CC BY
85
УДК617.741:577.115:577.115
Кудрявцева Ю.В., Чупров А.Д., Иванова И.П.
Кировская клиническая офтальмологическая больница, г. Киров Лаборатория физико-химических исследований НИИ ПФМ Ниж ГМА г. Н. Новгород
E-mail: july_kud@mail.ru
ВЗАИМОСВЯЗЬ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ ХРУСТАЛИКА
В статье рассматривается взаимосвязь липидов и белков хрусталика при старении и развитии катаракты. Для этого проведен ряд биохимических тестов по определению окислительной модификации белков и липидов, исследованию жирнокислотного состава ядра хрусталика. Выявлены параллельные изменения белков и липидов в процессе старения.
Ключевые слова: липиды, белки, хрусталик.
Актуальность. Изменения белков при ка-тарактогенезе разнообразны: окисление суль-фгидрильных групп, в том числе и мембранных белков, образование межмолекулярных дисуль-фидных связей между г - кристаллинами и белками мембран, деградация липопротеидов мембран волокон коры и ядра, и уменьшение содержания фибронектина в мембранах, и т. д. Все это приводит к значительному ухудшению оптических свойств хрусталика. Такие изменения практически не поддаются коррекции. Появление помутнений свидетельствует о глубоких изменениях свойств белков хрусталика и развитии катаракты. В этом случае уже не обойтись без оперативного вмешательства. Наибольший интерес в изучении старения хрусталика, на наш взгляд, представляют те процессы, которые запускают механизм на ранних этапах, еще до повреждения белков и развития помутнений, т. е. на момент нарушения аккомодации и появления окраски ядра хрусталика. Целым рядом авторов отмечается исключительная важность роли липидов как инициаторов процессов, ведущих к трансформации белков и, как следствие, к изменению оптических и механических свойств хрусталика. [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. Активация свободнорадикальных процессов и, в частности, пере-кисного окисления липидов, имеет важное значение при развитии патологических процессов и старении. [8, 9] Накопление в мембранах продуктов окисления липидов, особенно перекисей, меняет структуру мембран, проницаемость и устойчивость липид-белковых комплексов, вызывает инактивацию ферментов, разрушение белков и, следовательно, вызывает изменение функциональной активности мембран. [10] Биологические мембраны становятся более вязкими в результате перекисного окисления липидов, что приводит к угнетению работы мембранных ферментов [11].
Ткань хрусталика состоит из плотно упакованных волокон, являющихся производными эпителиальных клеток капсулы. Как и все клетки, волокна окружены клеточной мембраной, состоящей из липидного бислоя. [1] Волокна содержат большое количество белков, от которых зависит прозрачность и преломляющая способность хрусталика. Нормальное функционирование этой системы невозможно без «здоровой» мембраны.
По нашему мнению, нарушение липидного обмена, и как следствие повреждение мембран, является ведущим звеном в процессе изменения оптических и физических свойств хрусталика, хотя конкретные механизмы этих нарушений еще недостаточно изучены.
Цель исследования - выявить взаимосвязь изменений липидов и белков хрусталика в процессе старения и формирования катаракты
Материалы и методы исследования. Для
исследования отобраны 40 пациентов в возрасте от 60 до 90 лет, с катарактой различной степени зрелости. В группу исследования не включали пациентов с системными заболеваниям соединительной ткани, онкологической патологией, воспалением сосудистой оболочки глаза, травматическими катарактами и глаукомой. Всего исследовано 42 ядра хрусталика с катарактой различной степени. Ядра хрусталика получали методом экстракапсулярной экстракции катаракты по стандартной технологии. Определяли стадию зрелости катаракты по стандартной классификации, цветовые характеристики ядра хрусталика по Японской классификации катаракт. По этой классификации различают 4 цветовые градации катаракталь-ного хрусталика: I - бледно желтый (pale yellow), II - желтый (yellow), III - желто - ко-
ричневый (brownish - yellow), IV - коричневый, красно - коричневый, темно - коричневый (brown, reddish - brown, black - brown). Механические свойства оценивали по ультразвуковым характеристикам ядра по оригинальной методике. Лабораторные исследования ядер хрусталика in vitro проводились на базах Кировской государственной медицинской академии (кафедра биохимии), лаборатория института микробиологии Красной Армии, лаборатория физико-химических исследований НИИ ПФМ Ниж ГМА.
Производили измерение интенсивности хемилюминесценции, экстракции липидов методом Folch, ультрафиолетовой спектроскопии, первичных и вторичных продуктов перекисно-го окисления липидов (диеновые и триеновые конъюгаты (ДК и ТК), малоновый диальдегид (МДА)), определяли основания Шиффа (ОШ) флюорометрическим методом, определяли степень окислительной модификации белков, общий белок
Данные по окислительным процессам липидов пересчитывали на количество липидов в каждом образце, а данные по окислительной модификации белков (ОМБ) пересчитывали на количество общего белка в каждом образце. Исследовали состав высших жирных кислот в ядре хрусталика методом газожидкостной хроматографии на газожидкостном хроматографе фирмы «HEWLETT PACKARD» модель 5830 А (США) с пламенно-ионизационным детектором. Результаты статистически обработаны в программах SPSS 10.0, Microsoft Excel 2007.
