CC BY
19Оригинальные исследования
Оценка степени экспрессии а-эстрогеновых рецепторов и пролиферативной активности эндометрия при различных схемах заместительной гормональной терапии в криопротоколах у пациенток с многократными неудачными имплантациями
А.Н. Сулима 1, А.Н. Рыбалка 1, В.В. Вороная 1, А.А. Давыдова 2, Д.А. Беглицэ 1
Evaluation of а-estrogenic receptors' expression degree and proliferative endometrial activity in different schemes of hormonal replacement therapy in cryoprotocols at patients with multiple implantation failure
A.N. Sulima, A.N. Rybalka, V.V. Voronaya, A.A. Davydova, D.A. Beglitse
1Кафедра акушерства, гинекологии и перинатологии ФПМКВК и ДПО,
2Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», г. Симферополь
Ключевые слова: криопротокол, многократные неудачи имплантации, рецептивность эндометрия, заместительная гормональная терапия, эстрадиол, иммуногистохимия
Резюме
Оценка степени экспрессии а-эстрогеновых рецепторов и пролиферативной активности эндометрия при различных схемах заместительной гормональной терапии в криопротоколах у пациенток с многократными неудачными имплантациями
А.Н. Сулима, А.Н. Рыбалка, В.В. Вороная, А.А. Давыдова, Д.А. Беглицэ
Введение. Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях подготовки эндометрия на заместительной гормональной терапии (ЗГТ) в криопротоколах вспомогательных репродуктивных
Сулима Анна Николаевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФПМКВК и ДПО Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», 295017, г. Симферополь,ул. Воровского, 8, e-mail: gsulima@yandex.ru
Рыбалка Анатолий Николаевич - академик КАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства, гинекологии и перинатологии ФПМКВК и ДПО Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», 295017, г. Симферополь,ул. Воровского, 8, e-mail: raa1939@yandex.ru.
Вороная Виктория Вячеславовна, старший лаборант кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФПМКВК и ДПО Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», 295051, г. Симферополь, бульвар Ленина 5/7; viktoria.voronaya@yandex.ru.
Давыдова Александра Александровна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии с секционным курсом Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», г. Симферополь, ул. Гагарина, 15, e-mail: akzag@mail.ru.
Беглицэ Дмитрий Анатольевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФПМКВК и ДПО Медицинской академии имени С. И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», г. Симферополь,ул. Воровского, 8, e-mail: 9999@gmail.com.
технологий (ВРТ), является отражением сложных и многофакторных процессов. Гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов, однако нарушения в рецеп-торном аппарате эндометрия, на фоне тех или иных приобретенных патологических состояний, могут привести к недостаточной его восприимчивости к экзогенному гормональному воздействию.
Цель исследования. Сравнить степени экспрессии а-эстрогеновых рецепторов (ЭР) и пролифера-тивной активности эндометрия (Ki67) при различных его схемах подготовки на ЗГТ в криопрото-колах.
Материал и методы. Были отобраны 100 пациенток с многократными неудачными имплантациями (МНИ) размороженного эмбриона (2 и более) в анамнезе, которые были разделены на 2 группы в зависимости от выбора ЗГТ при подготовке эндометрия к переносу размороженной бластоцисты. Для оценки степени экспрессии а-ЭР и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki67) при различных схемах его подготовки на ЗГТ всем пациенткам проводилась пайпель-биопсия с 9 по 11 день ЗГТ с последующим иммуногистохимическим (ИГХ) исследованием материалов. Результаты. При ИГХ исследовании а-ЭР у пациенток 2-й группы отмечалась более выраженная экспрессия (207 ± 0,2), по сравнению с результатами, полученными для пациенток 1-й группы (123 ± 0,4) (t=63,10, р<0,001). Процент пролиферативно активных клеток в пайпель-биоптатах 1-й группы достоверно ниже как в железах (22,8 ± 1,4%), так и в строме (7,7 ± 0,5%), по сравнению со 2-й группой, у которых он составлял соответственно 37,2 ± 0,8% и 21,1 ± 0,6% (t=26,70, р<0,001; t=25,50, р<0,001).
Выводы. Выраженное влияние препарата 17 в-эстрадиола на степень экспрессии а-ЭР и пролифе-ративную активность клеток стромы и желез в эндометрии, по сравнению с препаратом эстрадио-ла валерата (р<0,001), позволяет рекомендовать его к использованию в рамках ЗГТ с целью повышения результативности программ переноса размороженного эмбриона у пациенток с МНИ. Ключевые слова: криопротокол, многократные неудачи имплантации, рецептивность эндометрия, заместительная гормональная терапия, эстрадиол, иммуногистохимия.
