CC BY
9
УДК 619:579+616.596
ОЦЕНКА УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ FUSOBA CTERIUM NECROPHORUM
ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СРЕДСТВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ^ДЛЯ ГРУППОВОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
БОЛЕЗНЕЙ ДИСТАЛЬНОГО ОТДЕЛА КОНЕЧНОСТЕЙ КОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ
ПЕРФИЛОВА КВ.,
кандидат ветеринарных наук, младший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: kse.perf@gmail.com, тел: 8-967-363-77-94.
КАШЕВАРОВ Г.С.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: kaschewarow@mail.ru, 8-927-435-71-83.
САЙТОВ В.Р.,
доктор биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: Sinsavara@yandex.ru, 8-962-553-27-77.
ХУЗИН ДА.,
доктор биологических наук, главный научный сотрудник отделения биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: hda55@mail.ru, 8-917-397-45-18.
ТАРАСОВА ЕЮ.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: evgenechka1885@gmail.com, 8-905-377-99-32.
ЮСУПОВ С.А.,
кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник отделения биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: yfnkec@mail.ru, 8-937-528-05-95.
ШАМИЛОВА ТА.,
кандидат биологических наук, начальник отдела контроля качества, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: tanya.shamilova@inbox.ru, 8-917-230-07-08.
Реферат. В статье представлены результаты изучения ультраструктурных изменений Fusobacterium necrophorum под воздействием разрабатываемого сотрудниками ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» комплексного препарата, обладающего адсорбционными, противовоспалительными и бактерицидными свойствами в отношении микроорганизмов, участвующих в возникновении болезней дистального отдела конечностей копытных животных, в сравнении с коммерческим дезинфицирующим средством «Любисан Эко», используемым для профилактики заболеваний копытец. По результатам исследований установлено, что опытный и коммерческий препараты эффективны в отношении F. necrophorum. Так, процент бактериальных клеток, подвергшихся деструкции, был значимо выше группы контроля в обеих опытных группах. Показано, что в группе с применением разрабатываемого препарата имеется тенденция к увеличению количества деструктурированных бактериальных клеток по сравнению с группой, в которой применяли коммерческий дезинфектант. Образцы F. necrophorum (нативные и после воздействия) были подготовлены для ультраструктурного анализа по методике ультратонких срезов. Срезы с эпоновых блоков выполнены с использованием микротома LKB-III, после чего смонтированы на блендах с полимерной подложкой и контрастированы солями тяжёлых металлов (уранилацетат, цитрат свинца). Сравнение выборок проводили с помощью непараметрического теста Манна - Уитни (в программе STATISTICA 6.0) исходя из уровня значимости а=0,05, с последующим введением поправки на множественные сравнения Бонферрони (уровень значимости после введения поправки: а«0,017).
Ключевые слова: Fusobacterium necrophorum, болезни пальцев и копытец, дезинфектанты, сухие ванны, периплазматическое пространство, клеточная стенка, морфометрия.
EVALUATION OF ULTRASTRUCTURAL CHANGES IN FUSOBACTERIUM NECROPHORUM UNDER THE INFLUENCE OF DRUGS USED FOR GROUP PREVENTION OF DISEASES OF THE DISTAL LIMB IN UNGATES
PERFILOVA K.V.,
Candidate of Veterinary Sciences, Junior Researcher, Department of Virological and Ultrastructural Studies, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: kse.perf@gmail.com, tel: 8-967-363-77 -94.
KASHEVAROV G. S.,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Department of Virological and Ultrastructural Research, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: kaschewarow@mail.ru, 8-927-435-71-83.
SAITOV V.R.,
Doctor of Biological Sciences, Senior Researcher, Department of Virological and Ultrastructural Research, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: Sinsavara@yandex.ru, 8-962-553-27-77.
KHUZIN D.A.,
Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher of the Department of Biotechnology, Federal Center for Toxi-cological, Radiation and Biological Safety, e-mail: hda55@mail.ru, 8-917-397-45-18.
TARASOVA E.Yu.,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Department of Biotechnology, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: evgenechka1885@gmail.com, 8-905-377-99-32.
