CC BY
325
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОМЕТРИЯ В ПРОГРАММАХ ВРТ
Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Л.Н. Кузьмичев, Е.А. Коган
Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» ул. Опарина, 4, Москва, Россия, 117997
Проведена оценка влияния морфологической структуры и рецепторного статуса эндометрия в окно имплантации на результативность ЭКО у пациенток с трубным бесплодием. Дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов эндометрия и секреторной трансформации эндометрия на фоне нормальных уровней стероидных гормонов может свидетельствовать о повреждении рецепторного аппарата на тканевом уровне. Применение в качестве подготовки гормональных препаратов с учетом морфологического развития и рецепторного статуса эндометрия возможно позволит повысить результативность программы ЭКО и ПЭ.
Проблема бесплодного брака на сегодняшний день является крайне актуальной и нерешенной. Согласно результатам эпидемиологических исследований, частота бесплодия в браке колеблется от 8 до 29%. В Европе бесплодны около 10% супружеских пар, в США — 8—15%, в Канаде — около 17%, в Австралии — 15,4%. Доля бесплодных браков в России колеблется от 8 до 17,5% и в настоящее время не имеет тенденции к снижению [5].
Последние годы ознаменовались широким внедрением в клиническую практику методики экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В России около 2 млн женщин нуждается в лечении данным методом, в мире ежегодно выполняется более 250 тыс., в России около 6 тыс. лечебных циклов ЭКО. Несмотря на развитие методик вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), частота имплантации после стимуляции суперовуляции и ЭКО все еще остается низкой [13]. По данным XI отчета Национального регистра центров ВРТ Российской ассоциации репродукции человека, частота наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ составляет в расчете на цикл 31,5% [4].
Пациенты с многократными неудачными программами ВРТ составляют около 30% от всех пациентов, которые лечатся с использованием этих методов [1]. В иностранной литературе отсутствие беременности после 2—6 циклов ЭКО, в которых было перенесено суммарно более 10 эмбрионов высокого качества, определяется различными клиницистами, как повторные неудачи имплантации [17, 19]. Допольнительное обследование пациенток рекомендовано начинать после трех неудачных циклов, в которых переносились хорошие эмбрионы [20]. Неадекватная рецептивность эндометрия может обусловливать приблизительно две трети неудач имплантации, тогда как эмбрион — только одну треть [11, 12].
Решающее значение для успеха программы ЭКО имеет полноценность эндометрия в момент так называемого «окна имплантации» — непродолжительного
периода, во время которого происходят анатомические и молекулярные изменения, необходимые для нидации эмбриона [6]. В настоящее время определены многочисленные клеточные и молекулярные маркеры рецептивности эндометрия, многие из которых регулируются стероидными гормонами [21, 28]. Доминирующими гормональными модуляторами созревания эндометрия являются прогестерон и эстрогены, эффективность действия которых зависит от уровня эстрогеновых (РЭ) и прогестероновых (РП) рецепторов, экспрессируемых клетками стромы и эпителия эндометрия [28]. В последнее время было получено представление о типах стероидных рецепторов (РЭ-а, РЭ-Р, РП-А, РП-В), а также динамике экспрессии этих рецепторов [9, 10, 24, 26]. Очевидно, что правильная циклическая экспрессия рецепторов играет важную роль для восприимчивости эндометрия и успешности имплантации [16, 22] и может служить маркером готовности эндометрия к наступлению беременности в программе ЭКО и ПЭ.
Целью настоящего исследования явилась оценка влияния морфологической структуры и рецепторного статуса эндометрия в «окно имплантации» на результативность ЭКО у пациенток с трубным бесплодием и возможности коррекции выявленных нарушений с помощью гормональных препаратов.