Abstract
Evaluation of а-estrogenic receptors' expression degree and proliferative endometrial activity in different schemes of hormonal replacement therapy in cryo-protocols at patients with multiple implantation failure
A.N. Sulima, A.N. Rybalka, VV Voronaya, A.A. Davydova, D.A. Beglitse
Introduction. The state of the endometrial receptor apparatus is a reflection of complex and multifactorial processes under the conditions of endometrial preparation for hormone replacement therapy (HRT) in cryoprotocols. On the one hand, hormonal drugs have a significant effect on the receptor system; on the other hand, disturbances in the endometrium receptor apparatus may lead to an insufficient susceptibility to exogenous hormonal effects, in case of some acquired pathological conditions. The purpose of the study. To compare the а-estrogen receptors (ER) expression degree and the proliferative activity of the endometrium (Ki67) with various schemes of its preparation for HRT in cryoprotocols.
Materials and methods. 100 patients with multiple implantation failure (MIF) of the frozen-thawed embryo (2 or more) in the history were selected and divided into 2 groups, depending on the choice of HRT in the endometrium preparing for the transfer of frozen-thawed blastocysts. To assess of а-ER expression degree and the marker of proliferative activity of the endometrium (Ki67) under various schemes of its preparation for HRT, all patients underwent a biopsy fromrn9 to 11 days of HRT followed by immunohistochemical (IHC) study of the materials.
Results. In IHC, the а-ER test in patients of the 2nd group showed more pronounced expression (207 ± 0.2), compared with the results for patients of group 1 (123 ± 0.4). The percentage of proliferative active cells in group 1 is significantly lower both in the glands 22.8 ± 1.4% and in the stroma 7.7 ± 0.5% than in the biopsy specimens of the patients of group 2, in which he was 37.2 ± 0.8% and 21.1 ± 0.6%. Conclusions. The pronounced effect of 17p-estradiol on the а-ER expression degree and the proliferative activity of stromal and glandular cells in the endometrium, compared with the preparation of estradiol valerate (p<0.001), allows it to be recommended for use in HRT in order to increase the effectiveness of programs for transferring frozen-thawed embryos in patients with MIF.
Key words: cryoprotocol, multiple implantation failure, endometrial receptivity, hormone replacement therapy, estradiol, immunohistochemistry
-Крымский терапе
Введение
Число пациенток с МНИ в протоколах переноса размороженного эмбриона, по разным данным, составляет 40-45% [1]. Большинство женщин данной группы отличает общность нарушений нейроэндо-кринной регуляции репродуктивной функции [2, 3], а также морфофункциональная неполноценность эндометрия [4], требующие коррекции и искусственного моделирования циклических изменений в эндометрии при подготовке к переносу размороженного эмбриона путем назначения ЗГТ [5]. В настоящее время в качестве эстрогенного компонента ЗГТ используется ряд препаратов эстрадиола [6], различных по своей биоидентичности натуральному эстрогену и метаболизму.
Ключевым фактором, определяющим результативность программ ВРТ в криопереносах селективно выбранной бластоцисты, является адекватная подготовка эндометрия [1, 2, 7, 8]. По данным литературы, контрольные гистероскопии с последующим выскабливанием полости матки и гистологическим исследованием показывают изменения в эндометрии в 24-62,0% случаях у пациенток, проходящих лечение методами ВРТ [9].
Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях подготовки эндометрия на ЗГТ в крио-протоколах ВРТ является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов. В то же время, с другой стороны, нарушения в рецепторном аппарате эндометрия, возникающие на фоне тех или иных приобретенных патологических состояний, могут привести к недостаточной его восприимчивости к экзогенному гормональному воздействию [10, 11]. Сведения о влиянии различных по химической структуре эстрогенов на экспрессию рецепторов эндометрия к эстрогену при различных его схемах подготовки на ЗГТ в криопротоколах противоречивы и фрагментарны.
Все вышеперечисленное указывает на актуальность проблемы повышения эффективности крио-программ ВРТ, особенно у женщин с МНИ в анамнезе, и перспективность исследований в этой области.
