CC BY
43
УДК 612.844.1:612.67:612.085
Князев Д.И., Иванова И.П., Кудрявцева Ю.В., Трофимова С.В., Сошникова О.О., Бурхина О.Е.
МАУЗ «Кировская клиническая офтальмологическая больница»
НИИ Прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии, г. Нижний Новгород
Е-mail:[email protected]
ЛИПОПЕРОКСИДАЦИЯ В ХРУСТАЛИКЕ КРЫС В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ
Оценена интенсивность свободно-радикальных процессов в ткани хрусталика крыс в возрасте 1, 12 и 24 месяца. В частности, исследован уровень молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), антиоксидантов и двойных связей в липидной фракции ткани хрусталика. Показана вероятная связь уровня двойных связей с интенсивностью свободно-радикальных процессов. Ключевые слова: хрусталик, липопероксидация, липиды хрусталика, старение.
Актуальность
В настоящее время роль активных форм кислорода (АФК) в биохимических и физиологических процессах оценивается двойственно. С одной стороны, АФК рассматриваются как негативные агенты, инициирующие неконтролируемые процессы свободнорадикального окисления, что может приводить к необратимой дисфункции клеточных структур, преждевременному старению и гибели клеток [1]. Тем не менее, в ходе последних двух десятилетий выявлена существенная роль АФК в процессе пролиферации клеток [2-4].
В контексте биохимии старения хрусталика и развития патологических изменений данного органа так же предполагается интенсификация свободно-радикальных процессов. В частности, показаны многочисленные пост-трансляционные модификации кристаллинов - белков, определяющих светопропускаю-щюю способность и составляющих основную массу хрусталика, - при процессах старения и развития катаракты [5-9]. Предполагается, что данные модификации структуры кристал-линов происходят главным образом вследствие действия АФК и являются одним из движущих факторов катарактогенеза. Однако характер и многообразие пост-трансляци-онных модификаций ставит вопросы относительно биохимических механизмов их возникновения и роли свободнорадикальных реакций в этих процессах. Наряду с этим, исследуются изменения липидного состава волокон хрусталика, что может иметь существенное значение в функциональной активности мембран и, соответственно, влиять на восприим-
чивость кристаллинов к потенциальному повреждающему действию продуктов липопе-роксидации [10,11].
Цель
Оценить интенсивность свободнорадикальных процессов в ткани хрусталика крыс в процессе постнатального развития.
Материал и методы
Эксперименты проведены на крысах самцах линии Wistar трех возрастных групп: 1 месяц (n=20), 12 месяцев (n=16), и 24 месяца (n=20) при продолжительности жизни крыс 3040 месяцев. Крысы линии Wistar склонны к образованию признаков катаракты к 20-30 месяцам жизни [12], что может дать основания рассматривать вероятную связь исследуемых показателей окисления липидов хрусталика с процессом катарактогенеза.
Хрусталики гомогенизировали на льду в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:25 (масса хрусталика к объему раствора) Гомогенат ткани хрусталика использовался при дальнейшем анализе. Спектрофотометрические и спектрофлуориметри-ческие измерения выполнены с использованием прибора «Флюорат 02 Панорама» (С.-Петербург 2009).
Экстракцию и очистку липидов из анализируемого материала проводили методом Folch [13]. Уровень общих липидов определяли с помощью набора «Bio-Test Total Lipids» (PLIVA-Lachema, Чехия) - метод основан на взаимодействии продуктов гидролиза липидов концентрированной серной кислотой с фосфованилиновым
реактивом с образованием окрашенного продукта, концентрацию которого, в свою очередь, оценивали спектрофотометрически. Содержание диеновых конъюгатов, сопряженных кетодиенов и двойных связей оценивали спектрофотометрически [14]. Уровень оснований Шиффа измеряли по интенсивности флуоресценции [15]. Уровень ТБК-активных продуктов, соответствующих, по большей части, содержанию малонового диальдегида (МДА) оценивали спектрофотометрически [16]. Концентрацию ТБК-активных комплексов также соотносили с количеством липидов и выражали в нмоль/мг липидов. Оценку уровня б-токоферола и ретинола проводили спек-тофлюориметрически [17,18]. Уровень всех параметров, за исключением ТБК-активных комплексов, относили к количеству липидов и выражали в относительных единицах.
Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы 31а118Иса 6.0. Оценку межгрупповых различий проводили с использованием дисперсионного анализа ANOVA
с post-hoc поправкой Бонферрони. Выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при р<0,05 [19].
Результаты и обсуждение
Относительное содержание диеновых и триеновых конъюгатов, образующихся на начальных этапах ПОЛ, повышалось от 1 к 12 месяцам и уменьшалось приблизительно вдвое от 12 к 24 месяцам (рис 1а). Уровень оснований Шиффа, одного из конечных продуктов липо-пероксидации, не менялся от 1 к 12 месяцам и так же вдвое снижался к двухлетнему возрасту. В то же время, концентрация ТБК-активных комплексов, соответствующих малоновому диальдегиду, образующемуся на промежуточных стадиях окисления липидов, равномерно снижалась в ряду 1-12-24 месяца (рис 1б).
