CC BY
14Оригинальные статьи
^ ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ -— ^
DOI: https://doi.org/10.31089/1026-9428-2021-61-10-636-646 УДК 57.084.1
© Коллектив авторов, 2021
Тоньшин А.А.1, Бонитенко Е.Ю.1,2, Котский М.А.1, Макаров А.Ф.1, Бала А.М.3, Ковалева А.С.1, Родченкова П.В.1, Лапшинова Б.О.1, Блинцова Н.В.1
Оценка состояния условно-рефлекторной деятельности в процессе жидкостного дыхания
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицины труда имени академика Н.Ф. Измерова», пр-т Будённого, 31, Москва, Россия, 105275;
2ФГОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России, Пискаревский пр-т, 47, Санкт-Петербург, Россия, 195067;
3Фонд перспективных исследований, Бережковская наб., 22/3, Москва, Россия, 121059
Введение. Жидкостное дыхание — способность лёгких млекопитающих получать для дыхания кислород, растворенный в жидкости и выделять в неё углекислый газ. Перспективная область применения — обеспечение глубоководных работ. Для применения жидкостного дыхания при проведении глубоководных работ, необходимо, чтобы технология обеспечивала не только нормальное функционирование всех органов и систем организма и предотвращала развитие декомпрессионной болезни, но и позволяла осуществлять сознательную деятельность.
Цель исследования — оценка сохранности условно-рефлекторной деятельности при самостоятельном жидкостном дыхании у лабораторных животных в условиях нормобарии.
Материалы и методы. Исследование выполнено на самцах сирийских хомяков возрастом 4 месяца, массой 120-140 г. Для исследования разработан стенд, представляющий 8-ми уровневый вертикальный лабиринт с фиксатором, погружаемый в аквариум. Исследование выполнено в два этапа. На первом этапе у животных вырабатывали условный рефлекс активного избегания утопления в условиях дыхания воздухом. Животное помещали на нижнем уровне, после чего лабиринт начинали погружать в аквариум, заполненный водой со скоростью, при которой только голова животного находилась над уровнем воды. Угроза утопления побуждала животное к поиску прохода на вышерасположенный уровень. Тренировки проводили 3 раза в день в течение 10 дней. На втором этапе изучали влияние различных условий жидкостного дыхания на состояние условно-рефлекторной деятельности животных. Использовали две дыхательные жидкости — перфторгексан и перфтордекалин — в трёх температурных режимах: 22,0, 27,0 и 32,0°С. Аквариум вместо воды заполняли оксигенированной дыхательной жидкостью необходимой температуры. Лабиринт с фиксированным на нижнем уровне животным полностью погружали в аквариум. После перехода на жидкостное дыхание животное снимали с фиксации. С момента снятия с фиксации начинался отсчёт времени прохождения лабиринта. Оценку состояния условно-рефлекторной деятельности осуществляли по количеству животных в группе, успешно прошедших лабиринт и среднему времени его прохождения.
Результаты. Животные на жидкостном дыхании в перфторгексане успешно прошли лабиринт во всех температурных режимах. Среднее время прохождения при 22,0°С составило 323±94 с; 27,0°С — 45±12 с; 32,0°С — 147±101 с. Животные на жидкостном дыхании в перфтордекалине успешно прошли лабиринт при температуре 27,0°С, среднее время прохождения — 131±79 с; при температуре 32,0°С успешно прошли лабиринт 20% животных, среднее время — 32,5 с; при температуре 22,0°С ни одно животное не прошло лабиринт.
Выводы. Условно-рефлекторная деятельность при самостоятельном жидкостном дыхании у мелких лабораторных животных в условиях нормобарии сохраняется и зависит от физико-химических свойств и температуры дыхательной жидкости. Этика. Исследования с участием лабораторных животных проходили с соблюдением необходимых нормативных актов (Хельсинкской декларации 2000 г. о гуманном отношении к животным и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977)). Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицины труда имени академика Н.Ф. Измерова».
Ключевые слова: жидкостное дыхание; условно-рефлекторная деятельность; физиология поведения; лабиринт для животных; принудительное плавание; гипотермия
Для цитирования: Тоньшин А.А., Бонитенко Е.Ю., Котский М.А., Макаров А.Ф., Бала А.М., Ковалева А.С., Родченкова П.В., Лапшинова Б.О., Блинцова Н.В. Оценка состояния условно-рефлекторной деятельности в процессе жидкостного дыхания. Мед. труда и пром. экол. 2021; 61(10): 636-646. https://doi.org/10.31089/1026-9428-2021-61-10-636-646 Для корреспонденции: Тоньшин Антон Александрович, заведующий лабораторией токсикологии, ФГБНУ «НИИ МТ», канд. биол. наук. E-mail: atonshin@yandex.ru Участие авторов:
Тоньшин А.А., Бонитенко Е.Ю., Котский М.А., Макаров А.Ф. — концепция и дизайн исследования; Ковалева А.С., Макаров А.Ф. — компьютерная томография;
Котский М.А., Макаров А.Ф. — аутопсия;
Родченкова П.В., Лапшинова Б.О., Блинцова Н.В., Ковалева А.С. — сбор и обработка данных; Тоньшин А.А., Бонитенко Е.Ю. — написание текста;
Котский М.А., Макаров А.Ф., Бала А.М. — редактирование.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке Фонда перспективных исследований.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Дата поступления: 18.10.2021 / Дата принятия к печати: 10.11.2021 / Дата публикации: 18.11.2021
Введение. Жидкостное дыхание (ЖД) — способность лёгких млекопитающих получать для дыхания кислород, растворенный в жидкости и выделять в неё углекислый газ, была впервые экспериментально продемонстрирована ].А. КуЫта с соавторами в 1962 году в опытах на мышах [1]. В качестве дыхательной жидкости (ДЖ) использовались изотонические солевые буферные растворы, насыщенные кислородом под давлением 7,0 избыточных атмосфер. При таком давлении содержание растворенного кислорода в воде эквивалентно его концентрации в воздухе при нормобарических условиях. Авторам удалось подобрать такие условия эксперимента, при которых продолжительность выживания мышей, находившиеся на ЖД в условиях гипербарии, достигала 18 часов, правда, без возможности обратного перехода на газовое дыхание при атмосферном давлении. Следует отметить, что при этом двигательная активность у животных сохранялась в течение первых 6 часов и проявлялась «реакцией на встряхивание капсулы и постукивание по её стенкам». После того, как удалось обеспечить обратный переход с жидкостного дыхания на газовое [2, 3], была экспериментально подтверждена гипотеза о способности ЖД предотвращать развитие декомпрессионной болезни [4, 5].