Результаты и обсуждение. По нашему мнению знание о первичных пусковых механизмах, появлении помутнений в хрусталике или изменении его механических свойств позволит в будущем разработать эффективные меры профилактики и лечения возрастных патологических процессов в хрусталике. В своем исследовании мы попытались выявить взаимосвязь между белковым и липидным обменом в хрусталике и определить уровень первичного повреждения, приводящего к патологическим изменениям. Для этого сравнивали окислительные модификации липидов и белков в катарактальных хрусталиках и их взаимосвязь с возрастом пациента.
Концентрация первичных продуктов пере-кисного окисления - диеновых конъюгатов (ДК)
с возрастом постепенно снижается в 5 раз, так в 50 лет уровень ДК составляет 0,74 отн. ед./г/л, а к 80 годам он снижается до 0,15 отн. ед./г/л. Уровень вторичных продуктов (ТК, МДА) снижается в возрастном интервале от 50 до 70 лет на порядок. Уровень ТК снижается с 0,35 отн. ед./г/л до 0,058 отн. ед./г/л, а уровень МДА снижается с 0,06 отн.ед./г/л до 0,018 отн.ед./г/л. В группе 80 лет по сравнению с 70 годами уровень МДА незначительно возрастает до 0,026 отн.ед./г/л., уровень ТК до 0,067 отн.ед./г/л. (рис. 1, цветная вкладка)
Конечные продукты ПОЛ (ОШ) имеют тенденцию сходную с вторичными продуктами ПОЛ, так с 50 лет до 70 лет их уровень снижается с 10,8 отн. ед. /г/л до 1,08 отн. ед. /г/л, а в группе 80 лет уровень ОШ незначительно возрастает до 1,3 отн. ед. /г/л по сравнению с группой 70 лет.
При исследовании интегрального уровня свободнорадикальных процессов (ХЛ) наблюдалась сходная направленность окислительных процессов с 50 до 70 лет уровень, ХЛ снижается с 2,98 мВ/г/л до 0,7 мВ/г/л, в группе 80 лет и незначительно возрастает до 0,85 мВ/г/л по сравнению с группой 70 лет.
При оценке уровня окислительной модификации белков было выявлено, что на длинах волн 270, 363, 370, 430 нм с 50 до 70 лет наблюдается снижение уровня ОМБ в 5,1-3,4 раза, в группе 80 лет наблюдается увеличение в 1,6-2,3 раза относительно группы 70 лет. При длине волны 530 нм отмечается снижение уровня ОМБ от 50 лет до 80 лет с 0,02 отн. ед. /г/л до 0,012 отн. ед. /г/л. (рис. 2, цветная вкладка)
Таким образом, в процессе старения организма наблюдается постепенное снижение молекулярных продуктов перекисного окисления липидов с 50 до 80 лет. В группе 80 лет наблюдается незначительное возрастание окислительных процессов в липидах по сравнению с группой 70 лет, за исключением вторичных продуктов перекисного окисления - МДА.
С 50 до 80 лет уровень окислительной модификации белков в хрусталике у людей снижается. В группе 80 лет наблюдается незначительное возрастание окислительных процессов по сравнению с группой 70 лет, за исключением альдегид-динитрофенилгидразонов основного характера (530 нм), этот показатель в хрусталике людей 80 летнего возраста ниже показателей 70 летнего возраста.
Можно предположить, что окислительные процессы липидов и белков в хрусталике глаза человека, взаимосвязаны, с возрастом снижается потенциальная возможность субстратов, как липидов, так и белков хрусталика, к окислению.
При исследовании материала путем газожидкостной хроматографии определяли жирнокислотный состав ядра хрусталика.
Наибольший процент содержания в хрусталике имеют ПНЖК и пальмитиновая кислота, наименьший - лауриновая и линоленовая. Содержание насыщенных и полиненасыщен-ных жирных кислот примерно одинаково.
При развитии катаракты существенно изменяется состав высших жирных кислот. Как известно, ВЖК являются основой биологических мембран. Следовательно, повреждение их при перекисном окислении липидов приводит к нарушению функций мембран.
Достоверно изменяется процентное содержание:
- увеличивается содержание пальмитиновой кислоты (16:0), коэффициент корреляции
равен 0,52 (р < 0,05);
- уменьшается содержание линолевой кислоты (18:2), коэффициент корреляции равен -0,6 (р < 0,05);
Не изменяется достоверно содержание следующих ВЖК:
- линоленовой (18:3) - коэффициент корреляции равен -0,2 (р >0,05);
- олеиновой (18:1) - коэффициент корреляции равен 0,06 (р >0,05);
- лауриновой (12:0) - коэффициент корреляции равен -0,2 (р>0,05);
- пентадекановой (15:0) - коэффициент корреляции равен - 0,04 (р >0,05);
- ПНЖК - коэффициент корреляции равен - 0,18 (р >0,05);
- миристиновой - коэффициент корреляции равен -0,09 (р >0,05);
- стеариновой - коэффициент корреляции равен -0,35 (р >0,05).
