CC BY
50
16. Paglia D. E., Valentine W. N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase // The journal of laboratory and clinical medicine. - 1967. - Vol. 70. -P. 158-169.
17. Patel R. P. [et al.] Antioxidant mechanisms of isoflavones in lipid systems: paradoxical effects of peroxyl radical scavenging // Free radical. biol. med. - 2001. - Vol. 31. - P. 1570-1581.
18. Reddy V. N. Metabolism and function of glutathione in the lens // Human cataract formation. - London: Pitman, 1984. -Vol. 106. - P. 65-83.
19. Spector А. The search for a solution to senile cataracts. Proctor lecture // Investigative ophthalmology & visual science. - 1984. -Vol. 25. № 2. - Р. 130-146.
20. Srivastata S. К., Awasthi S., Wang L. [et a1] Attenuation of 4-hydroxynonenal induced cataractogenesis in rat lens by butylated hydroxytoluene // Current eye research. - 1996. - Vol. 15. - Р. 749-754.
21. Tappel A. L., Zalkin Н. Lipide peroxidation in isolated mitochondria // Archives of biochemistry. - 1959. - Vol. 80. № 2. - P. 326-332.
Поступила 27.09.2010
Ю. В. КУДРЯВЦЕВА12, А. Д. ЧУПРОВ12, И. П. ИВАНОВА3
ОЦЕНКА УРОВНЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ В ХРУСТАЛИКЕ ГЛАЗА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА
Кировская клиническая офтальмологическая больница,
Россия, 610011, г. Киров, Октябрьский пр-т, 10а;
2Кировская государственная медицинская академия,
Россия, 610000, г. Киров, ул. К. Маркса, 112;
3лаборатория физико-химических исследований НИИ ПФМ Ниж ГМА,
Россия, 603098, г. Нижний Новгород, пр-т Гагарина, 70. E-mail: July_Kud@mail.ru
Исследовали катарактальные хрусталики пациентов различного возраста. Оценивали интенсивность перекисного окисления, содержание продуктов перекисного окисления, содержание липидов, общий белок и окислительную модификацию белков. Выявлены взаимосвязь окислительных процессов липидов и белков в хрусталике и снижение с возрастом потенциальной возможности к окислению как липидов, так и белков хрусталика.
Ключевые слова: хрусталик, белки хрусталика, липиды хрусталика, перекисное окисление.
Y. V. KUDRYAVTSEVA1-2, A. D. CHUPROV1-2, I. P. IVANOVA3
ESTIMATION OF AGE DEPENDING LEVEL OF LIPIDS AND FIBERS OXIDATION PROCESSES IN THE CRYSTALLINE LENS
1 Kirov clinical ophthalmologic hospital,
Russia, 610011, Kirov, Octyabrsky av., 10а;
2Kirov state medical academy,
Russia, 610000, Kirov, K. Marx str., 112;
3Laboratory physical and chemical researches, Scientific research institute NizhSMA,
Russia, 603098, N. Novgorod, Gagarin's av, 70. E-mail: July_Kud@mail.ru
Cataract crystalline lenses of patients of various age were investigated. The intensity of peroxidation, the content of products peroxidation, the content of lipids, the total protein and oxidative modifacation of fibers were estimated. The interrelation of oxidation processes of lipids and proteins in a crystalline lens and decrease potential possibility to oxidation as lipids as and proteins of a crystalline lens with the age were revealed.
Key words: a crystalline lens, crystalline lens fibers , crystalline lens lipids, peroxidation.
Основные исследования хрусталика направлены на изучение механизмов его помутнения - катаракто-генеза, что является актуальной проблемой офтальмологии. В то же время не менее интересно изучение изменений хрусталика в процессе старения организма. Хрусталик более чем на 95% состоит из белков. Именно роли белков хрусталика в развитии помутнений и посвящена большая часть научных работ [1, 13, 14]. Несмотря на это, целым рядом авторов отмечается исключительная важность роли липидов как инициаторов процессов, ведущих к трансформации белков и, как следствие, к изменению оптических и механи-
ческих свойств хрусталика в процессе старения [1, 2, 3, 7, 11, 12, 18].