Содержание б-токоферола незначительно различалось между группами, тогда как уровень ретинола был снижен у группы 24 месяца по сравнению с остальными (рис 2а). Эти дан-
Рисунок 1. Продукты ПОЛ в ткани хрусталика крыс. а) Уровень диеновых конъюгатов (ДК), сопряженных кетодиенов/триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ). Различия в уровнях ДК и ТК между статистически значимы между всеми группами; * - статистически значимые отличия группы 24 мес. от групп 1 и 12 мес. б) Концентрация ТБК-активных комплексов. ** - статистически значимые
различия между группами 1 и 24 мес.
Рисунок 2. а) Содержание токоферола и ретинола в ткани хрусталика. * - статистически значимые отличия группы 24 мес. от остальных групп. б) Уровень двойных связей. ** - статистически значимые различия между
группой 12 мес. и группами 1 и 24 мес.
ные позволяют предположить, что б-токофе-рол и ретинол, присутствуя в липидной фракции клеток хрусталика и выполняя антиокси-дантные функции, тем не менее, не являются основными факторами, определяющими интенсивность свободно-радикального окисления в процессе постнатального развития хрусталика. В то же время, уровень двойных связей в ткани хрусталика, отражающий степень ненасыщенности углеводородных цепей липидов, был повышен у группы 12 месяцев по сравнению с остальными (рис 2б). Эти результаты позволяют предположить, что увеличение содержания двойных связей, являющихся потенциальными мишенями липопероксидации, может быть тесно связано с относительно высоким уровнем продуктов ПОЛ в хрусталиках крыс возраста 12 месяцев.
Преобладание продуктов липопероксида-ции (ДК, ТК, ОШ) в хрусталиках крыс младших возрастных групп может быть обусловлено активностью мембранной НАДФН-оксида-зы. Данный мультисубъединичный комплекс вовлечен в передачу сигнала с рецепторов факторов роста (инсулиноподобный фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста и др.) [20,21]. Продуцируемые НАДФН-оксидазой АФК являются промежуточным звеном реализации сигнальных каскадов, ответственных за пролиферацию [22]. С учетом большей доли делящихся клеток эпителия и растущих слабо-дифференцированных клеток коры хрусталика по сравнению с окончательно сформированными волокнами ядра хрусталика можно предположить значительный вклад мембранной НАДФН-оксидазы в генерацию продуктов ПОЛ у крыс в возрасте 1 месяц. Участие мембранной НАДФН-оксида-зы в процессе дифференцировки клеток остается под вопросом. Однако по данным исследований [23], продолжительность внутриклеточных сигнальных каскадов, вовлеченных в дифференцировку, является даже большей по сравнению с сигнальными каскадами, вовлеченными в процесс пролиферации. В связи с тем, что процесс дифференцировки также инициируется ростовыми факторами, можно так же предположить участие НАДФН-оксидазы в интенсификации перекисного окисления липидов хрусталика у крыс возраста 12 месяцев.
Активность митохондрий также может играть важную роль в генерации продуктов ПОЛ в хрусталиках младших возрастных групп, поскольку у крыс к 24 месяцам основная масса хрусталика представлена окончательно сформированными волокнами коры и ядра, характеризующимися утратой клеточных органелл [24]. В связи с последовательным снижением концентрации ТБК-активных комплексов в ряду 1-12-24 месяца не исключается возможность того, что уровень малонового диальдегида специфическим образом связан с активностью клеток эпителия хрусталика, снижающейся в процессе старения.
Вклад в наблюдаемое снижение интенсивности свободно-радикальных процессов к 24 месяцам может вносить и изменение липидного состава мембран. Исследования липидного состава мембран хрусталиков животных и человека показали увеличение содержания сфинго-, ди-гидросфингомиелина и холестерина в мембранах хрусталиков у представителей различных возрастных групп [11,25]. Показано, что сфин-гомиелины и холестерин эффективно препятствуют процессам латерального транспорта кислорода по мембранам и окислению ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов [26,27].
Заключение
Таким образом, в ходе исследования проанализирована динамика изменений уровня продуктов ПОЛ, антиоксидантов и ненасыщенных субстратов в ткани хрусталика крыс в ряду возрастов 1-12-24 месяца. Отмечено более высокое содержание диеновых конъюгатов, сопряженных кетодиенов и оснований Шиффа в возрасте 12 месяцев по сравнению с возрастом 1 и 24 месяца. Концентрация ТБК-активных комплексов с возрастом равномерно снижалась. Однако интенсивность липопероксидации в хрусталике, по всей видимости, в большей степени определяется концентрацией ретинола, нежели б-токоферола. Максимальный уровень двойных связей наблюдался в 12 месяцев, как и уровень первичных (ДК) и вторичных (ТК) продуктов ПОЛ, что позволяет предположить наличие связи между количеством ненасыщенных субстратов и интенсивностью свободнорадикальных процессов.
12.10.2011
Список литературы:
1. Harman D. Free-radical theory of aging: increasing the functional life span. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. 717, 257-266.
2. Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K, Finkel T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 1995;270:296-299.
