CC BY
28
9. Gurjav U., Erkhembayar B., Burneebaatar B., Narmandakh E., Tumenbayar O., Hill-Cawthorne G.A. et al. Transmission of multi-drug resistant tuberculosis in Mongolia is driven by Beijing strains of Mycobacterium tuberculosis resistant to all first-line drugs. Tuberculosis (Edinb). 2016; 12 (101): 49 - 53.
10. Zhdanova S.N., Ogarkov O B., Vinokurova M.K., Alekseeva G.I., Kravchenko A.F., Savilov E.D. Modeling the distribution of major clones of the causative agent of tuberculosis in the Sakha (Yakutia). Tuberkulez i bolezni legkih. [Tuberculosis and Lung Diseases]. 2017; 95 (7): 40-47. (in Russian)
11. Mokrousov I. Mycobacterium tuberculosis phylogeography in the context of human migration and pathogen's pathobiology: Insights from Beijing and Ural families. Tuberculosis (Edinb). 2015; T 6(95) :167-176.
12. Railway transport in Mongolia. Available at: https://ru.wikipedia.org/wiki. (in Russian).
Оценка степени аллергизирующего действия различных препаратов Francisella tularensis
Т.П. Старовойтова, В.И. Дубровина (dubrovina-valya@mail.ru), Т.А. Иванова, А.В. Корнева, С.А. Витязева, М.Ю. Котлов, С.В. Балахонов
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, (adm@chumin.irkutsk.ru)
Резюме
Проведена оценка степени сенсибилизации лейкоцитов крови морских свинок, иммунизированных препаратами клеточных стенок Francisella tularensis разных подвидов. Показано, что препараты КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole, в отличие от препаратов КС F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306, не вызывают аллергизацию организма.
Ключевые слова: туляремия, лейкоциты, клеточные стенки, сенсибилизация Assessment of the Degree of Allergenic Effects of Various Drugs of Francisella tularensis
T.P. Starovoitova, V.I. Dubrovina (dubrovina-valya@mail.ru), T.A. Ivanova, A.V. Korneva, S.A. Vityazeva, M.Yu. Kotlov, S.V. Balakhonov Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and the Far East of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance (adm@chumin.irkutsk. ru) Abstract
The evaluation of sensitization conducted on guinea pig leukocytes immunized with the cell wall preparations of F. tularensis. In this research was shown that the cell wall preparations F tularensis subsp mediaasiatica A-61 and F tularensis subsp tularensis В-399 A-Cole do not caused allergization in contrast with cell wall prepararions of F. tularensis 15 (extracted by Research Institute of Epidemiology and Hygiene) and F. tularensis subsp. holarctica 306. Key words: Francisella tularensis, tularemia, leukocytes, cell wall, sensitization
Введение
Применяемые в настоящее время вакцины обладают сенсибилизирующим действием и могут вызывать аллергические реакции. Формирование специфической гиперчувствительности рассматривается как нежелательный фактор, создающий предпосылки для осложнений аллергической природы при повторном введении препарата. Аллергическую сенсибилизацию можно рассматривать как частный случай усиленного либо недостаточно отрегулированного первичного иммунного ответа [1]. Сенсибилизированные клетки белой крови при контакте с антигенами подвергаются массовому разрушению - лейкоцитолизу, что приводит к выбросу в кровеносное русло биогенных аминов, токсинов, ферментов, являющихся медиаторами аллергических реакций немедленного типа. Не является исключением и лицензированная живая модифицированная вакцина Эльберт-Гайского
отечественного производства на основе штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ, применяемая в настоящее время в эндемичных очагах туляремии на территории России [2]. Обладая высокой им-муногенностью при однократном введении, она успешно используется на протяжении длительного времени. Однако применение живой вакцины имеет определенное ограничение, вызванное высокой реактогенностью и отсутствием полных знаний о молекулярных механизмах формирования иммунитета к туляремии [3], что дает основание говорить об актуальности работы в области создания более эффективных профилактических препаратов. Современная стратегия иммунопрофилактики туляремии во многом определяется поиском средств, способных потенцировать иммунные реакции макроорганизма.
На специфичность иммунного ответа макроорганизма у возбудителя туляремии влияют
липополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ), которые рассматриваются как основа профилактических и диагностических препаратов [4, 5]. Во многих работах показано, что независимо от подвидовой принадлежности штаммов-продуцентов, полученные препараты обладают выраженной антигенной активностью, нетоксичны для животных и иммуногенны [5].
В связи с этим исследование препаратов клеточных стенок (КС) F. tularensis разных подвидов является актуальным.
Цель работы - оценить степень сенсибилизации лейкоцитов крови с помощью реакции лей-коцитолиза у экспериментальных животных, иммунизированных клеточными стенками F. tularensis разных подвидов.
Материалы и методы
В работе использовали препараты клеточных стенок F. tularensis разных подвидов, полученные из трех вирулентных штаммов живых культур: F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.), F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.), F. tularensis subsp. holarctica 306 (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.) и вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ (ЛД50для белых мышей - 2 x 106 м.к.) из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института. Работу с экспериментальными животными осуществляли в соответствии с приложением к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708 н «Правила лабораторной практики». В опыте использовали 30 сертифицированных морских свинок обоих полов весом 250 -300 г.