Материалы и методы: в исследуемую группу включены 65 пациенток, с трубно-перитонеальным бесплодием, с нормозооспермией у мужа, в возрасте от 25 до 38 лет, с двумя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе. Проведено исследование образцов ткани эндометрия, полученных методом аспи-рационной биопсии с использованием «PipeИ», забор которых проводился у пациенток в предшествующем ЭКО-цикле на 6—8-й день после овуляции, подтвержденной трансвагинальным УЗ исследованием. В день пайпель-биопсии определяли содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови. В течение предыдущих 3 месяцев пациентки не получали гормонального лечения и не имели внутри-маточных вмешательств. Полученные соскобы фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин и делали срезы толщиной 5 мкм, далее окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимических реакций парафиновые срезы обрабатывали по стандартной методике, использовали мышиные моноклональ-ные антитела к эстрогеновым (клон Ш5 «DAKO») и прогестероновым рецепторам (клон 636 «DAKO»). Уровень экспрессии считали количественным методом (процент ярко окрашенных ядер на 100 клеток). Реакцию считали отрицительной при полном отсутствии или при экспрессии антигена менее чем в 5% клеток, слабо положительной — при наличии 6—25% клеток, умеренно положительной — в 26—75%, выраженной — более чем в 75% клеток. Стимуляция суперовуляции проводилась по стандартному короткому протоколу со 2—3-го дня менструального цикла, с использованием препаратов рекомбинантного ФСГ и антагонистов гонадотропин рилизинг гормона.
Результаты: средний возраст пациенток составил 32,8 ± 0,75 с длительностью бесплодия 6,39 ± 0,88 лет.
По результатам гистологического и иммуногистохимического исследования пациентки были разделены на 4 группы (табл.1).
Таблица 1
Содержание рецепторов стероидных гормонов в функциональном слое эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе (% окрашенных клеток, М ± m)
Группа Морфология Железы Строма
РЭ РП РЭ РП
1 Середина фазы секреции 21,6 ± 16,5 82,9 ± 7,8 22,5 ± 15,8 87,2 ± 4,9
2 Поздняя фаза пролиферации 79,36 ± 6,78 87,13 ± 11,1 81,25 ± 6,41 88,38 ± 11,07
Поздняя фаза секреции 14,83 ± 5,85 15 ± 4,47 12,33 ± 4,55 49,17 ± 7,36
3 Середина фазы секреции 83,95 ± 35,62 94,4 ± 6,18 84,85 ± 5,31 95,9 ± 5,46
4 Поздняя фаза пролиферации 4,62 ± 2,1 17,46 ± 10,96 5,77 ± 3,46 55 ± 18,6
Примечание. Реакция отрицительная — отсутствие или экспрессия антигена менее чем в 5% клеток, слабоположительная — при наличии 6—25% клеток, умеренно положительная — в 26—75%, выраженная — более чем в 75% клеток.
Первую группу составили 18 пациенток (28%) у которых не было обнаружено патологических изменений эндометрия и выявлена середина фазы секреции с соответствующей данной морфологической картине экспрессией рецепторов (слабо или умеренно выраженная экспрессия РЭ; резко выраженная экспрессия РП). Частота наступления беременности в данной группе составила 56% (10 женщин).
Во вторую группу вошли 14 пациенок (21%), у которых гистологическая картина не соответствала дню менструального цикла. Однако содержание рецепторов было характерным (нормальным) для обнаруженной морфологической картины. Из них у 8 женщин выявлено отставание созревания эндометрия (фаза пролиферации) с резко выраженной экспрессией РЭ и резко выраженной экспрессией РП. 6 женщин имели позднюю фазу секреции, слабо выраженную экспрессию РЭ и слабо или умеренно выраженную экспрессию РП. Беременность наступила у 4 пациенток (28,6%).
У 20 (31%) пациенток, составивших третью группу, была обнаружена середина фазы секреции, однако не наблюдалось характерного для данной морфологической картины снижения экспрессии РЭ и РП (резко выраженная экспрессия РЭ, резко выраженная экспрессия РП). В данной группе частота наступления беременности была наиболее низкой и составила только 10% (2 пациентки).
Фаза пролиферации со сниженным содержанием РЭ (отсутствие экспрессии) и РП (слабовыраженная экспрессия) была обнаружена у 13 женщин (20%) — четвертая группа. Этим пациенткам проводилась подготовка к ЭКО путем применения трансдермального препарата 17Р-эстрадиола (Дивигель) и микронизированно-го прогестерона (Утрожестан) в течение 2 менструальных циклов. На фоне терапии была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия. У всех пациенток выявлен эндометрий середины фазы секреции и повышение экспрессии стероидных рецепторов (слабо или умеренно выраженная экспрессия РЭ, резко выраженная экспрессия РП). Беременность после лечения наступила у 8 женщин (62%).
