию, состояние слизистого барьера тонкой кишки и стандартные биохимические показатели. Однако в дозе свыше 100 мг на 1 кг массы тела и более отмечалось воздействие ФП на гематологические показатели животных и усиление процессов апоптоза клеток печени. Недействующая доза (NOEL)
60-1
о
|40
о
: зо-
|20
ио-
Контроль Control
ФП, 100 мг/кг EP, 100 mg/kg
□ 0 Ш+ И2+ И3+ И4+
Рис. 4. Распределение крыс по тяжести реакции анафилаксии, выраженной в баллах
0 - нет реакции; 1-4 - тяжесть реакции в баллах.
Fig. 4. Distribution of rats by the severity of anaphylaxis reaction, expressed in points
0 - no reaction; 1-4 - the severity of the reaction in points.
*
*
*
0
ФП составила 100 мг на 1 кг массы тела. Микотоксины в составе ФП не выявлены [21]. В настоящем исследовании нами выявлены изменения микробиома содержимого слепой кишки крыс, выражающиеся в увеличении количества плесеней и тенденции к росту содержания условно-патогенных микроорганизмов (Bacteroides spp., Enterobacteriaceae spp., Enterococcus spp.), способных вызвать воспалительный процесс и снижение количества симбионтной микрофлоры (лакто- и бифидобак-терий). Это, в свою очередь, может свидетельствовать о снижении колонизационной резистентности кишечника при введении ФП в агравированных дозах.
Результаты нашего исследования, показали, что ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела и выше воздействует на цитокиновый профиль животных и содержание хемоки-нов. В сыворотке крови характерным было возрастание уровня ИЛ-4, связанного с развитием иммунного ответа по ТИ2-хелперному пути [5-7]. Одновременно отмечалось возрастание уровня MIP-1a, выступающего в роли основного хемоаттрактанта для моноцитов/макрофагов и дендритных клеток. Выраженное дозозависимое снижение RANTES, отвечающего за рекрутирование Т-лимфоцитов и NK-клеток, стоит расценивать как результат влияния ФП на микробиом кишечника и иммунный статус организма.
Наблюдавшееся в лизатах клеток селезенки при увеличении вводимой концентрации ФП снижение отношения ИЛ-10/ИЛ-17А свидетельствует о преобладании активности ТИ17-лимфоцитов над Treg-популяциями, что в совокупности с увеличением продукции ИЛ-1а свидетельствует о стимуляции воспалительных процессов при введении ФП в дозах 100 мг/кг и выше. Данные процессы обусловлены, по-видимому, изменением качественного и количественного состава микробиома слепой кишки в результате действия ФП на пищевые субстраты.
Рассмотренные неблагоприятные эффекты ФП наблюдаются при его внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг, которая может рассматриваться как минимальная доза, оказывающая неблагоприятное действие (LOAEL) по этим показателям в условиях
3-месячного поступления ФП в организм животных. С использованием этой дозы в отдельном эксперименте была проведена оценка влияния ФП на аллергическую чувствительность крыс на модели системной анафилаксии. Проведенные тесты показали, что усиления сенсибилизации модельным пищевым антигеном и тяжести вызываемой введением его разрешающей дозы реакции системной анафилаксии не происходит, т.е. ФП не может рассматриваться как фактор, повышающий аллергическую чувствительность.
В соответствии с требованиями Технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) активность ФП не должна проявляться в готовой для применения пищевой продукции. При условии соблюдения этого требования его количество, поступающее в организм, не может превысить установленный уровень LOAEL. Следовательно, ФП - комплекс глюкоамилазы и ксила-назы - может быть использован в пищевой промышленности при условии установления регламента «для технологических целей» в отношении штамма A. awamori Ху1 Т-15 и отсутствии активности этого ФП в готовой пищевой продукции.