Работа выполнялась in vitro в два этапа. На первом этапе в стерильную пробирку, обработанную гепарином (50 Ед), набирали 3 мл крови из сердца интактных морских свинок. Затем гепаринизиро-ванную кровь разливали по 0,45 мл в стерильные пробирки. В первую, которая являлась контролем, добавили 0,05 мл 0,9% хлористого натрия. Во вторую, третью, четвертую и пятую опытные пробирки вносили 0,9% хлористого натрия по 0,025 мл и по 0,025 мл исследуемого препарата (95 мкг/мл -максимальная доза, не вызывающая спонтанного повреждения клеток крови): во вторую пробирку - КС F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ (далее по тексту F. tularensis 15 НИИЭГ), третью -КС F.tularensis subsp. mediaasiatica А-61, четвертую - КС F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole и в пятую - КС F. tularensis subsp. holarctica 306. Пробирки инкубировали в течение 80 минут при температуре 37 °С, затем тщательно перемешивали и согласно общепринятой методике готовили разведения крови, количество лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева в 25 больших квадратах [6]. Эксперименты проводили в пяти повторах.
Оценку результатов производили по формуле:
К(%) = (Лк - Ло)/Лк х 100%, где
Лк - количество лейкоцитов в контрольной группе, Ло - количество лейкоцитов в опытной группе, К - коэффициент лейкоцитолиза.
По степени интенсивности реакции результат оценивали: отрицательный или сомнительный -разрушение клеток меньше 15%; слабоположительный - альтерация лейкоцитов от 16 до 20%; положительный - от 21 - 30%; резко положительный - лизис клеток от 31% и выше.
На втором этапе в качестве объекта исследования использовали кровь иммунизированных морских свинок, распределенных на четыре опытные группы по пять особей в каждой, и кровь от животных из контрольной группы. Животных опытных групп примировали препаратами КС однократно подкожно в область правого бедра, в дозе 95 мкг/0,5 мл (в пересчете на белок). Морским свинкам контрольной группы вводили в том же объеме изотонический раствор хлорида натрия рН 7,2. Кровь из сердца животного в объеме 1,0 мл забирали на 2, 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляли по выше приведенной формуле. Наряду с этим, во всех случаях так же проводили общий анализ крови по стандартной методике [7].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Статистика», версия 6 (г. Новосибирск). Достоверными оценивали различия при р < 0,05, р < 0,01.
Результаты и обсуждение
При сопоставлении данных гематологического исследования у морских свинок, примированных КС F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306, среднее количество общего числа лейкоцитов во все сроки исследования было в пределах от 9,6 ± 0,6 до 11,8 ± 0,9 х 109/л, что достоверно не отличалось от данного показателя у интактных животных (10,6 ± 0,7 х 109/л). У животных иммунизированных КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 А-Со1е на 2-е и 3-е сутки имело место незначительное повышение общего числа лейкоцитов в пределах от 12,8 ± 0,7 до 13,5 ± 0,9 х 109/л с последующим снижением к 21 суткам до значений в контрольной группе. Общее число эритроцитов у животных всех опытных групп не отличалось от показателей в контрольной группе (5,6 ± 0,4 х 1012/л) и варьировало в пределах 5,7 ± 0,9 -5,9 ± 0,5 х 1012/л.
При изучении морфологического состава периферической крови экспериментальных животных установлено, что на ранних сроках наблюдения (2-е и 5-е сутки) в крови животных, иммунизированных КС F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp.
holarctica 306 имело место увеличение эозинофи-лов (в 3 - 4 раза) по сравнению с контролем. Увеличение числа эозинофилов (эозинофилию) можно рассматривать как аллергическую реакцию организма животных на вводимые препараты (рис. 1). К более поздним срокам (14 - 21 сутки) данный показатель снижался до значения в контроле. При введении морским свинкам КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole на 3-е, 5-е и 7-е сутки имело место повышение числа овальноядерных моноцитов и широкоплазменных лимфоцитов, указывающее на активацию иммунного ответа на введение этих препаратов. К 14-м суткам в этих опытных группах показатели лейкограммы не отличались от значений в контроле.
Результаты взаимодействия лейкоцитов крови интактных морских свинок с КС F. tularensis разных подвидов в условиях in vitro представлены в таблице 1. Процент лизированных лейкоцитов крови, примированных КС F. tularensis 15 НИИ-ЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306 составил 18,9% ± 1,7 и 18,7% ± 1,3 соответственно, что в 1,9 и в 2,7 раза превышало альтерацию лейкоцитов крови животных, примированных КС F. tularensis subsp. или mediaasiatica А-61, и КС F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole соответственно. Данное обстоятельство указывает на реакцию гиперчувствительности немедленного типа в ответ на введения антигена - аллергическую реакцию, которую можно расценивать в первом случае как слабоположительную (КС F. tularensis 15 НИИ-ЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306) и сомнительную во втором случае (КС F tularensis subsp. mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole).