Обсуждение: гистологическое исследование эндометрия в постовуляторный период на протяжении многих лет использовалось для оценки функции эндометрия. Однако недавние исследования ставят под сомнение важность этого метода для прогнозирования наступления беременности у пациенток с бесплодием [18, 23] и активно ведется поиск новых маркеров рецептивности эндометрия в предполагаемое «окно имплантации» [21, 24, 28]. Правильная циклическая экспрессия рецепторов играет ведущую роль для восприимчивости эндометрия и успешности имплантации [16, 22] и может служить маркером готовности эндометрия к наступлению беременности в программе ЭКО и ПЭ. Содержание стероидных рецепторов в нормальном эндометрии на протяжении менструального цикла описана многими исследователями [3, 9, 24, 27]. Большинство из них единодушны в том, что в фолликулярную фазу концентрация РЭ повышается и достигает максимума к концу пролиферативной фазы, затем экспрессия РЭ резко уменьшаеся на протяжении секреторной фазы. РП постепенно повышаются на протяжении проли-феративной и ранней секреторной фазы, с постепенным уменьшением в позднюю секреторную фазу, особенно в железистых клетках.
В настоящем исследовании частота наступления беременности после ЭКО и ПЭ была наиболее высокой (56%) в группе пациенток, у которых в предшествующем цикле биопсия эндометрия показала отсутствие патологических изменений в морфологическом и рецепторном статусе эндометрия.
Почти у половины женщин (41%) выявлено несоответствие гистологической картины дню менструального цикла. Однако беременность наступила у 4 из 14 пациенток (28,6%), у которых иммуногистохимические показатели стероидных рецепторов были нормальными для обнаруженной морфологии. Учитывая относительно высокую частоту наступления беременности в данной группе, возможно предположить, что несоответствующий дню менструального цикла эндометрий при отсутствии дисбаланса в экспрессии РЭ и РП не влияет на исход программы ЭКО. Следует отметить, что 3 беременности наступили у женщин, у которых была обнаружена фаза пролиферации. Вероятно, это связано с используемой схемой стимуляции, так как известно, при применении коротких протоколов с антагонистами ГнРГ, супрафизиологические концентрации стрероидных гормонов могут вызывать более раннее развитие эндометрия в цикле стимуляции суперовуляции [14, 25].
Особый интерес представляет 3-я группа женщин, у которых морфологическая картина эндометрия ^ответствовала середине фазы секреции, а иммуногис-тохимичекое исследование показало высокий уровень экспрессии РЭ и РП, характерный для средней или поздней стадии пролиферации, т.е. не наблюдалось характерное для середины лютеиновой фазы цикла снижение РЭ. Такой эндометрий, казалось, адекватно ответил на воздействие стероидных гормонов, но вероятно имелось повреждение рецепторного аппарата на тканевом уровне или локальное нарушение регулирующей роли паракринных и аутокринных факторов экспресси-руемых в эндометрии в «окно имплантации». Частота наступления беременности в данной группе была самой низкой и составила 10%. Подобная морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия описана другими исследо-
вателями при таких патологиях, как хронический эндометрит [7, 15], гиперплазия эндометрия [3, 8]. Описано сочетание подобной картины с высокой экспрессией фактора пролиферации — белка Ю-67 в железах и строме эндометрия [7, 15]. Необходимо отметить, что уровни прогестерона и эстрадиола в сыворотке крови, а также толщина эндометрия в день пайпель-биопсии были в пределах нормальных значений.