Исследования, посвящённые изучению возможности применения ЖД для обеспечения глубоководных работ, проводились вплоть до 1985 г. [6-9], более поздних публикаций в открытой печати обнаружить не удалось. Все опубликованные работы были посвящены изучению особенностей функционирования отдельных физиологических систем организма при ЖД в условиях гипербарии и проводились на животных в условиях фиксации, миорелаксации или ограниченного пространства.
Таким образом, современные знания относительно возможности осознанной деятельности в условиях ЖД ограничиваются данными полученными в самой первой опубликованной работе по ЖД [1]. Однако, для применения ЖД при проведении глубоководных работ, необходимо, чтобы эта технология обеспечивала не только нормальное функционирование всех органов и систем организма и предотвращала развитие декомпрессионной болезни, но и позволяла осуществлять сознательную деятельность.
Цель исследования — оценка сохранности условно-рефлекторной деятельности при спонтанном ЖД у мелких лабораторных животных в условиях нормобарии.
Материалы и методы. Исследование выполнено на половозрелых самцах сирийских хомяков, полученных из ООО «Кролинфо» возрастом 4 месяца, массой 120-140 г. Перед проведением исследования животных ка-рантинировали в течение 14 дней. Во время карантина и в процессе исследования животные содержались в соответствии с требованиями ГОСТ
Original articles
33215-20141 и ГОСТ 3 3 2 1 5-20 1 42 на стандартном водном и пищевом рационе в отдельном помещении.
Методика исследования основана на предварительной выработке у мелких лабораторных животный условного рефлекса активного избегания с последующим его подтверждением в условиях ЖД в иммерсии оксигенирован-ной ДЖ в нормобарии.
Для проведения исследования был разработан стенд, позволяющий изучать условно-рефлекторную деятельность как в газовой, так и в жидкостной среде. Стенд представлял из себя 8-уровневую конструкцию (лабиринт), которая помещалась в прозрачную ёмкость — аквариум (рис. 1). Уровни за исключением первого были выполнены из непрозрачных прямоугольных перфорированных (для свободного проникания газа и жидкости) акриловых пластин размером 225x135 мм с одним отверстием диаметром 50 мм для прохода животного. Уровни фиксировались на четырёх металлических шпильках, расположенных по углам. Высота 1-ого уровня составляла 100, 2-8-го — 45 мм. Отверстия для прохода животного располагались в шахматном порядке.
Удерживание животного на стартовой позиции нижнего уровня осуществлялось с помощью дистанционного
1 ГОСТ 33215-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур.
2 ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.
Рис. 1. Общий вид стенда. A — стенд: 1 — аквариум; 2 — пластина лабиринта с перфорацией; 3 — кнопка фиксатора; 4 — зажим фиксатора животного. B — хомяк в лабиринте на жидкостном дыхании. C — закрытый фиксатор. D — открытый фиксатор.
Оригинальные статьи
фиксатора с кнопкой. Фиксатор представлял из себя модифицированный цанговый зажим для фиксации лабораторного животного за основание хвоста.
Исследование было выполнено в два этапа. На первом этапе у животных вырабатывали условный рефлекс активного избегания утопления в условиях дыхания воздухом. Для этого аквариум заполняли водой, комнатной температуры (20,0-22,0°С) таким образом, чтобы при полном погружении в него лабиринта площадка верхнего уровня находилась под водой. Животное фиксировали на стартовой позиции нижнего уровня после чего лабиринт начинали плавно погружать в аквариум. Подбиралась такая скорость погружения, при которой голова животного находилась над уровнем воды. Угроза утопления побуждала освобожденное с фиксатора животное к перемещению на вышерасположенный уровень. После полного прохождения лабиринта животное сушили феном и помещали в клетку. Тренировки проводили три раза в день в течение 10 дней. Степень тренированности животного оценивалась по наименьшему времени прохождения лабиринта, зарегистрированному на 10-ый день. По результатам оценки тренированности были сформированы 6 экспериментальных групп.