Активация свободнорадикальных процессов, в частности, перекисного окисления липидов, имеет важное значение при развитии патологических процессов и старении [5, 6]. Ткань хрусталика состоит из плотно упакованных волокон, являющихся производными эпителиальных клеток капсулы. Как и все клетки, волокна окружены клеточной мембраной, состоящей из липидного бислоя [1]. Волокна содержат большое количество белков, от которых зависят прозрачность и преломляющая способность хрусталика. Нормальное функционирование
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011 УДК 617741-053:577 115:577 112
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
этой системы невозможно без «здоровой» мембраны, окружающей и отграничивающей матрикс волокна от окружающей среды. В последнее время при изучении патогенеза развития возрастных изменений хрусталика пристальное внимание исследователей привлекают мембраны волокон. Еще в 1991 году в Бельгии в рамках программы по исследованию старения был проведен симпозиум «Мембраны хрусталика и старение». Причиной столь большого интереса к данной теме явилось осознание того факта, что именно мембраны хрусталиковых волокон играют решающую роль в развитии и поддержании высокой упорядоченности структур хрусталика. Появились веские основания считать, что нарушение мембранных процессов является главной причиной изменения его оптических и физических свойств [3, 15, 16, 17]. Известно, что накопление в мембранах продуктов окисления липидов, особенно перекисей, меняет структуру мембран, проницаемость и устойчивость липид-белковых комплексов, вызывает инактивацию ферментов, разрушение белков и, следовательно, изменение функциональной активности мембран [10]. Свободные радикалы способны эффективно окислять и тем самым инактивировать различные белки, разрушать некоторые полисахариды, что приводит к нарушению всех 4 структур белка [4]. Таким образом, увеличение количества свободных радикалов и активация перекисного окисления липидов приводят к нарушению функций, мембранно-белковых комплексов, биологических мембран и структурно-функционального состояния клеток. По нашему мнению, нарушение липидного обмена является ведущим звеном в процессе изменении оптических и физических свойств хрусталика, хотя конкретные механизмы этих нарушений ещё недостаточно изучены.
Цель работы - оценить уровень продуктов пере-кисного окисления липидов и уровень окислительной модификации белка в хрусталике глаза в процессе старения.
Материалы и методы
Для исследования отобраны пациенты в возрасте от 50 до 90 лет (средний возраст составил 73 года). Пациенты разделены в группы по возрастам. Исследовано 21 ядро хрусталика с катарактой различной степени зрелости. Ядра хрусталика получали методом экс-тракапсулярной экстракции катаракты по стандартной технологии. Исследовали: интенсивность хемилюми-несценции по значению светосуммы ХЛ за 30 секунд. На интенсивность этого процесса оказывает влияние полный комплекс соединений, обладающих как антиок-сидантным, так и прооксидантным действием, то есть метод дает возможность оценить уровень компенсаторных механизмов в организме. Все измерения проводились на приборе БХЛ-06М (г. Нижний Новгород), выражались в мВ;
экстракцию липидов из анализируемого материала проводили методом Folch;
ультрафиолетовая спектроскопия первичных и вторичных продуктов ПОЛ: диеновых (ДК) и триеновых конъюгатов (ТК). В своих исследованиях для оценки количества ДК мы использовали метод, основанный на изменении величины поглощения раствора липидов в метанол-гексане (5:1 по объёму) при длине волны 233 нм. Оценку количества ТК проводили в этом же субстрате при длине волны 275 нм. Содержание конъюгатов в пробе выражали в единицах оптической плотности;
анализ содержания малонового диальдегида (МДА) с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты. Количество МДА выражали в миллимолях на литр. Измерения проводили на СФ-46 (г. Ленинград, 1995);
определение оснований Шиффа (ОШ). Измерения проводили на спектрофлюориметре «Флюорат 02 Панорама» (С.-Петербург, 2009);
определение окислительной модификации белков. Метод основан на принципе определения степени окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных, основанном на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразоном (2,4-ДН-ФГ) с образованием производных 2,4-динитрофени-лгидразона;
общий белок определяли с помощью набора «общий белок-Витал» (фирма «Витал Диагностикс Спб»).