Заключение
Полученные результаты показали, что ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Ху1 Т-15 в дозах свыше 100 мг на 1 кг массы тела вызывает нарушение микробиома кишечника, оказывает иммуномодулиру-ющее и иммунотоксическое действие на организм подопытных животных. Полученные данные указывают на необходимость включения изучения взаимосвязи иммунологических показателей и состава микробиоценоза кишечника в протокол испытаний безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза.
Сведения об авторах
Багрянцева Ольга Викторовна (OIga V. Bagryantseva) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-mail: bagryanteeva@ion.ru https://orcid.org/0000-0003-3174-2675
Гмошинский Иван Всеволодович (Ivan V. Gmoshinski) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: gmoeh@ion.ru http://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Шипелин Владимир Александрович (Vladimir A. Shipelin) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: v.ehipelin@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0015-8735
Шевелева Светлана Анатольевна (Svetlana A. Sheveleva) - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация)
E-maiI: sheveIeva@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-5647-9709
Ригер Николай Александрович (Nicolay A. Riger) - доктор медицинских наук, главный специалист лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: n_rieger@icIoud.com https://orcid.org/0000-0001-7149-2485
Шумакова Антонина Александровна (Antonina A. Shumakova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: antonina_sh@Iist.ru https://orcid.org/0000-0003-1373-4436
Ефимочкина Наталья Рамазановна (Natalia R. Efimochkina) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: karIikanova@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-9071-0326
Маркова Юлия Михайловна (Yuliya M. Markova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: yuIia.markova.ion@gmaiI.com https://orcid.org/0000-0002-2631-6412
Цурикова Нина Васильевна (Nina V. Tsurikova) - кандидат технических наук, заведующий лабораторией биотехнологии новых продуцентов гидролитических ферментов ВНИИПБТ - филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: nina.tsurikova@gmaiI.ru https://orcid.org/0000-0002-9609-0818
Смотрина Юлия Владимировна (Yuliya V. Smotrina) - младший научный сотрудник ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: smotrina@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-8842-0525
Соколов Илья Евгеньевич (Ilya E. Sokolov) - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: sokoIov_iIiya@yahoo.com http://orcid.org/0000-0003-2819-6001
Колобанов Алексей Иванович (Alexey I. Kolobanov) - лаборант-исследователь лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-maiI: koIobanov@ion.ru http://orcid.org/0000-0003-3986-1708
Хотимченко Сергей Анатольевич (Sergey A. Khotimchenko) - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий, первый заместитель директора ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-maiI: hotimchenko@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-5340-9649
Литература
Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов. Методические указания МУ 2.3.2.1830-04. Москва, 2004. 56 с.
Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 6. Article ID 5294. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5294 EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordonez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M. et al. Scientific Opinion on the update of the list of QPS recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA (2017-2019) // EFSA J. 2020. Vol. 18, N 2. Article ID e05966. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2020.5966
Analysis of JECFA's draft guideline on «Evaluation of enzyme preparations used in the manufacture of foods». EFSA Supporting Publication, 2020. 8 p. DOI: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2020.EN-1795
García-Montero C., Fraile-Martínez O., Gomez-Lahoz A.M., Pe-karek L., Castellanos A. J., Noguerales-Fraguas F. et al. Nutritional components in Western diet versus Mediterranean diet at the gut microbiota-immune system interplay. implications for health and disease // Nutrients. 2021. Vol. 13, N 2. P. 699. DOI: https://doi.org/ 10.3390/nu13020699
Lazar V., Ditu L.-M., Pircalabioru G.G., Gheorghe I., Curutiu C. et al. Aspects of gut microbiota and immune system interactions in infectious diseases, immunopathology, and cancer // Front. Immunol. 2018. Vol. 9. P. 1830. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01830 Chen L.L., Abbaspour A., Mkoma G.F., Bulik C.M., Rück C., Djur-feldt D. Gut microbiota in psychiatric disorders: a systematic review // Psychosom. Med. 2021. Vol. 83. P. 679-692. DOI: https://doi.org/10. 1097/PSY.0000000000000959
Di Guglielmo M.D., Franke K.R., Robbins A., Crowgey E.L. Impact of early feeding: metagenomics analysis of the infant gut microbiome //
2
б
7
4.