На втором этапе изучалось влияние различных условий ЖД на состояние условно-рефлекторной деятельности животных. Для ЖД были использованы две ДЖ — перфторгексан (ПФГ) и перфтордекалин (ПФД), значительно различающиеся по своим физико-химическим свойствам (табл. 1) в трёх температурных режимах 22,0,
27,0 и 32,0°С. При этом насыщение О2, обеих ДЖ было одинаковым и составляло ~90,0 об%. Непосредственные условия ЖД для всех экспериментальных групп представлены в таблице 2.
При оценке условно-рефлекторной деятельности в условиях ЖД аквариум вместо воды заполняли оксигениро-ванной ДЖ необходимой температуры. Оксигенация ДЖ проводилась методом барботирования с помощью концентратора Nidek Mark 5 nuvo Lite (США) в течение часа с расходом кислорода 3 л/мин. Концентрация кислорода в ДЖ определялась с помощью кислородомера Актаком АТТ-3010 (Россия) с функцией термометра.
Перед проведением тестирования у животных измеряли ректальную температуру. При проведении исследования лабиринт с фиксированным животным полностью погружали в аквариум. После перехода на ЖД, о чем свидетельствовали глубокие дыхательные движения, определяемые визуально по струйкам жидкости с изменённым за счёт нагревания в лёгких коэффициентом преломления, выходящим из носа и рта, животное снимали с фиксации (через 30 секунд после погружения в ДЖ). Момент снятия с фиксации являлся началом отсчёта времени прохождения лабиринта.
При остановке более чем на 10 секунд животное стимулировали касанием стальной шпильки через перфорационные отверстия пластин. Если животное не реагировало на стимуляцию, считалось, что животное не справилось, и эксперимент прекращали. Оценку состояния условно-рефлекторной деятельности осуществляли по количеству
Таблица 1
Основные физико-химические свойства дыхательной жидкости
Показатели Перфторгексан Перфтордекалин
CAS 355-42-0 306-94-5
Брутто формула C6F14 C10F18
Производитель ООО «ПКФ «СпецНефтеПродукт» АО «ГалоПолимер»
Содержание основного вещества, % 99,9 >95
Кинематическая вязкость при 25,0°С, мм2/с 0,38 2,9
Плотность при 25,0°С, г/см3 1,67 1,95
Температура плавления, °С -82,25 -10,0
Температура кипения, °С 56,6 142
Растворимость кислорода при 25,0°С, мл газа/100 мл жидкости 62 51
Растворимость углекислого газа при 25,0°С, мл газа/100 мл жидкости 241 232
№ группы животных Дыхательная жидкость Характеристики дыхательной жидкости
Насыщение О2, об% Температура, °С
22,0 27,0 32,0
I. Перфторгексан 90 + - -
II. - + -
III. - - +
IV. Перфтордекалин + - -
V. - + -
VI. - - +
Таблица 2
Разделение животных на группы в зависимости от условий жидкостного дыхания при проведении тестирования
Original articles
Таблица 3
Результаты прохождения лабиринта животными, находящимися на ЖД
№ группы животных Количество животных, прошедших лабиринт Среднее время прохождения лабиринта, сек. Температура ректальная, °С Разница температуры тела до и после тестирования, °С
до тестирования после тестирования
I. 10 323±94 32,9±0,2 25,8±1,0 7,1
II. 10 45±12* 29,0±0,2 3,9
III. 10 147±101 32,1±0,2 0,8
IV. 0 — — —
V. 10# 131±79 27,7±0,5 5,2
VI. 2 38 32,5 0,4
Примечание: * — различие с I группой достоверно (р<0,05); #
животных в группе, успешно прошедших лабиринт и среднему времени его прохождения. Кроме того, после завершения тестирования у животных повторно измеряли ректальную температуру.
В случае невыполнения животными программы эксперимента им проводили дополнительное исследование для определения причин, приведших к подобному результату. Учитывая то обстоятельство, что при самостоятельном ЖД возможно развитие повреждения лёгких, по извлечению из стенда животных эвтаназировали, проводили компьютерную томографию и патологоанатомическое исследование.
Исследование проводили на спиральном компьютерном томографе Hi Speed CT/e General Electric (США) с соблюдением норм, правил и гигиенических нормативов в области радиационной безопасности (согласно СанПиН 2.6.1.1192-03). Сканирование осуществлялось в спиральном режиме с толщиной среза 2 мм и Питчем 1,8 в лёгочном и мягкотканном режимах. Оценивали структуру органов грудной полости животных, а также заполнение лёгких ДЖ посредством получения посрезовых рентгеновских изображений с построением мультипланарных реконструкций с помощью программы постпроцессин-говой обработки изображений Maxaon.
Животных, прошедших тестирование, наблюдали в течение 7 дней после ЖД, оценивали общее состояние животных в динамике и выживаемость.
Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицины труда имени академика Н.Ф. Измерова».
Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программа Statistica 6,0 для Windows. Расчёт средних величин регистрируемых показателей проводился общепринятыми статистическими методами. В случае нормального распределения показателей в экспериментальных группах и равенства дисперсий использовались методы параметрической статистики (сравнения показателей с использованием t-критерия Стъюдента для связанных и несвязанных выборок). Для сравнения средних величин и установления статистической значимости различий с контролем при отсутствии признаков нормального распределения проводили статистическую обработку по непараметрическим тестам (Вил-коксона для связанных и Манна-Уитни для несвязанных выборок).