Из выше приведенных данных можно сделать вывод, что с развитием катаракты увеличивается содержание пальмитиновой, и уменьшается содержание линолевой кислоты, содержание остальных выявленных ВЖК не меняется.
Пальмитиновая кислота является насыщенной, и увеличение ее содержания может приводить к повышению «жесткости» мембран.
Снижение содержания линоленовой кислоты -ненасыщенной - также увеличивает их «жесткость». Особое значение для мембранных процессов имеет коэффициент диффузии [12]. В «жестких» мембранах коэффициент диффузии снижен, подвижность реагентом уменьшена, происходит падение скорости биохимических процессов и нарушение функции мембран. Следствием такого процесса является повреждение внутренних структур клетки. В волокнах хрусталика происходит деградация белков хрусталика, нарушение коэффициента преломления и появление белковых агрегатов и помутнений.
Можно допустить, что все необратимые структурные изменения в биомембранах могут быть одной из основных причин старения [12]. Биологическая мембрана волокна хрусталика является барьером, который отделяет белки хрусталика от межклеточного вещества и поддерживает постоянство среды внутри клетки. Повреждение мембраны может быть связано с различными внешними и внутренними факторами, в том числе и старением, в результате нарушается управление биохимическими процессами, что приводит к патологическим изменениям клетки. Из рисунков 1 и 2 видно, что изменения липидов и белков в хрусталике с возрастом идут параллельно и взаимосвязано. Можно предположить, что первично происходит деградация мембран, повреждение липидов, а затем изменение белков волокон приводят к появлению помутнений.
Заключение
Участие липидов в процессе изменения оптических характеристик хрусталика, по нашему мнению, выглядит следующим образом: это влияние на все виды клеточного обмена через изменение свойств клеточных мембран. Мы допускаем, что все необратимые структурные изменения в биомембранах могут быть одной из основных причин старения организма, что приводит к изменению функциональных способностей органов и тканей.
Нормальное функционирование биологических мембран поддерживает постоянство биохимического состава внутри волокон, благодаря этому сохраняется структура белков, которые играют важнейшую роль в оптических (светопреломление, светопроведение) и механических свойствах (упругость, вязкость) хрустали-
ка. Поэтому резонно предположить, что именно мембраны хрусталиковых волокон являются основой для сохранения функций хрусталика.
Конечно, сами липиды не могут быть причиной увеличения или уменьшения меха-
нической твердости хрусталика, т. к. их содержание в его веществе относительно не велико: всего около 2-3%. Но опосредовано, через функционирование мембран волокон это вполне возможно.
Список использованной литературы:
1. Веселовская З.Ф. Катаракта. Киев: Книга плюс. - 2002. 208 с.
2. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и патология клетки. Москва: Медицина. - 1979. 47с.
3. Воробей В.А., Черницкий Е.А. Механизмы фотосенсибилизации повреждения белков и липидов биологических мембран // Исследование структуры, физических свойств и энергетики биологически активных молекул: Материалы II координационного семинара по интегральной теме научно - технического сотрудничества минвузов СССР и ЧССР. -1986. - С.54.
4. Деев А.И., Асейчев А.В., Владимиров Ю.А. Свободнорадикальные аспекты катарактогенеза //Вестник Российской академии медицинских наук. - 1999. - №2. - С. 22 - 26.
5. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты.М.: МАИК «Наука / Интерпериодика». - 2001, 343 с.
6. Костюк В.А.,Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Мн.: БГУ. - 2004, 174с.
7. Мальцев Э.В., Вит В.В., Черняева С.Н. и др. Неспецифические эффекты воздействия света на орган зрения //Офтальмологический журнал. -1999.- №2.- С. 88-93.
8. Треушников В.М. Катаракта и процессы старения клеток: возможные механизмы старения и замедления этих процессов// Визит к офтальмологу. - 2009. - №12. - с. 10-45
9. Храпова Н.Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических антиоксидантов // Сб. статей «Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии». - 1982. - с.59-72.
10. Borchman D, Lamba O.P, Yappert M.C. Structural characterization of lipid membranes from clear and cataractous human lenses // Exp Eye Res. - 1993 Aug. - V. 57. - №2. - P.199-208.
11. Cenedella R.J., Fleschner C.R. Selective assotiation of crystallins with lens «native» membrane during dynamic cataracto-genesis //Curr. Eye Res. - 1992. - №11. - P. 801-815.
12. Zigman S., Paxhia T., Marinetti G., Girsch S. Lipids of human lens fiber cell membranes // Curr. Eye Res. - 1984. - V. 3 -№7. - P. 887 - 896.