YUSUPOV S.A.,
Candidate of Veterinary Sciences, Researcher at the Department of Biotechnology, Federal Center for Toxico-logical, Radiation and Biological Safety, e-mail: yfnkec@mail.ru, 8-937-528-05-95.
SHAMILOVA T.A.,
Candidate of Biological Sciences, Head of the Quality Control Department, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: tanya.shamilova@inbox.ru, 8-917-230-07-08.
Essay. The article presents the results of a study of ultrastructural changes in Fusobacterium necrophorum under the influence of a complex preparation developed by the employees of the FSBSI «FCTRBS-ARRVI» that has adsorption, anti-inflammatory and bactericidal properties against microorganisms involved in the occurrence of diseases of the distal limbs of ungulates, in comparison with a commercial disinfectant «Lubisan Eco», used for the prevention of hoof diseases. According to the results of the research, it was found that experimental and commercial preparations are effective against F. necrophorum. Thus, the percentage of bacterial cells that underwent destruction was significantly higher than the control group in both experimental groups. It was shown that in the group using the developed drug there is a tendency to increase the number of destructured bacterial cells compared to the group in which a commercial disinfectant was used. F. necrophorum samples (native and exposed) were prepared for ultrastructural analysis using the ultrathin section technique. Sections from epon blocks were made using an LKB-III microtome, after which they were mounted on blends with a polymer substrate and contrasted with heavy metal salts (uranyl acetate, lead citrate). Samples were compared using the nonparametric Mann-Whitney test (in the STATISTICA 6.0 program) based on the significance level a=0.05, followed by a correction for Bonferroni multiple comparisons (significance level after the introduction of the correction: a«0.017).
Keywords: Fusobacterium necrophorum, diseases of fingers and hooves, disinfectants, dry baths, periplasmic space, cell wall, morphometry.
Введение. Заразные и незаразные болезни, проявляющиеся поражениями пальцев и копытец копытных животных, ведущих стадный образ жизни (крупный и мелкий рогатый скот, северные
олени, свиньи и др.), причиняют значительный экономический ущерб животноводству РФ [1-4]. Причиной их массового распространения является неудовлетворительная организация профилактики
и отсутствии своевременного лечения животных, приводящих к развитию хирургических и заразных (некробактериоз, болезнь Мортелларо и др.) инфекций пальцев и копытец с тяжелыми осложнениями в виде поражений средней и тяжелой степени тяжести, требующих больших затрат времени, связанных с проведением трудоемких манипуляций по «жесткой» фиксации животных, тщательной расчистке, обрезке и хирургического удаления некротизированных тканей с продолжительным курсом лечения и применением дорогостоящих лекарственных препаратов [5-7], во время которого бракуется молоко, снижается живая масса продуктивных животных, нарушается оборот и теряется генофонд стада.
Fusobacterium necrophorum - является основным возбудителем некробактериоза, наиболее часто встречающегося инфекционного заболевания копытных животных, характеризующегося хромотой «опирающейся» конечности. Этот анаэробный микроорганизм также встречается в патологическом материале при болезни Мортелларо и других хирургических микст-инфекциях дистального отдела конечностей.
Одним из эффективных методов недопущения широкого распространения болезней пальцев и копытец является применение групповой профилактики с использованием ножных ванн [8-11], которые широко и успешно применяются во многих сельхозпредприятиях. Перспективным направлением повышения эффективности групповой неспецифической профилактики болезней пальцев и копытец является использование сухих ножных ванн. Для дезинфекции напольных покрытий с большой эффективностью применяют коммерческий сухой дезинфектант Любисан Эко.
При разработке и исследовании новых средств дезинфекции особого внимания заслуживают процессы, происходящие с микроорганизмами, в т.ч. и F. necrophorum, на ультраструктурном уровне, который возможно наблюдать с помощью просвечивающей электронной микроскопии, и учитывать эти изменения в процессе создания и совершенствования средств профилактики и лечения.