Данные по окислительным процессам липидов пересчитывали на количество липидов в каждом образце, а данные по окислительной модификации белков (ОМБ) пересчитывали на количество общего белка в каждом образце. Результаты статистически обработаны в программе «Microsoft Excel». Оценивали критерий достоверности различия сравниваемых групп (р).
Результаты и обсуждение
Концентрация первичных продуктов перекисного окисления липидов (ДК) с возрастом постепенно снижается в 5 раз. Так, в 50 лет уровень ДК составляет
0,74 отн. ед./г/л, а к 80 годам он снижается до 0,15 отн. ед./г/л (р<0,01).
Уровень вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ТК, МДА) снижается в возрастном интервале от 50 до 70 лет на порядок. Уровень ТК снижается с 0,35 до 0,058 отн. ед./г/л (р<0,05), а уровень МДА снижается с 0,06 до 0,018 отн. ед./г/л (р<0,05). В группе 80 лет по сравнению с 70 годами уровень МДА незначительно возрастает - до 0,026 отн. ед./г/л., уровень ТК - до 0,067 отн. ед./г/л (рис. 1).
Конечные продукты ПОЛ (ОШ) имеют тенденцию, сходную с вторичными продуктами ПОЛ. Так, с 50 до 70 лет их уровень снижается с 10,8 до 1,08 отн. ед. /г/л (р<0,05), а в группе 80 лет уровень ОШ незначительно возрастает - до 1,3 отн. ед. /г/л по сравнению с группой 70 лет (р<0,05).
При исследовании интегрального уровня свободнорадикальных процессов (ХЛ) наблюдалась сходная направленность окислительных процессов. С 50 до 70 лет уровень ХЛ снижается с 2,98 до 0,7 мВ/г/л (р=0,1), в группе 80 лет ХЛ незначительно возрастает - до 0,85 мВ/г/л по сравнению с группой 70 лет (р<0,05).
При оценке уровня окислительной модификации белков было выявлено, что на длинах волн 270, 363, 370, 430 нм в группах с 50 до 70 лет наблюдается снижение уровня ОМБ в 5,1-3,4 раза (р<0,05), в группе 80 лет наблюдается увеличение в 1,6-2,3 раза относительно группы 70 лет (р<0,05). При длине волны 530 нм отмечается снижение уровня ОМБ при старении с 0,02 до 0,012 отн. ед. /г/л (р<0,05) (рис. 2).
Таким образом, в процессе старения организма наблюдается постепенное снижение молекулярных продуктов перекисного окисления липидов. В группе 80 лет наблюдается незначительное возрастание окислительных процессов в липидах по сравнению с группой 70 лет, за исключением вторичных продуктов перекисного окисления - МДА.
□ ДК (отн. ед/г/л)х10
□ ТК (отн. ед/г/л)х10
□ МДА (отн. ед/г/л)х10
□ ОШ (отн. ед/г/л)
■ ХЛ (мВ/г/л)
Возраст
Рис. 1. молекулярные продукты пол в хрусталике пациентов с катарактой относительно уровня общих липидов в пробе
□ Альдо-ДНФГо-270
□ Кето-ДНФГн-363
□ Альдо-ДНФГн-370
□ Кето-ДНФГо-430
■ Альдо-ДНФГо-530х10
70
Возраст (лет)
Рис. 2. Уровень окислительной модификации белков (относительно общей концентрации белка в пробе) (отн. ед./г/л)
С возрастом (группы 50-70 лет) уровень окислительной модификации белков в хрусталике у людей снижается. В группе 80 лет наблюдается незначительное возрастание окислительных процессов по сравнению с группой 70 лет, за исключением альдегид-динит-рофенилгидразонов основного характера (530 нм), этот показатель в хрусталике людей 80-летнего возраста ниже показателей 70-летнего возраста.