Результаты. По результатам выполнения первого этапа, в рамках которого осуществлялось обучение животных путём выработки у них условного рефлекса активного
различие с II группой достоверно (р<0,05).
£15
о
I II III IV V VI номер группы
Рис. 2. Среднее время прохождения лабиринта животными в группах
избегания утопления в условиях дыхания воздухом были сформированы экспериментальные группы. Среднее время прохождения лабиринта животными в группах представлено на рисунке 2.
При выполнении второго этапа исследования было установлено, что в группах, дышавших ПФГ, все животные успешно прошли лабиринт вне зависимости от температуры ДЖ (табл. 3). При дыхании ПФД наилучший результат был получен в пятой группе при температуре ДЖ 27,0°С в которой тест прошли 100% животных. В свою очередь в группе VI тест прошло 20% животных, а в IV этот показатель был равен 0. В случае, когда животным не удавалось пройти лабиринт, они сначала останавливались, но при стимуляции продолжали движение. Однако после ряда стимуляций животные отказывались дальше выполнять тест. При этом они продолжали реагировать на стимуляцию, пытаясь увернуться от прикосновения шпильки. Следует отметить, что случаев остановки дыхания во время эксперимента зарегистрировано не было.
В группах, в которых ЖД проводилось с использованием ПФГ наименьшее время прохождения лабиринта было зарегистрировано при температуре ДЖ 27,0°С (группа II). Оно было в 7,18 и 3,27 раза меньше, чем в группах I и III соответственно. В свою очередь при использовании ПФД наименьшим было время в VI группе с температурой ДЖ 32,0°С, которое было в 3,45 раза меньше, чем в группе V.
Обращало на себя внимание, что во всех группах наблюдалось значительное увеличение времени прохождения последних уровней лабиринта, по сравнению с первыми. Кроме того, следует отметить, что в группе III с температурой ПФГ 32,0°С, животные либо быстро проходили лабиринт, либо медленно. В свою очередь в группе
Оригинальные статьи
А В
Рис. 3. Компьютерная томограмма лёгких животного (Л — норма; B — после ЖД).
VI животные с температурой ПФД 32,0°С, животные либо быстро проходили лабиринт, либо не проходили его вообще.
Следует отметить, что во всех группах после прохождения лабиринта наблюдалось снижение ректальной температуры тела, причём степень снижения была пропорциональна температуре ДЖ и длительности тестирования.
При изучении компьютерных томограмм грудной клетки было установлено, что у всех животных, не прошедших тест, паренхима лёгких ДЖ была заполнена практически полностью (рис. 3).
При макроскопическом изучении лёгких у всех животных, не прошедших тестирование, лёгкие были полнокровными, наблюдался венозный застой и единичные участки сохранения воздушности. Случаев перфлуорокар-боноторакса зарегистрировано не было.
При оценке исходов ЖД было установлено, что при использовании ПФГ наблюдалась гибель лабораторных животных, которая составляла 60-70%, в то время как в группах ПФД неблагоприятных исходов зарегистрировано не было (табл. 4). Обращало на себя внимание, что гибель животных после ЖД ПФГ регистрировалась либо в ранние сроки (в течение первого часа после тестирования), либо в поздние (в конце первых — начале вторых суток). Существенных различий в структуре неблагоприятных исходов в зависимости от температурного режима ЖД ПФГ зарегистрировано не было.
Следует отметить, что гибель животных, как в ранние, так и в поздние сроки после ЖД была обусловлена одной причиной — развитием острой дыхательной и сердечнососудистой недостаточности. У животных, погибших в ранние сроки, явления острой дыхательной недостаточности наблюдались сразу после перехода на газовое дыхание, быстро прогрессировали вызывая неблагоприятный исход в течение первого часа после ЖД. В свою очередь гибель в поздние сроки развивалась на фоне быстро прогрессирующей дыхательной недостаточности, возникшей
после длительного скрытого периода в конце первых — начале вторых суток после ЖД.
Обсуждение. Сложность выполнения настоящего исследования была обусловлена, как необходимостью создания оборудования, позволяющего проводить изучение условно-рефлекторной деятельности на мелких лабораторных животных, при самостоятельном ЖД в условиях иммерсии в ДЖ, так и выбором самого условного рефлекса. По результатам проведённого анализа существующих подходов к оценке условно-рефлекторной деятельности для настоящего исследования был выбран условный рефлекс активного избегания [10]. Для этого в газовой среде был выработан условный рефлекс активного избегания утопления, который, судя по всему, при утоплении уже в ДЖ побуждая животных проходить лабиринт для завершения теста (для снятия угрозы).
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что существенное влияние на результаты тестирования оказывали физико-химические свойства выбранных ДЖ. С учётом последних использование ПФГ являлось более предпочтительными, чем ПФД, так как он, с одной стороны обладает меньшей вязкостью (в 7,63 раза) и плотностью (в 1,17 раза), а с другой, большей растворимостью для кислорода и углекислого газа. Исходя из этих различий можно предположить, что причиной лучших результатов тестирования в группах, получавших ПФГ является, как уменьшение энергозатрат на сам процесс ЖД, так и более оптимальный газообмен в лёгких, что приводит к менее выраженной гипоксии.