На следующем этапе исследования оценивали действие КС F. tularensis разных подвидов в условиях in vivo на клетки крови морских свинок, иммунизированных этими препаратами. В крови экспериментальных животных, иммунизированных КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole во все сроки наблюдения количество разрушенных лейкоцитов не превышало 15%, что указывает на отсутствие специфической сенсибилизации организма экспериментальных животных на введение данных
Рисунок 1.
Кровь морской свинки. 2-е сутки после иммунизации КС F. tularensis subsp. Мо!агс^са 306. Эозинофилия. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение 10 х 100
препаратов. В случае применения КС F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis в^вр. holarctica 306 на 2-е и 3-и сутки установлена положительная реакция лейкоцитолиза (количество разрушенных лейкоцитов на 2-е сутки составило 24,6 ± 1,3 и 22,4 ± 0,9 соответственно, а на 3-и сутки -20,7 ± 1,8 и 26,4 ± 1,6 соответственно). На 5 -14-е сутки выявлено снижение коэффициента лейкоцитолиза, который не превышал 20% (рис. 2). К 21 суткам только в случае иммунизации морских свинок КС F. tularensis в^вр. holarctica 306 альтерация лейкоцитов оставалась слабоположительной (К > 15%).
Выводы
1. Сравнительное изучение морфологического и количественного состава клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных КС показало, что независимо от подви-довой принадлежности штаммов-продуцентов, полученные препараты нетоксичны для морских свинок.
2. На ранних сроках наблюдения (2 - 7 сутки) установлено у экспериментальных животных, иммунизированных КС, повышение показателей индекса лейкоцитолиза, которые к 21 суткам достоверно не отличались от значений в контроле.
3. Изменения, вызванные введением антигенных препаратов КС F. tularensis в^вр.
Таблица 1.
Влияние КС F. tularensis разных подвидов на неспецифическую сенсибилизацию лейкоцитов крови интактных морских свинок в условиях in vitro (M ± m)
Антигенные препараты КС К, %
F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61 9,7 ± 1,7
F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole 6,8 ± 1,1
F. tularensis subsp. holarctica 306 18,7 ± 1,3
F. tularensis 15 НИИЭГ 18,9 ± 1,7
Контроль 0
Рисунок 2.
Влияние КС F. tularensis разных подвидов на неспецифическую сенсибилизацию лейкоцитов в крови морских свинок
mediaasiatica А-61 и F. tularensis subsp. tularensis В-399 A-Cole. не вызывают ал-лергизацию организма экспериментальных животных.
4. Увеличение числа эозинофилов и повышение коэффициента лейкоцитолиза в случае применения препаратов КС F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306 можно
расценивать как аллергическую реакцию организма на введение этих антигенов.
При аллергодиагностике экспериментальных антигенных препаратов в частности для оценки степени сенсибилизации лейкоцитов крови лабораторных животных может быть использован данный метод с учетом простоты постановки и информативности. Ш
Литература
1. Чурилов Л. П., Васильев А. Г. Патофизиология иммунной системы: Учебное пособие. Санкт-Петербург: «Издательство ФОЛИАНТ». 2014: 664.
2. Николаев В.Б. Физико-химические и иммунобиологические свойства антигенов туляремийного микроба: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Иркутск; 2005: 23.
3. Клеточные и гуморальные факторы иммунитета в патогенезе туляремии. С.В. Балахонов, ред. Иркутск; 2017: 136.
4. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. В.В. Меньшиков, ред. Москва; 1987: 365.
5. Фирстова В.В. Экспериментально-иммунологические особенности обоснование выбора стратегии оценки поствакцинального иммунитета против чумы и туляремии: Дис. ... д-ра. биол. наук. Оболенск; 2015: 281.
6. Кузнецова Е.М. Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Саратов; 2011: 22.
7. Методические указания МУ 3.1.2007-05. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический надзор за туляремией. 2005.
References
1. Pathophysiology of the immune system. Churilov L.P, Vasiljev A.G.: Saint Petersburg «Folliant». 2014: 664 (in Russian).
2. Nikolaev V.B. Physico-chemical and immunobiological properties of antigens of tularemic microbe. Doctorate of med. sci. diss. Irkutsk; 2005 (in Rissian).
3. Cellular and humoral immunity factors in the pathogenesis of tularemia. Ed.; S.V. Balakhonov. Irkutsk; 2017: 136 (in Russian).
4. Laboratory methods in clinic. Ed.: V.V. Men'shikov. Moscow; 1987; 365 (in Russian).
5. Firstova V.V. Experimental study immunological features a choice of strategy assessment of post-vaccination immunity against plague and tularemia. Doctorate of biol. sci. diss. Obolensk; 2015 (in Russian).
6. Kuznetsova E.M. Optimization methods for the preparation of antigenic complexes tularemic microbe and construction on their basis of diagnostic products: Doctorate of biol. sci. diss. Saratov; 2011 (in Russian).
7. Guidelines MU 3.1.2007-05. Prevention of infectious diseases. Epidemiological surveillance of tularemia (in Russian).