3. Finkel T., Holbrook NJ. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature 2000; 408:239-247.
4. Burdon RH. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation. Free. Radic. Biol. Med. 1995;18:775-794.
5. Santhoshkumar P, Murugesan R, Sharma KK. бА-Crystallin peptide 66SDRDKFVIFLDVKHF80 accumulating in aging lens impairs the function of б-crystallin and induces lens protein aggregation. PloS ONE 6(4) e19291. doi:10.1371/ journal.pone.0019291.
6. Huang CH, Wamg YT, Tsai CF, Chen YJ, Lee JS. Phosphoproteomics characterisation of novel phosphorylated sites of lens proteins from normal and cataractous human eye lenses. Mol.Vis. 2011; 17:186-198.
7. Wilmarth PA, Tanner S, Dasari S Age-related changes in human crystallins determined from comparative analysis of posttranslational modifications in young and aged lens: does deamidation contribute to crystallin insolubility? J. Proteome Res. 2006. 5:2554-2564.
8. Hains PG, Truscott RJW. Post-translational modifications in the nuclear region of young, aged, and cataract human lenses. J. Proteome Res. 2007. 6:3935-3943.
9. Fujii N, Ishibashi Y, Satoh K. Simultaneous racemization and isomerization at specific aspartic acid residues in alpha B-crystallin from the aged human lens. Biochim. Biophys. Acta. 1994. 1204: 157-163.
10. Grami V, Marrero Y, Huang L, Tang D, Yappert MC, Borchman D. б-Crystallin binding in vitro to clear human lenses. Exp. Eye Res. 2005. 81, 138-146.
11. Yappert MC, Borchman D. Sphingolipids in human lens membranes: an update on their composition and possible biological implications. Chem. Phys. Lipids. 2004:129, 1-20.
12. Rumyantseva YuF, Fursova AZh, Fedosseva LA, Kolosova NG. Changes in physicochemical parameters and б-crystalline expression in the lens during cataract development in OXYS rats. Biochemistry (Mosc). 2008;73: 1176-82
13. Folch PJ, Lees M, Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 1957. 226, 497-509.
14. Shenstone FS. Ultraviolet and visible spectroscopy of lipids.- N.Y.-1971.- p. 77-93.
15. Fletcher DL., Dillared CJ., Tappel AY. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues. Analyt. Biochem. 1973. 52, 497-499.
16. Smith JB., Ingerman CM. Lab. Clin. Med. 1976. 88: 167 - 172.
17. Hewavitharana AK, Lanari MC, Becu C. Journal of Chromatography A. 2004; 1025(2): 313-317
18. Parrish DB, Moffitt RA, Noel RJ, Thompson JN(1985) In:J. Augustin BP, Klein DA, Beckery PB. (Eds.), Methods of Vitamin Assay. John Wiley and Sons, New York, pp153.
19. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.,Практика, 1998. - 459 с.
20. Wang Y, Lou MF. The regulation of NADPH oxidase and its assotiation with cell proliferation in human lens epithelial cells. IOVS. 2009;50:2291-2300.
21. Lovicu FJ, McAvoy JW, De Iongh RU. Understanding the role of growth factors in embryonic development: insights from the lens. Phil. Trans. R. Soc. B .2011. 366: 1204-1218.
22. Chen KC, Zhou Y, Xing K, Krysan K, Lou MF. Platelet-derived growth factor (PDGF)-induced reactive oxygen species in the lens epithrlial cells: the redox signalling. Exp. Eye Res. 2004; 78: 1057-1067.
23. Wang Q, McAvoy JW, Lovicu FJ. Growth factor signaling in vitreous humor-induced lens fiber differentiation. IOVS. 2010; 51: 3599-3610.
24. Bassnett S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. 36, 1793-1803
25. Yappert MC, Rujoi M, Borchman D, Vorobyov I, Estrada, R. Glycero- versus sphingo-phospholipids: correlations with human and non-human mammalian lens growth. Exp. Eye Res. 2003. 76, 725-734.
26. Raguz M, WidomskaJ, Dillon J, Gaillard ER, Subczynski W.K. Characterization of lipid domains in reconstituted porcine lens membranes using EPR spin-labeling approaches. Biochim. Biophys. Acta. 2008. 1778, 1079-1090.
27. Oborina EM., Yappert MC. Effect of sphingomyelin versus dipalmitoyl-phosphatidylcholine on the extent of lipid oxidation. 2003. Chem. Phys. Lipids. 123, 223-232.
UDC 612.844.1:612.67:612.085
Knyazev D.I., Ivanova I.P., Kudryavtseva Y.V., Trofimova S.V., Soshnikova O.O., Burkhina O.E. LIPOPEROXIDATION OF RATS LENS IN THE PROCESS OF AGE PROGRESS
Intensivity of free-radical processes was estimated in lens tissue from 3 groups of rats - 1, 12 and 24-month old. In particular, lipoperoxidation molecular products content, levels of antioxidants and double bonds derived from lens lipid fraction were measured. Probable association between double bonds level and lipoperoxidation intensity was concluded.
Key words: lens, lipoperoxidation, lens lipid, age progress.