Существенное влияние температуры ДЖ на процесс самостоятельного ЖД при иммерсии в ней было установлен ещё в работе ].А. КуЫга и соавторов (1962) [1]. Так, в диапазоне температур 6,0-41,0°С продолжительность выживания мышей в условиях ЖД изменялась от 11 до 247 минут. При этом максимальная продолжительность выживания наблюдалась при температуре ДЖ 20,0°С, а отклонение температуры на 1,0-2,0°С приводило к уменьшению последней в 2-3 раза. Объяснением чему может служить тот факт, что гипотермия приводит к замедлению обменных процессов в организме, а при температуре 20,0°С устанавливалась такая их скорость, при которой расход энергии поддерживался на минимальном уровне, достаточным для поддержания жизни в состоянии покоя.
В исследовании наилучшее время тестирования было зарегистрировано в группе II при дыхании ПФГ температурой 27,0°С. Увеличение оптимальной температуры ДЖ на 7,0°С по сравнению с результатами, полученными ].А. КуЫга и соавторами (1962) [1], по-видимому, связано с различными условиями эксперимента и регистрируемы-
Таблица 4
Показатели выживаемости животных после ЖД (М±т)
№ группы животных Количество погибших животных Общее количество погибших животных Средние сроки гибели
в 1-е сутки после 1-х суток в 1-е сутки, мин после 1-х суток, часы
I. 4 3 7 51±10 22±2
II. 3 4 7 47±8 26±3
III. 4 2 6 49±12 23±3
IV. 0 0 0 0 0
V. 0 0 0 0 0
VI. 0 0 0 0 0
ми показателями. Судя по всему, скорость метаболизма при температуре 20,0°С была достаточна для длительного поддержания жизни в состоянии покоя, но явно не оптимальна для выполнения тяжёлой физической работы. В пользу такого предположения свидетельствует то обстоятельство, что в исследовании при 22,0°С животные становились вялыми и отказывались передвигаться по лабиринту, при этом они продолжали дышать жидкостью. В свою очередь при температуре ДЖ 32,0°С скорость метаболизма, наоборот, оказывалась слишком высокой. При этом наиболее важным оказывался сам процесс ЖД, как ключевой для обеспечения жизнедеятельности, а на целенаправленную двигательную активность использовалась оставшаяся энергия. Однако это не распространялось на животных, быстро проходивших лабиринт, как это было в группе VI.
Как видно из представленных данных отказ в прохождении тестирования не был связан ни с не полным заполнением лёгких ДЖ, ни с развитием у животных гидроторакса (перфлуорокарбонторакса).
В свою очередь гибель животных как в ранние, так и в поздние сроки при дыхании ПФГ, судя по всему, также была связана с особенностями физико-химических свойств последнего.
Выводы:
1. Разработанный экспериментальный стенд может быть использован для изучения влияния различных типов
Original articles
ДЖ на состояние условно-рефлекторной деятельности мелких лабораторных животных, в том числе сочетанном с различными физическими факторами.
2. Предложенный подход выработки условного рефлекса активного избегания в газовой среде с последующим проведением тестирования в иммерсии в ДЖ может быть использован для оценки состояния условно-рефлекторной деятельности у мелких лабораторных животных при самостоятельном ЖД.
3. Условно-рефлекторная деятельность при спонтанном ЖД у мелких лабораторных животных в условиях нормобарии сохраняется.
4. Существенное влияние на состояние условно-рефлекторной деятельности при самостоятельном ЖД в иммерсии в ДЖ оказывают её физико-химические свойства, а также температура последней.
5. Выживаемость животных после ЖД непосредственно зависит от физико-химических свойств ДЖ. Так, если ПФД не вызывает у сирийских хомяков выраженной дыхательной недостаточности, приводящей к неблагоприятным исходам после ЖД, то использование ПФГ приводит к гибели животных в 66,7% случаев. Обращает на себя внимание, что гибель животных при использовании ПФГ может наступать, как в ранние сроки в течение первого часа после ЖД, так и в поздние в конце первых начале вторых суток (после скрытого периода).
Список литературы
1. Kylstra J.A., Tissing M.O. van der Maen. Of mice as fish. Trans Am Soc Artif Intern Organs. 1962; 8: 378-83. https://doi. org/10.1097/00002480-196204000-00077
2. Kylstra J.A. Breathing of pressure oxygenated salt solutions. Dis Chest. 1965; 47: 157-9. https://doi.org/10.1378/ chest.47.2.157
3. ClarkJr. L.C., Gollan F. Survival of mammals breathing organic liquids equilibrated with oxygen at atmospheric pressure. Science. 1966; 152(3730): 1755-6. https://doi.org/10.1126/ science.152.3730.1755
4. Gollan F., ClarkJr. L.C. Rapid decompression of mice breathing fluorocarbon liquid at 500 PSI. Ala J Med Sci. 1967; 4(3): 3367.
5. Kylstra J.A., Nantz R., Crowe J., Wagner W., Saltzman H.A. Hydraulic compression of mice to 166 atmospheres. Science. 1967; 158(3802): 793-4. https://doi.org/10.1126/ science.158.3802.793
6. Lundgren C.E., Ornhagen H.C. Heart rate and respiratory
frequency in hydrostatically compressed, liquid-breathing mice. Undersea Biomed Res. 1976; 3(4): 303-20.
7. Lynch P.R., Wilson J.S., Shaffer T.H., Cohen N. Decompression incidence in air- and liquid-breathing hamsters. Undersea Biomed Res. 1983; 10(1): 1-10.