8
Front. Cell. Infect. Microbiol. 2022. Vol. 12. Article ID 816601. DOI:
https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.816601
9. Chandra P., Enespa, Singh R., Arora P.K. Microbial lipases and their industrial applications: a comprehensive review // Microb. Cell Fact. 2020. Vol. 19. Р. 169. DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-020-01428-8
10. Tavares N.K., Zayas C.L., Escalante-Semerena J.-C. The Methano-sarcina mazei MM2060 gene encodes a bifunctional kinase/decarboxylase enzyme involved in cobamide biosynthesis // Biochemistry. 2018. Vol. 57, N 30. Р. 4478-4495. DOI: https://doi.org/10.1021/acs. biochem.8b00546
11. Textbook of biochemistry with clinical correlations / ed. Devlin T.M. 5th ed. New York : John Wiley & Sons, 2001. 1216 p. ISBN 0-471-41136-1.
12. Багрянцева О.В., Хотимченко С.А., Шевелева С.А., Минаева Л.П., Семенова П.А. Об использовании фермента трансглютаминазы в пищевой промышленности // Пищевая промышленность. 2021. № 10. С. 78-81. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021.10.10.016
13. Римарева Л.В., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Середа А.С. Рекомбинантный штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori - продуцент комплекса ферментов глюкоамилазы и ксиланазы. Патент РФ № 2457246, приоритет от 21.03.2011.
14. Рожкова А.М., Середа А.С., Цурикова Н.В., Нуртаева А.К., Семёнова М.В., Римарева Л.В. и др. Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе рекомбинантного штамма гриба Aspergillus awamori // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47, № 3. С. 308-317.
15. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011.
16. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. Москва : Медицина, 1982. 464 с.
17. Гаузе Г.Ф. Определитель актиномицетов. Роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. Москва : Книга по Требованию, 2021. 248 с. ISBN 978-5-458-47107-7.
18. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 9th ed. / eds J.G. Holt, H.R. Krieg. Baltimore, London : Williams and Wilkins, 1994. 787 p. ISBN 978-0683006032.
19. Stemke D.J. Genetically modified microorganisms. biosafety and ethical issues // The GMO Handbook: Genetically Modified Animals, Microbes, and Plants in Biotechnology / ed. S.R. Parekh. Totowa, NJ : Humana Press, 2004. P. 85-130.
20. Lee G.R. The balance of Th17 versus Treg cells in autoimmunity // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, N 3. P. E730. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijmsl9030730
21. Багрянцева О.В., Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Цурикова Н.В., Шевелева С.А. и др. Оценка рисков для здоровья ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из Aspergillus awamori Xyl T-15 // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 3. С. 28-39. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-3-28-39
References
1. Microbiological and molecular genetic evaluation of food obtained using genetically modified microorganisms: Guidelines MU 2.3.2.1830-04. Moscow, 2004: 56 p. (in Russian)
2. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources. EFSA J. 2018; 16 (6): 5294. DOI: https:// doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5294
3. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordonez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M., et al. Scientific Opinion on the update of the list of QPS recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA (2017-2019). EFSA J. 2020; 18 (2): e05966. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2020.5966
4. Analysis of JECFA's draft guideline on «Evaluation of enzyme preparations used in the manufacture of foods». EFSA Supporting Publication, 2020: 8 p. DOI: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2020.EN-1795