В здоровом организме при физиологических условиях формируется динамическое прооксидантно-анти-оксидантное равновесие между концентрацией кислорода, который поступает в клетку, продукцией активных форм кислорода, с одной стороны, и элиминацией их системой антиоксидантной защиты, с другой стороны [8]. В результате различных видов активации фактически получается возрастание концентрации свободных радикалов, из которых при участии окислительно-восстановительных реакций происходит образование перекиси водорода и эндогенного кислорода. Появившийся кислород инициирует оксидазные реакции клеток, в частности, активирует перекисное окисление в мембранах. Вместе с этим кислородные свободные радикалы активируют антиоксидантную систему клеток, индуцируя синтез ферментативных антиоксидантов. Кроме этого стимулируются процессы, которые приводят к повышению интенсификации реакций цикла Кребса и вовлечению восстановленных эквивалентов с участием дыхательной цепи в окислительное фосфорилиро-вание. Такое протекание реакций способно обеспечить не только эффективную элиминацию свободноради-
кальных метаболитов и продуктов ПОЛ (МДА и других недоокисленных субстратов), но и их использование в различных синтезах, которые поддерживают индукцию антиоксидантов и репарацию повреждённых клеточных мембран. При нарушении этого равновесия повреждения мембран накапливаются, нарушается нормальное функционирование клетки. Можно допустить, что все необратимые структурные изменения в биомембранах могут быть одной из основных причин старения [9]. Биологическая мембрана волокна хрусталика является барьером, который отделяет белки хрусталика от межклеточного вещества и поддерживает постоянство среды внутри клетки. Повреждение мембраны может быть связано с различными внешними и внутренними факторами, в том числе старением, в результате нарушается управление биохимическими процессами, что приводит к патологическим изменениям клетки. Из рисунков 1 и 2 видно, что изменения липидов и белков в хрусталике с возрастом идут параллельно и взаимосвязанно. Можно предположить, что первично происходят деградация мембран, повреждение липидов, а затем изменение белков волокон приводит к появлению помутнений.
Заключение
1. Окислительные процессы липидов и белков в хрусталике глаза человека взаимосвязаны. Деградация липидов мембран волокон хрусталика ведет к нарушению мембранного транспорта и изменяет внутреннюю среду клетки. Происходит повреждение белков, и,
Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
УДК 617.753.1-089:615.849.19 Кубанский научный медицинский вестник № 1 (124) 2011
соответственно, нарушаются физические свойства ткани хрусталика.
2. С возрастом снижается потенциальная возможность субстратов как липидов, так и белков хрусталика к окислению, что является признаком нарушения равновесия между окислением и антиоксидантной защитой и снижением возможностей к восстановлению поврежденных структур.
литература
1. Веселовская З. Ф. Катаракта. - Киев: Книга плюс, 2002. -208 с.
2. Воробей В. А. Механизмы фотосенсибилизации повреждения белков и липидов биологических мембран / В. А. Воробей, Е. А. Черницкий // Исследование структуры, физических свойств и энергетики биологически активных молекул: Материалы II координационного семинара по интегральной теме научно-технического сотрудничества минвузов СССР и ЧССР. - Вильнюс, 1986. - С. 54.
3. Деев А. И., Асейчев А. В., Владимиров Ю. А. Свободнорадикальные аспекты катарактогенеза // Вестник Российской академии медицинских наук. - 1999. - № 2. - С. 22-26.
4. Журавлев А. И. Развитие идей Б. Н. Тарусова о роли цепных процессов в биологии // Сб. статей «Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии». - М.: Наука, 1982. - С. 3-36.
5. Зенков Н. К. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты / Н. К. Зенков, В. З. Ланкин, Е. Б. Мень-щикова. - М.: МАИК «Наука / Интерпериодика», 2001. - 343 с.
6. Костюк В. А. Биорадикалы и биоантиоксиданты / В. А. Кос-тюк, А. И. Потапович. - Мн.: БГУ, 2004. - 174 с.