8. Harris D.J., Coggin R.R., Roby J., Feezor M., Turner G., Bennett P.B. Liquid ventilation in dogs: an apparatus for normobaric and hyperbaric studies. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1983; 54(4): 1141-8. https://doi.org/10.1152/ jappl.1983.54.4.1141
9. Harris D.J., Coggin R.R., Roby J., Turner G., Bennett P.B. EEG and evoked potential changes during gas- and liquid-breathing dives to 1000 msw. Undersea Biomed Res. 1985; 12(1): 1-24.
10. Дубравина Н.И., Савостьянова Д.А. Эффекты принудительного плавания и стратегии поведения на устойчивость следа памяти к амнестическо-му воздействию. Бюллетень СО РАМН. 2002; 9(103): 115-20.
Оригинальные статьи
Anton. A. Tonshin1, Evgeny Yu. Bonitenko1,2, Mikhail A. Kotskiyi1, Artur F. Makarov1, Anatoliyi M. Bala3, Alina S. Kovaleva1, Polina V. Rodchenkova1, Bozhena O. Lapshinova1, Nataliya V. Blintcova1
Assessment of the condition of conditioned reflex activity in the process of liquid respiration
1Izmerov Research Institute of Occupational Health, 31, Budennogo ave., Moscow, Russia, 105275; 2Mechnikov North-Western State Medical University, 47, Piskarevskij ave., St. Petersburg, Russia, 195067; 3The Advanced Research Foundation, 22/3, Berezhkovskaya emb., Moscow, Russia, 121059
Introduction. Liquid respiration is the ability of mammalian lungs to receive oxygen dissolved in a liquid for respiration and release carbon dioxide into it. A promising field of application is the provision of marine operations. For the use of liquid respiration during deep-sea operations, the technology must ensure the normal functioning of all organs and systems of the body, prevent decompression sickness, and allow conscious activity.
The study aims to assess the safety of conditioned reflex activity during independent liquid respiration in laboratory animals in normobaric conditions.
Materials and methods. We performed the study on male Syrian hamsters aged four months, weighing 120-140 g. Researchers have developed a stand with an eight-level maze with a lock. We immersed the labyrinth in an aquarium. The scientists carried out the study in two stages. At the first stage, we have developed in animals a conditioned reflex of actively avoiding drowning in conditions of breathing air. The researchers placed the animal on the lower level, then immersed the maze in an aquarium filled with water at a speed that only the animal's head was above the water level. The threat of drowning prompted the animal to search for a passage to a higher level. The training was three times a day for ten days. At the second stage, scientists studied the influence of various conditions of liquid respiration on the state of the conditioned reflex activity of animals. We used two respiratory fluids — perfluorohexane (PFH) and perfluorodecalin (PFD) in three temperature regimes: 22.0, 27.0, and 32.0°C. The researchers filled the aquarium with two oxygenated respiratory fluids of the required temperature instead of water. We have entirely immersed the maze with the animal fixed at the lower level in the aquarium. After switching to liquid respiration, scientists removed the animal from fixation. From the moment of removal from fixation, the countdown of the passage of the maze began. First, we assessed the condition of conditioned reflex activity by the number of animals in the group that successfully passed the maze and the average time of its passage.
Results. Animals on liquid respiration in perfluorohexane successfully passed the labyrinth in all temperature conditions. The average transit time at 22.0°C was 323±94 s; 27.0°C — 45±12 s; 32.0°C — 147±101 s. Animals on liquid respiration in perfluorodecalin successfully passed the labyrinth at a temperature of 27.0°C; the average passage time is 131±79 s; at a temperature of 32.0°C, 20% of animals successfully passed the labyrinth, the average time is 32.5 s; at a temperature of 22.0°C, none of the animals passed the maze.
Conclusions. Conditioned reflex activity during independent liquid respiration in small laboratory animals in normobaric conditions persists and depends on the physico-chemical properties and temperature of the respiratory fluid.
Ethics. We conducted studies involving laboratory animals in compliance with the necessary regulations (the Helsinki Declaration of 2000 on Humane Treatment of Animals and the "Rules for carrying out work using experimental animals" (Order of the Ministry of Health of the USSR No. 755 of 12.08.1977)). The Ethics Committee of the Izmerov Research Institute of Occupational Health approved the study protocol.
Keywords: liquid respiration; conditioned reflex activity; physiology of behavior; maze for animals; forced swimming; hypothermia
For citation: Tonshin A.A., Bonitenko E.Yu., Kotskiyi M.A., Makarov A.F., Bala A.M., Kovaleva A.S., Rodchenkova P.V,
Lapshinova B.O., Blintcova N.V Assessment of the condition of conditioned reflex activity in the process of liquid respiration.
Med. truda iprom. ekol. 2021; 61(10): 636-646. https://doi.org/10.31089/1026-9428-2021-61-10-636-646
For correspondence: Anton A. Tonshin, Head of the toxicology laboratory, Izmerov Research Institute of Occupational
Health, Cand. of Sci. (Biol.). E-mail: atonshin@yandex.ru
Contribution:
Tonshin A.A., Bonitenko E.Yu., Kotskiyi M.A., Makarov A.F. — the concept and design of the study;
Kovaleva A.S., Makarov A.F. — computed tomography;
Kotskiyi M.A., Makarov A.F. — autopsy;
Rodchenkova P.V., Lapshinova B.O., Blintcova N.V., Kovaleva A.S. — data collection and processing;
Tonshin A.A., Bonitenko E.Yu. — writing the text;
Kotskiyi M.A., Makarov A.F., Bala A.M. — editing.