Материал и методы исследования
Для сравнения степени экспрессии рецепторов эндометрия к эстрогенам и пролиферативной активности эндометрия (Ю67) при различных его схемах подготовки на ЗГТ в криопротоколах нами были отобраны 100 пациенток с МНИ размороженного эмбриона (2 и более) в анамнезе. Критериями включения являлись:
• возраст от 24 до 45 лет;
• длительность бесплодия от 3 до 16 лет;
• отсутствие генетической патологии у женщины и партнера;
• подготовка эндометрия к переносу РЭ с использованием ЗГТ;
• перенос одного размороженного эмбриона на стадии бластоцисты, хорошего и отличного качества (3-5 ВВ, ВА, АВ, АА) согласно классификации Gardner D. K., Schoolcraft W. B. (1999).
В зависимости от выбора ЗГТ при подготовке эндометрия к переносу размороженной бластоцисты включенные в исследование женщины были разделены на 2, равные по численности, группы: в 1-ю группу вошли 50 пациенток, которые в рамках подготовки эндометрия к криопереносу получали перо-ральную форму эстрадиола валерата в дозе 4 мг со 2-го дня менструального цикла (МЦ); во 2-ю группу вошли 50 пациенток, которые в рамках подготовки эндометрия к криопереносу получали пероральную форму 17ß-эстрадиола в дозе 4 мг со 2-го дня МЦ.
Для оценки степени экспрессии а-ЭР и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki67) при различных схемах его подготовки на ЗГТ всем пациенткам в обеих группах проводилась пайпель-биопсия в раннюю пролиферативную фазу цикла (с 9 по 11 день ЗГТ) с последующим иммуногистохи-мическим исследованием материалов.
ИГХ исследование проводилось по стандартной методике с использованием парафиновых блоков, реактивов компании DAKO и мышиных монокло-нальных антител к ЭР (клон 1D5 «DAKO», Дания, RTV), а также антител Ki-67 (клон MIB-1).
Для анализа результатов ИГХ реакций использовался количественный метод с подсчетом гистохимического индекса Histochemical score (H-score) [11] по формуле: ^=1а+2Ь+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с
- % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень экспрессии эстрогенов оценивалась по результату H-score: 0-10 - отрицательная, 11 - 100 - низкая, 101
- 200 - умеренная, 201 и более - высокая.
Морфометрическое исследование включало измерение процента Ki-67 позитивных клеток при увеличении микроскопа 400 в железах и строме с помощью программы Software DP-SOFT и последующей статистической обработкой.
Фотографирование осуществляли цифровой камерой OLYMPUS C 5050Z, установленной на микроскопе OLYMPUS CX41.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программ IBM SPSS 19.0 и Matlab 7. Для сравнения качественных дихотомических данных использовался критерий «Угловое преобразование Фишера» с поправкой Йейтса (Yates) [12].
Результаты исследования
При ИГХ исследовании а-ЭР у пациенток 1-й группы, которым подготовка эндометрия осуществлялась пероральной формой эстрадиола валерата, отмечалась умеренно выраженная степень экспрессии, которая составляла 123,6 ± 0,69 балла (Рис. 1).
Рис. 1. Умеренно выраженная экспрессия а-ЭР в биоптате эндометрия у пациентки 1 группы. ИГХ. Увеличение 100х.
Рис. 2. Выраженная экспрессия а-ЭР в биоптате эндометрия у пациентки 2 группы. ИГХ. Увеличение 100х.
Рис. 3. Слабо выраженная экспрессия К'1-67 в железах и единые позитивно окрашенные клетки стромы в биоптате эндометрия у пациентки 1 группы. ИГХ. Увеличение 400х.
Рис. 4. Умеренно выраженная экспрессия К'1-67 в эпителии желез и строме биоптата эндометрия у пациентки 2 группы. ИГХ. Увеличение 400х.
У пациенток 2-й группы, получавших в рамках ЗГТ пероральную форму 17р-эстрадиола, при ИГХ исследовании отмечалась выраженная экспрессия а-ЭР, составлявшая 207,2 ± 1,13 балла (Рис. 2).
При ИГХ исследование биоптатов эндометрия с маркером пролиферативной активности клеток Ю-67 у пациенток 1-й группы процент позитивно окрашенных клеток составлял 22,8 ± 0,35 в железах (слабовыраженная экспрессия Ю-67) и 7,7 ± 0,18 в строме (Рис. 3).