Как уже было отмечено, почти у половины женщин (41%) выявлено несоответствие гистологической картины дню менструального цикла. Из них у 20% (13 женщин) — четвертая группа — фаза пролиферации сочеталась с отсутствием экспрессии РЭ и слабовыраженной экспрессией РП, т.е. не наблюдалось адекватного ответа эндометрия на эндогенные стероидные гормоны. Этим пациенткам проводилась подготовка к ЭКО путем применения трансдермального 17Р-эстрадиола (Дивигель) и микронизированного прогестерона (Утрожестан) в течение 2 менструальных циклов. Трансдермальная форма введения эстрогенов выбрана не случайно, так как именно этот путь позволяет уменьшить количество вводимого эстрадиола, который при пероральном приеме сразу после всасывания в кишечнике попадает в кровеносное русло и проходит через систему воротной вены печени, что ведет к значительному разрушению эстрогена. При трансдермальном введении необходимо меньшее количество активного ин-гридиента, что снижает медикаментозную нагрузку [2]. На фоне гормональной терапии была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия на 19— 23-й день лечебного цикла. У всех пациенток был выявлен эндометрий середины фазы секреции. Отмечалось повышение экспрессии стероидных рецепторов (слабо или умеренно выраженная экспрессия РЭ; резко выраженная экспрессия РП). Беременность после гормональной подготовки наступила у 8 женщин (62%).
Выводы.
Иммуногистохимическое исследование рецепторов эндометрия к стероидным гормонам более полноценно отражает структурно-функциональное состояние эндометрия и может использоваться при подборе адекватной гормональной терапии для подготовки эндометрия к программе ЭКО и ПЭ. Дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов и созревания эндометрия на фоне нормального профиля сывороточных гормонов может свидетельствовать о повреждении рецепторного аппарата на тканевом уровне или локальном нарушении регулирующей роли па-ракринных и аутокринных факторов экспрессируемых в эндометрии в «окно имплантации». Применение в качестве подготовки гормональных препаратов с учетом морфологического развития и рецепторного статуса эндометрия возможно позволит повысить результативность программ ВРТ.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Алгоритм обследования и лечения пациентов с многократными неудачными программами ВРТ [Текст]: тез. докл. конф. / Казань: [б.и.], 2007. — С. 20—21.
[2] Дивигель в лечении бесплодия с помощью ВРТ [Текст] / М.Б. Аншина [и др.] // Проблемы репродукции. — 2008. — № 5. — С. 48—51.
[3] Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии [Текст] / О.Н. Лысенко [и др.] // Архив патологии. — 2004. — № 2. — С. 7—10.
[4] КорсакВ.С. ВРТ в России. Отчет за 2005 год [Текст]: (оригинальная статья) / В.С. Корсак // Проблемы репродукции. — 2007. — № 6. — С. 9—13.
[5] Кулаков В.И. Бесплодный брак [Текст] / В.И. Кулаков. — М.: Гэотар-мед, 2005. — 616 с. — Библиогр.: С. 19—21.
[6] Молекулярно-биологические аспекты имплантации у человека и животных [Текст] /
A.В. Светлаков [и др.] // Проблемы репродукции. — 2002. — № 2. — С. 16—28.
[7] Морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия у женщин с первичным и вторичным бесплодием [Текст] / В.С. Бессмертная [и др.] // Архив патологии. — 2008. — № 4. — С. 31—33.
[8] Особенности циклических изменений эндометрия у женщин, срадающих эндокринным бесплодием [Текст] / М.В. Яманова [и др.] // Проблемы репродукции. — 2003. — № 4. — С. 64—70.
[9] Androgen, estrogen and progesterone receptor expression in the human uterus during the menstrual cycle [Text] / H.J. M.M. Mertens [et al.] // European J of Obstetrics and Gynecology and Reprod Biology. — 2001. — V. 98. — P. 58—65.
[10] Colocalization of progesterone receptors A and И by dual immunofluorescent histochemistry in human endometrium during the menstrual cycle [Text] / P.A. Mote [et al.] // О. Clin. Endocrinol. Metab. — 1999. — V. 84. — P. 2963—2971.
[11] Concentration of leukaemia inhibitory factor (LIF) in uterine flushing fluid is highly predictive of embryo implantation [Text] / N. Ledee-Bataille [et al.] // Hum. Reprod. — 2002. — V. 17. — P. 213—218.
[12] Cytokines and embryo implantation [Text] / C. Simon [et al.] // J. Reprod. Immunol. — 1998. — V. 39. — P. 117—131.