Funding. The work was carried out with the financial support of the Foundation for Advanced Research. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests. Received: 18.10.2021 / Accepted: 10.11.2021 / Published: 18.11.2021
Introduction. Liquid respiration (LR) — the ability of mammalian lungs to receive oxygen dissolved in liquid for respiration and release carbon dioxide into it.
For the first time, J.A. Kilstra and co-authors conducted experiments on liquid respiration on mice in 1962 [1]. Researchers used isotonic salt buffer solutions saturated with oxygen at a pressure of 7.0 excess atmospheres as a respiratory fluid (RF).
At this pressure, the dissolved oxygen content in water is equivalent to its concentration in the air under normobaric conditions. The authors managed to select such experimental conditions under which the survival time of mice on the RF in hyperbaric reached 18 hours, however, without the possibility of a reverse transition to gas respiration at atmospheric pressure.
Motor activity in animals persisted for the first 6 hours and was manifested by "a reaction to shaking the capsule and tapping on its walls".
After ensuring the transition from liquid respiration (LR) to gas respiration [2, 3], scientists confirmed the hypothesis about the ability of liquid respiration to prevent the development of decompression sickness [4, 5].
Scientists carried out these studies of the possibility of using LR to ensure deep-sea operations until 1985 [6-9]. There were no later publications in the open press.
All published works devoted to the study of the peculiarities of the functioning of individual physiological systems of the body during LR in hyperbaric conditions and scientists carried out experiments on animals in states of fixation, muscle relaxation, or limited space.
Original articles
Thus, modern knowledge about the possibility of conscious activity in LR conditions is limited to the data obtained in the very first published work on LR [1]. However, for the use of LR during deep-sea operations, this technology must ensure the normal functioning of all organs and systems of the body, prevent decompression sickness, and allow conscious activity.
The study aims to assess the safety of conditioned reflex activity during spontaneous LR in small laboratory animals in a normobaric condition.
Materials and methods. We performed the study on mature male Syrian hamsters obtained from LLC "Krolinfo" aged 4 months, weighing 120-140 g. Before starting the study, we kept the animals in quarantine for 14 days and kept them under the requirements of GOST 33215-201411 and GOST 33 215-20 1 422 on a standard water and food ration in a separate room.
The research methodology based on the preliminary development of a conditioned reflex of active avoidance in small laboratory animals, followed by its confirmation under conditions of LR immersion in oxygenated water in a normobaric conditions.
We developed a stand for studying conditioned reflex activity in both gas and liquid environments. The stand consists of an 8-level structure (maze) in a transparent tank — aquarium (Fig. 1). Except for the first one, the levels consist of opaque rectangular perforated (for free penetration of gas and liquid) acrylic plates measuring 225x135 mm with one hole with a diameter of 50 mm for the passage of the animal. We fixed the levels on four metal studs located at the corners. The height of the 1st level was 100, 2-8 — 45 mm. The holes arrange for the passage of the animal in staggered order.
We carried out the holding of the animal at the starting position of the lower level using a remote lock with a button. The retainer was a modified collet clamp for fixing a laboratory animal by the base of the tail. Scientists have performed a study in two stages.
At the first stage, animals developed a conditioned reflex of actively avoiding drowning in conditions of breathing air. Next, we filled the aquarium with water at room temperature (20.0-22.0°C). Next, the researchers immerse the maze entirely in the aquarium, and the upper-level platform is underwater. Next, scientists fixed the animal at the starting position of the lower level, after which the maze smoothly plunges into the aquarium. Finally, we selected a diving speed at which the animal's head was above the water level.
The threat of drowning prompted the animal released
1 GOST 33215-2014 Guidelines for the maintenance and care of laboratory animals. Rules of equipment of premises and organization of procedures.
2 GOST 33216-2014 Guidelines for the maintenance and care of laboratory animals. Rules for the maintenance and care oflaboratory rodents and rabbits.
Fig. 1. General view of the stand. A — stand: 1 — aquarium; 2 — maze plate with perforation; 3 — lock button; 4 — animal lock clip; B — a hamster in a maze on liquid respiration (LR); C — closed lock; D — open latch.
from the retainer to move to a higher level. After the complete passage of the maze, we dried the animal with a hairdryer and placed it in a cage. The researchers trained three times a day for ten days. We assessed the degree of fitness of the animal by the shortest time of passage of the maze, recorded on the 10th day. Scientists formed six experimental groups according to the results of the fitness assessment.
At the second stage, we studied the influence of various LR conditions on the condition of the conditioned reflex activity of animals. The scientists used two respiratory fluids (RF): perfluorohexane (PFH) and perfluorodecalin (PFD). They differ significantly in their physico-chemical properties (Table 1) in three temperature regimes of 22.0, 27.0, and 32.0°C.
At the same time, the saturation of O2, both respiratory liquids were the same and amounted to ~90.0 vol%. We presented immediate conditions ofthe LR for all experimental groups in Table 2.
When evaluating conditioned reflex activity in LR conditions, we filled the aquarium with oxygenated water of the required temperature instead of water.