В связи с этим, целью работы явилось сравнительное изучение ультраструктурных изменений F. necrophorum под воздействием разрабатываемого в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» нового комплексного средства, обладающего адсорбционными, бактерицидными и противовоспалительными свойствами и сухого коммерческого дезинфектан-та Любисан Эко, применяемого для групповой профилактики болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота.
Условие, материал и методы. Работа проведена на базе ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
В качестве объекта ультраструктурных исследований использовали суточную культуру F.
necrophorum 8TS633051, выращенную в среде Китта - Тароцци с добавлением 0,5% глюкозы и 10% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота (1 группа - контроль), с дальнейшей обработкой материала новым комплексным средством (группа 2) и дезинфицирующим средством Любисан Эко (группа 3) в течение 45 минут.
Основой при приготовлении концентрированной бактериальной суспензии культуры F. necrophorum (30 млрд м.к./мл) служил физиологический раствор. Далее проводили осаждение суспензии путем центрифугирования в течение 15 минут при 5000 об/мин с последующим трехкратным промыванием и фиксацией по классической методике подготовки материала в микропробирках с 1% раствором глутарового альдегида. В качестве следующих этапов исследования проводили постфиксацию, дегидратацию и заключение образцов в смесь эпоновых смол со стадией полимеризации. По завершении процесса полимеризации, образцы для дальнейшего исследования готовили по методике ультратонких срезов [12].
Для каждой группы обрабатывали по 35 полей зрения электронного микроскопа: подсчитывали визуально целостные и разрушенные бактериальные клетки. Далее подсчитанное число визуально целостных бактерий делили на общее количество наблюдаемых на срезе бактерий, включая деструк-турированные клетки. Сравнение выборок проводили с помощью непараметрического теста Манна - Уитни (в программе STATlSTICA 6.0) исходя из уровня значимости а=0,05, с последующим введением поправки на множественные сравнения Бон-феррони (уровень значимости после введения поправки: а«0,017).
Результаты исследования. При проведении ультраструктурных исследований F. necrophorum было установлено, что оба применявшихся в данной работе средства оказывают на них бактерицидный эффект, который визуально характеризуется увеличением доли бактерий с изменениями клеточной стенки, в том числе погибших клеток, в сравнении с группой контроля.
На электронограммах отмечается наличие клеток F. necrophorum палочковидной и сферопласто-вой формы (рисунок 1 а-в).
В культуре бактериальных клеток группы контроля (рисунок 1 а) большинство из F. necrophorum характеризуются электронно-плотной цитоплазмой, содержащей осмиофильные включения различного типа. У них извилистая клеточная стенка, агрегат рибонуклеопротеидов и пери-плазматическое пространство с содержимым средней электронной плотности, нуклеоид просматривается не во всех случаях. На снимках можно видеть палочковидные бактерии в процессе деления (рисунок 1 а). Видоизмененные бактериальные клетки встречаются редко.
а - группа интактных бактерий; б - бактерии под воздействием нового комплексного средства;
в - бактерии под воздействием Любисан Эко. Рисунок 1 - Бактерии Е. пеегоркогит нативные и после обработки изучаемыми средствами (экспозиция 45 минут)
W
0,8
0,4
0,0
Гр. 1 Гр. 2 Гр. 3
W - доля визуально целостных бактерий; Гр. 1 - контроль; Гр. 2 - новое комплексное средство;
Гр. 3 - Любисан эко; * - наличие значимых отличий от группы контроля. Рисунок 2 - Доля визуально целостных бактерий в группах опыта
На электронограммах ультратонких срезов Е. пеегоркогит исследуемых групп после воздействия испытуемых средств присутствует незначительное количество визуально целостных клеток Е. пеегоркогит. Большая часть клеток находится на стадии деструкции, что прежде всего выражено электронно-светлой цитоплазмой. В отдельных случаях в цитоплазме просматриваются: нуклеоид, фрагментированные фибриллярные структуры ДНК, неравномерное распределение содержимого цитоплазмы и увеличение периплазматического пространства, нарушение целостности цитоплаз-матической мембраны, отсутствие рибосом, выравнивание клеточной стенки, что не характерно для грамотрицательных бактерий (рисунок 1 б, в). Микроповреждение, вздутие, разрыв - являются характерными последствиями воздействия различных дезинфицирующих средств [5].