[13] Donaghay M. Uterine receptivity: alterations associated with benign gynecological disease / M. Donaghay, B.A. Lessey // Semin. Reprod. Med. — 2007. — V. 25. — P. 461—475.
[14] Effect of ovarian stimulation with recombinant follicle-stimulating hormone, gonadotropin releasing hormone antagonists, and human chorionic gonadotropin on endometrial maturation on the day of oocyte pick-up [Text] / E. Kolibianakis [et al.] // Fertil. Steril. — 2002. — V. 78. — P. 1025—1029.
[15] ER, PR and Ki-67 expression status in granulomatous and chronic non-specific endometritis [Text] / K. Mishra [et al.] // О. Obstet. Gynecol. Res. — 2008. — V. 34. — P. 371—378.
[16] Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation [Text] / W.G. Ma [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. — V. 100. — P. 2963—2968.
[17] Implantation failure in assisted reproduction technology and a critical approach to treatment [Text] / P.E. Levi Setti [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2004. — V. 1034. — P. 184—199.
[18] Interobserver and intraobserver variability in the histological dating of the endometrium in fertile and infertile women [Text] / E.R. Myers [et al.] // Fertil. Steril. — 2004. — V. 82. — P. 1278—1282.
[19] Investigation and current management of recurrent IVF treatment failure in the UK [Text] /
B.K. Tan [et al.] // B.J.O.G. — 2005. — V. 112. —P. 773—780.
[20] Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET [Text] / E.J. Margalioth [et al.] // Hum. Reprod. — 2006. — V. 21. — P. 3036—3043.
[21] Kodaman P.H. Hormonal regulation of implantation [Text] / P.H. Kodaman, H.S. Taylor // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. — 2004. — V. 31. — P. 745—766.
[22] Lessey B.A. Two pathways of progesterone action in human endometrium: implicacions for implantation and contraception [Text]: (review) / B.A. Lessey // Steroids. — 2003. — V. 68. — P. 809—815.
BecTHHK Py^H, cepua Медицина, 2009, № 6
[23] NICHD National Cooperative Reproductive Medicine Network: histological dating of timed endometrium biopsy tissue is not related to fertility status [Text] / C. Coutifaris [et al.] // Fertil. Steril. — 2004. — V. 82. — P. 1264—1272.
[24] Quantitative histomorphometric analysis of gonadal steroid receptor distribution in the normal human endometrium through the menstrual cycle [Text] / A.H. Taylor [et al.] // Histo-chem. Cell. Biol. — 2005. — V. 123. — P. 463—474.
[25] Steroid receptor expression in late follicular phase endometrium in GnRH antagonist IVF cycles is already altered, indicating initiation of early luteal phase transformation in the absence of secretory changes [Text] / E.G. Papanikolaou [et al.] // Hum. Reprod. — 2005. — V. 20. — P. 1541—1547.
[26] Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium [Text] / P.S. Cooke [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — V. 94. — P. 6535—6540.
[27] Study of oestrogen and progesterone receptors in normal human endometrium during the menstrual cycle by immunocytochemical analysis [Text] / H.Y.M. Fung [et al.] // Gynecol. Obstet. Invest. — 1994. — V. 38. — P. 186—190.
[28] The role of endometrium and embryo in human implantation [Text] / K. Diedrich [et al.] // Hum. Reprod. — 2007. — V.13. — P. 365—377.
IMMUNOHISTOCHEMISTRY FEATURES OF THE ENDOMETRIUM IN ART
E.V. Dyuzheva, E.A. Kalinina, L.N. Kuzmichev, E.A. Kogan
Scientific Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology
Oparina str., 4, Moscow, Russia, 117997
Assessment of the influence of morphological structure and steroid receptor status of the endometrium during the window of implantation on IVF results in patients with tubal factor infertility. Imbalance of steroid receptors expression and endometrial maturation with background normal levels of serum hormones indicates the failure on the tissue level of receptors. Hormonal therapy in accordance to morphological development and receptor status of endometrium possibly will increase the effectiveness of IVF-ET cycles.