5. García-Montero C., Fraile-Martínez O., Gomez-Lahoz A.M., Pe-karek L., Castellanos A.J., Noguerales-Fraguas F., et al. Nutritional components in Western diet versus Mediterranean diet at the gut micro-biota-immune system interplay. implications for health and disease. Nutrients. 2021; 13 (2): 699. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13020699
6. Lazar V., Ditu L.-M., Pircalabioru G.G., Gheorghe I., Curutiu C., et al. Aspects of gut microbiota and immune system interactions in infectious diseases, immunopathology, and cancer. Front Immunol. 2018; 9: 1830. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01830
7. Chen L.L., AbbaspourA., Mkoma G.F., Bulik C.M., Rück C., Djurfeldt D. Gut microbiota in psychiatric disorders: a systematic review. Psy-chosom Med. 2021; 83: 679-92. DOI: https://doi.org/10.1097/ PSY.0000000000000959
8. Di Guglielmo M.D., Franke K.R., Robbins A., Crowgey E.L. Impact of early feeding: metagenomics analysis of the infant gut microbi-ome. Front Cell Infect Microbiol. 2022; 12: 816601. DOI: https://doi. org/10.3389/fcimb.2022.816601
9. Chandra P., Enespa, Singh R., Arora P.K. Microbial lipases and their industrial applications: a comprehensive review. Microb Cell Fact. 2020; 19: 169. DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-020-01428-8
10. Tavares N.K., Zayas C.L., Escalante-Semerena J.-C. The Methanosar-cina mazei MM2060 gene encodes a bifunctional kinase/decarboxylase enzyme involved in cobamide biosynthesis. Biochemistry. 2018; 57 (30): 4478-95. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.biochem.8b00546
11. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Edited by Devlin T.M. 5th ed. New York: John Wiley & Sons, 2001: 1216 p. ISBN 0-47141136-1.
12. Bagryantseva O.V., Khotimchenko S.A., Sheveleva S.A., Minaeva L.P., Semenova P.A. On the use of the enzyme transglutaminase in the food industry. Pishchevaya promyshlennost' [Food Processing Industry].
2021; (10): 78-81. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021.10.10.016 (in Russian)
13. Rimareva L.V., Tsurikova N.V., Kostyleva E.V., Sereda A.S. Recombinant strain of filamentous fungus Aspergillus awamori — producer of a complex of enzymes glucoamylase and xylanase. RU Patent No. 2457246, priority dated 21.03.2011. (in Russian)
14. Rozhkova A.M., Sereda A.S., Tsurikova N.V., Nurtaeva A.K., Semenova P.A., Rimareva L.V., et al. Creation of a system for the expression of heterologous genes based on a recombinant strain of the fungus Aspergillus awamori. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied Biochemistry and Microbiology]. 2011; 47 (3): 308—17. (in Russian)
15. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. In: Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington: The National Academies Press, 2011.
16. Handbook of microbiological and virological research methods. Edited by M.O. Birger. Moscow: Meditsina, 1982: 464 p. (in Russian)
17. Gause G.F. Key to actinomycetes: Genera Streptomyces, Streptover-ticillium, Chainia. Moscow, 2021: 248 p. ISBN 978-5-458-47107-7 (in Russian)
18. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 9th ed. Edited by J.G. Holt, H.R. Krieg. Baltimore, London: Williams and Wilkins, 1994: 787 p. ISBN 978-0683006032.
19. Stemke D.J. Genetically modified microorganisms. biosafety and ethical issues. Edited by S.R. Parekh. The GMO Handbook: Genetically Modified Animals, Microbes, and Plants in Biotechnology. Totowa, NJ: Humana Press, 2004: 85—130.
20. Lee G.R. The balance of Th17 versus Treg cells in autoimmunity. Int J Mol Sci. 2018; 19 (3): E730. DOI: https://doi.org/10.3390/yms19030730.
21. Bagryantseva O.V., Gmoshinski I.V., Shipelin V.A., Tsurikova N.V., Sheveleva S.A., et al. Assessment of health risks of an enzyme preparation - a complex of glucoamylase and xylanase from Aspergillus awamori Xyl T-15. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (3): 28—39. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-3-28-39 (in Russian)