Статистическая проверка гипотезы о сходстве исследуемых групп, в том числе с использованием поправки на множественные сравнения, показала,
что обе опытные группы статистически значимо отличались от контрольной группы. Также было выявлено статистически значимое (р«0,035) снижение количества визуально целых бактерий в группе с применением комплексного препарата по сравнению с группой, где применяли Любисан Эко (рисунок 2); однако при введении поправки Бонферрони данный эффект не подтверждается.
Заключение. Таким образом, испытанные средства проявили антибактериальный эффект в отношении Е. пеегоркогит. При этом процент бактериальных клеток, подвергшихся деструкции, в обеих опытных группах значимо выше, чем в группе контроля. В группе с применением разрабатываемого в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» комплексного средства для групповой профилактики и лечения болезней пальцев и копытец КРС методом сухих ножных ванн была выявлена тенденция к увеличению количества деструктурированных бактерий по сравнению с группой, где применяли дезинфицирующее средство Любисан Эко.
Список использованных источников
1. Баскова Е.Ю. Применение энтеросорбентов на основе нанотехнологий для борьбы с микотоксико-зами животных // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2008. - Т. 192. - С. 234.
2. Роль сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов в возникновении и распространении оппортунистических инфекций крупного рогатого скота / Д.А. Хузин, С.А. Юсупов, А.И. Ерошин и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. - 2022.
- Т. 252. - № 4. - С. 267-272.
3. Применение сорбентов при выращивании молодняка свиней / А. М. Тремасова, Л.Г. Бурдов, С.О. Белецкий, М.Ю. Митрохин // Ветеринарный врач. - 2012. - № 6. - С. 27-29.
4. Тремасова А. М. , Белецкий С. О. О применении шунгита в животноводстве // Достижения науки и техники АПК. - 2012. - № 3. - С. 72-74.
5. Хузин Д. А. Разработка средств профилактики, диагностики и лечения некробактериоза и болезней копытец крупного рогатого скота: специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»: дис. ... д-ра биол. наук. - Казань, 2015. - 350 с.
6. Анализ рынка дезинфицирующих средств, используемых в отдельных животноводческих хозяйствах Приволжского федерального округа / Е. Ю. Тарасова, А. М. Тремасова, Д. А. Хузин и др. // Ветеринарный врач. - 2022. - № 3. - С. 58-66.
7. Хузин Д.А., Макаев Х.Н., Никитин А.И. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике некробактериоза, пальцевого дерматита и болезней копытец крупного рогатого скота незаразной этиологии. - М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2017. - 44 с.
8. Endophytic bacteria antagonists of the micromycete Aspergillus flavus: The prospect of improving the quality of food raw materials and food products / I. I. Idiyatov, A. I. Eroshin, S. A. Yusupov [et al.] // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, Yekaterinburg, 15-16 октября 2021 года. - Yekaterinburg, 2022. - P. 012072.
9. Endophytic isolates of Bacillus subtilis: prospects of application for improving the quality of food raw materials / I. I. Idiyatov, A. I. Eroshin, S. A. Yusupov [et al.] // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science : Volga Region Farmland 2021 (VRF 2021), Penza, 16-18 ноября 2021 года. - Penza: IOP Publishing Ltd, 2022. - P. 012024.
10. Антисептическое средство для обработки копытец / А.В. Иванов, Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев и др. // Ветеринария. - 2012. - № 4. - С. 12-15.
11. Сидорчук А.А., Белкина Ю.В., Пчельников А.В. Эффективность препаратов для ножных ванн при поражениях копытец крупного рогатого скота // В кн.: Актуальные проблемы ветеринарной медицины, биотехнологии и морфологии: материалы Национальной научно-практической конференции. - Кинель: Самарский ГАУ, 2021. - С. 168-172.
12. Особенности ультраструктурной организации бактерий Brucella melitensis при воздействии гамма-лучей: морфометрический аспект / М.А. Косарев, М. М. Сальникова, Г. С. Кашеваров и др. // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2022. - № 9. - С. 76-83.