Исследование материалов, полученных от пациенток 2-й группы, выявило больший процент про-лиферативно активных клеток, как в железах, так и в строме, который составлял, соответственно, 37,2 ± 0,41 и 21,1 ± 0,49 (Рис. 4)
Полученные нами данные демонстрируют, что использование препарата 17р-эстрадиола в рамках ЗГТ при подготовке эндометрия к переносу размороженного эмбриона у пациенток 2-й группы, сопровождалось более выраженной, по сравнению с группой 1, экспрессией а-ЭР ^=63,10, р<0,001) и статистически достоверным повышением пролифера-
тивной активности клеток желез ^=26,70, р<0,001) и стромы эндометрия ^=25,50, р<0,001).
Высокий уровень экспрессии а-ЭР в эндометрии и пролиферативной активности клеток свидетельствует о выраженном имплантационном потенциале эндометрия, что позволяет прогнозировать повышение частоты наступления беременности в протоколах переноса размороженного эмбриона у пациенток с МНИ в криопротоколах в анамнезе.
Более выраженное влияние препарата 17р-эстрадиола на эндометрий, по сравнению с препаратом эстрадиола валерата, связан, вероятно, с особенностями его химического строения, биоидентичного натуральному эстрогену, вырабатываемому в организме женщины, а также его фармакоки-нетики и фармакодинамики.
Выводы
Более выраженное влияние препарата 17р-эстрадиола на степень экспрессии а-ЭР и про-лиферативную активность клеток стромы и желез
в эндометрии, по сравнению с препаратом эстради-ола валерата (р <0,001), позволяет рекомендовать его к использованию в рамках ЗГТ с целью повышения результативности программ переноса размороженного эмбриона у пациенток с МНИ.
Литература
1. Аполихин О. И., Москалева Н. Г., Комарова В. А. Современная демографическая ситуация и проблемы улучшения репродуктивного здоровья населения России. Экспериментальная и клиническая урология. 2015;
2. Е. Н. Носенко, А. И. Саенко, И. Г. Постолюк. Рецепторный статус эндометрия у бесплодных женщин с неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий в анамнезе. Таврический медико-биологический вестник. 2013;16 (2;2): 80-82
3. Simon A., Laufer N. Assessment and treatment of repeated implantation failure (RIF). J Assist Reprod Genet. 2012 Nov; 29(11): 1227-1239. doi: 10.1007/s10815-012-9861-4
4. Гайдуков С. Н., Ъоярский Ю. К., Пальченко Н. А. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ (обзор литературы). Проблемырепродукциию 2013; 4:51-60.
5. Ruiz-Alonso M1, Blesa D, Díaz-Gimeno P, Gómez E, Fernández-Sánchez M, Carranza F, Carrera J, Vilella F, Pellicer A, Simón C. The endometrial receptivity array for diagnosis andpersonalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure. Fertil Steril. 2013; 100 (3): 818824.
6. Применение эстрогенов в программах ВРТ: научно-практические рекомендации. Российская Ассоциация Репродукции Человека. М., 2015. - 13 с.
7. Вартанян Э. В. Преодоление повторных неудач ВРТ. Дис.... док. мед. наук. Москва; 2012. Доступно по: http://www.dissercat.com/content/ preodolenie-povtornykh-neudach-vrt. Ссылка активна на 15.05.2018.
8. Сухих Г. Т., Назаренко Т. А. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2010. - 784 с.
9. Acosta A. A., Elberger L., Borghi M, Calamera J. C., Chemes H., Doncel G. F., Kliman H., Lema B., Lustig L, Papier S. Endometrial dating and determination of the window of implantation m healthy fertile women. Fertil Steril 2000, 73(4): 788-798.
10. Crum C. P., Hornstein M. D., Steward E. A. Evolution of cyclic endometrium and, benign endometrial disorders. In Crum C. P., Lee K. P (eds) Diagnostic Gynecologic and Obstetric Pathology. Philadelphia: Saunders, 2006. P. 441-488.
11. Gardner, D.K. A randomized trial of blastocyst culture and transfer in invitro fertilization: reply / D.K. Gardner, W.B. Schoolcraft // Human Reproduction.- 1999. - Vol. 14, № 6. - P. 1663-1663.
12. Statistics with confidence. Confidence intervals and statistical guidelines. / Edited by Altman D.G., Machin D., Bryant T.N., Gardner M.J. Bristol. -BMJ Books. Second edition. 2003. - 240p.