7. Мальцев Э. В., Вит В. В., Черняева С. Н. и др. Неспецифические эффекты воздействия света на орган зрения // Офтальмологический журнал. - 1999. - № 2. - С. 88-93.
8. Тимочко М. Ф., Єлісєєва О. П., Кобилінська Л. Л., Тимочко І. Ф. Метаболічні аспекти формування кисневого гомеостазу в екстремальних станах. - Львов, 1998. - 58 с.
9. Треушников В. М. Катаракта и процессы старения клеток: возможные механизмы старения и замедления этих процессов // Визит к офтальмологу. - 2009. - № 12. - С. 10-45.
10. Храпова Н. Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических антиоксидантов // Сб. статей «Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии». - М.: Наука, 1982. -С. 59-72.
11. Borchman D., Lamba O. P., Yappert M. C. Structural characterization of lipid membranes from clear and cataractous human lenses // Exp. eye res. - 1993 Aug. - V. 57. № 2. - P. 199-208.
12. Cenedella R. J., Fleschner C. R. Selective assotiation of crystallins with lens «native» membrane during dynamic cataractogenesis // Curr. eye res. - 1992. - № 11 (8). - P. 801-815.
13. Deyev A. I., Sitartchuk I. A., Aseychev A. V. et al. // Phys. chem. med. - 1996. - Vol. 3. № 2. - P. 38-42.
14. Feng J., Smith D. L., Smith J. B. Human lens beta-crystallin solubility // J. biol. chem. - 2000 Apr. - V. 275. № 16. - P. 11 58511 590.
15. Garner M. H. // Proc. Nat. acad. sci. USA. - 1981. - Vol. 78. -P. 1892-1895.
16. Weale R. A. A Biography of the Eye: Development, Growth, Age, H. K. - Lewis, London, 1982.
17. Zigler J. S., Hess H. H. // Invest. ophthal. - 1983. - Vol. 24. -P. 75.
18. Zigman S., Paxhia T., Marinetti G., Girsch S. Lipids of human lens fiber cell membranes // Curr. eye res. - 1984, Jul. - V. 3. № 7. -P. 887-896.
Поступила 25.09.2010
И. А. МУШКОВА, А. В. ДОГА, А. Н. БЕССАРАБОВ
ЛАЗЕРНАЯ ТЕРМОКЕРАТОПЛАСТИКА (ЛТК): ОПТИМИЗАЦИЯ ДЛИНЫ ВОЛНЫ И ЭНЕРГИИ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАЗЕРНОЙ ЭНЕРГИИ В ТКАНИ РОГОВИЦЫ
ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С. Н. Федорова Росмедтехнологии»,
Россия, 127486, г. Москва, Бескудниковский б-р, 59а. E-mail: a.n.bessarabov@mntk.ru
Целью работы явилась разработка математической модели теплообмена в роговице при инфракрасном (ИК)-лазер-ном воздействии и определении оптимальных длин волн для эффективной и безопасной коагуляции на основе методов математического моделирования и морфологических исследований. Полученные результаты позволили разработать математическую модель теплообмена при ИК-лазерном воздействии на роговицу, рассчитать распределение температуры в зоне воздействия для любого сочетания параметров роговицы и режимов работы лазерной установки с целью оптимизации лазерного воздействия, а также определить наиболее предпочтительную для ЛТК длину волны - 2,12 мкм, сочетающую в себе возможность получения интрастромального коагулята с минимальным повреждением структур роговицы.
Ключевые слова: лазерная термокератопластика, радиационно-кондуктивный теплообмен.
I. A. MUSHKOVA, А. V. DOGA, А. N. BESSARABOV
LASER THERMOKERATOPLASTY (LTK): OPTIMIZATION OF THE WAVELENGTH AND ENERGY OF THE RADIATION ON THE BASIS OF ANALYSIS OF THE DISTRIBUTION OF LASER ENERGY IN THE CORNEAL TISSUE
FGU «MNTK «Eye microsurgery» them. acad. S. N. Fyodorov,
Russia, 127486, Moscow, Beskudnikovskiy blvd, 59a. E-mail: a.n.bessarabov@mntk.ru