Spisok ispolzovannyx istochnikov
1. Baskova E.Yu. Primenenie e'nterosorbentov na osnove nanotexnologij dlya bor'by' s mikotoksikozami zhivotny'x // Ucheny'e zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj mediciny' im. N.E'. Baumana.
- 2008. - T. 192. - S. 234.
2. Rol' saprofitny'x i uslovno-patogenny'x mikroorganizmov v vozniknovenii i rasprostranenii opportunisticheskix infekcij krupnogo rogatogo skota / D.A. Xuzin, S.A. Yusupov, A.I. Eroshin i dr. // Ucheny'e zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj mediciny' im. N. E'. Baumana. - 2022. - T. 252. - № 4. - S. 267-272.
3. Primenenie sorbentov pri vy'rashhivanii molodnyaka svinej / A. M. Tremasova, L.G. Burdov, S.O. Beleczkij, M.Yu. Mitroxin // Veterinarny'j vrach. - 2012. - № 6. - S. 27-29.
4. Tremasova A. M. , Beleczkij S. O. O primenenii shungita v zhivotnovodstve // Dostizheniya nauki i texniki APK. - 2012. - № 3. - S. 72-74.
5. Xuzin D. A. Razrabotka sredstv profilaktiki, diagnostiki i lecheniya nekrobakterioza i boleznej kopy'tecz krupnogo rogatogo skota: specialist' 06.02.02 «Veterinarnaya mikrobiologiya, virusologiya, e'pizootologiya, mikologiya s mikotoksikologiej i immunologiya»: dis. ... d-ra biol. nauk. - Kazan', 2015. - 350 s.
6. Analiz ry'nka dezinficiruyushhix sredstv, ispol'zuemy'x v otdel'ny'x zhivotnovodcheskix xozyajstvax Privolzhskogo federal'nogo okruga / E. Yu. Tarasova, A. M. Tremasova, D. A. Xuzin i dr. // Veterinarny'j vrach.
- 2022. - № 3. - S. 58-66.
7. Xuzin D.A., Makaev X.N., Nikitin A.I. Metodicheskie rekomendacii po diagnostike, lecheniyu i profilaktike nekrobakterioza, pal'cevogo dermatita i boleznej kopy'tecz krupnogo rogatogo skota nezaraznoj e'tiologii. - M.: FGBNU «Rosinformagrotex», 2017. - 44 s.
8. Endophytic bacteria antagonists of the micromycete Aspergillus flavus: The prospect of improving the quality of food raw materials and food products / I. I. Idiyatov, A. I. Eroshin, S. A. Yusupov [et al.] // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, Yekaterinburg, 15-16 oktyabrya 2021 goda. - Yekaterinburg, 2022.- P. 012072.
9. Endophytic isolates of Bacillus subtilis: prospects of application for improving the quality of food raw materials / I. I. Idiyatov, A. I. Eroshin, S. A. Yusupov [et al.] // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science : Volga Region Farmland 2021 (VRF 2021), Penza, 16-18 noyabrya 2021 goda. - Penza: IOP Publishing Ltd, 2022. - P. 012024.
10. Antisepticheskoe sredstvo dlya obrabotki kopy'tecz / A.V. Ivanov, D.A. Xuzin, X.N. Makaev i dr. // Veterinariya. - 2012. - № 4. - S. 12-15.
11. Sidorchuk A.A., Belkina Yu.V., Pchel'nikov A.V. E'ffektivnost' preparatov dlya nozhny'x vann pri porazheniyax kopy'tecz krupnogo rogatogo skota // V kn.: Aktual'ny'e problemy' veterinarnoj mediciny', biotexnologii i morfologii: materialy' Nacional'noj nauchno-prakticheskoj konferencii. - Kinel': Samarskij GAU, 2021.- S. 168-172.
12. Osobennosti ul'trastrukturnoj organizacii bakterij Brucella melitensis pri vozdejstvii gamma-luchej: morfometricheskij aspekt / M.A. Kosarev, M. M. Sal'nikova, G. S. Kashevarov i dr. // Vestnik Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2022. - № 9. - S. 76-83.