Researchers carried out the oxygenation of RF by bubbling using a Nidek Mark 5 Nuvo Lite concentrator (USA) for an hour with an oxygen consumption of three-liter/min.
The oxygen concentration in RF we determined using the oxygen meter Aktakom ATT-3010 (Russia) with the function of a thermometer.
Researchers measured a rectal temperature in animals before testing. During the study, a maze with a fixed animal we wholly immersed in an aquarium.
Оригинальные статьи
Table 1
Basic physico-chemical properties of respiratory liquid
(RL)
Indicators Perfluorohexane Perfluorodecalin
CAS 355-42-0 306-94-5
Gross formula C6F14 C10F18
Manufacturer LLL "PKF SpetcNefteproduct" JSC "HaloPolimer"
Content of the main substance, % 99,9 >95
Kinematic viscosity at 25.0°C, mm2/s 0.38 2.9
Density at 25.0°C, g/cm3 1.67 1.95
Melting point, °C -82.25 -10.0
Boiling point, °C 56.6 142
Oxygen solubility at 25.0°C, ml of gas/100 ml of liquid 62 51
Solubility of carbon dioxide at 25.0°C, ml of gas/100 ml of liquid 241 232
After switching to the LR, as evidenced by deep breathing movements, visually determined by trickles of liquid with a refractive index change due to heating in the lungs coming out of the nose and mouth, we removed the animal from fixation (30 seconds after immersion in RF). The moment of removal from focus was the beginning of the countdown of the passage of the maze.
When stopped for more than 10 seconds, researchers stimulated the animal by touching a steel stud through the perforations of the plates. If the animal did not respond to stimulation, scientists considered that the animal failed, and they stopped the experiment.
A group of researchers assessed the condition of conditioned reflex activity by the number of animals in the group who successfully passed the maze and the average time of its passage. After completion of testing, we repeatedly measured rectal temperature in animals.
In the case of the animals' non-fulfillment of the experimental program, we conducted an additional study to determine the reasons that led to such a result. Considering the fact that with an independent liquid respiration (LR), lung damage may develop, we euthanized the animals after removing them from the stand and carried out computed tomography and pathoanatomic examination.
Researchers carried out the study on a Hi-Speed CT/e spiral computed tomograph of General Electric (USA) in compliance with the norms, rules, and hygienic standards in the field of radiation safety (according to SanPiN 2.6.1.119203). We conducted scanning in a spiral mode with a slice thickness of 2 mm and a Pitch of 1.8 in the pulmonary and soft-tissue methods. We evaluated the structure of the organs of the thoracic cavity of animals and the filling of the lungs of animals respiratory fluid (RF) by obtaining cross-sectional X-ray images with the construction of multiplanar
Table 2
Division of animals into groups depending on the conditions of liquid respiration during testing
Animal group No. Respiratory fluid Characteristics of respiratory fluid
О2 saturation, vol% Temperature, °С
22.0 27.0 32.0
I. Perfluorohexane 90 + - -
II. - + -
III. - - +
IV. Perfluorodecalin + - -
V. - + -
VI. - +
reconstructions using the Maxaon postprocessing image processing program.
Researchers observed the tested animals for seven days after the LR and assessed the animals' overall condition in dynamics and survival.
The Ethics Committee of Izmerov Research Institute of Occupational Health approved the protocol of the study.
We have performed statistical processing of the results using the Statistica 6.0 software package for Windows. Researchers carried out the calculation of the average values of the recorded indicators by generally accepted statistical methods. Scientists used a normal distribution of indicators in experimental groups and equality of variances parametric statistics methods (comparing hands using the Student's t-test for related and unrelated samples). To compare the average values and establish the statistical significance of the differences with the control in the absence of signs of normal distribution, we performed statistical processing using nonparametric tests (Wilcoxon for related and MannWhitney for unrelated samples).
Results. According to the results of the first stage, we trained the animals by developing a conditioned reflex of active avoidance of drowning in conditions of breathing air. Researchers formed experimental groups. We represent the average time of passage of the maze by animals in groups in figure 2.
During the second stage of the study, we found that in the groups breathing PFH, all animals successfully passed the maze regardless of the temperature RF (Table 3). However, when living PFD, the best result we obtained in the fifth group at a temperature of RF 27.0°C, in which 100% of the animals passed the test. In turn, 20% of animals
815-
s
I II III IV V VI
number of group
Fig. 2. The average time of passage of the maze by animals in groups.
Maze trial pass time results for each group of animals at liquid respiration
Original articles Table 3
Animal group No. Number of animals that have passed the maze Average time of passage of the maze, sec. Температура ректальная, °С Body temperature difference before and after testing, °C
before testing after testing
I. 10 323±94 32,9±0,2 25.8±1,0 7.1
II. 10 45±12* 29.0±0,2 3.9
III. 10 147±101 32.1±0,2 0.8
IV. 0 — — —
V. 10# 131±79 27.7±0,5 5.2
VI. 2 38 32.5 0.4
Note: * — the difference with group I is significant (p<0.05); # —
passed the test in group VI, and in IV, this indicator was equal to 0. When the animals failed to pass the maze, they first stopped, but when stimulated, they continued to move.
However, after a series of stimulations, the animals refused to continue performing the test. At the same time, they continued to respond to stimulus, trying to dodge the touch of the hairpin. Thus, there were no cases of respiratory arrest during the experiment.
In the groups in which the LR we conducted using PFH, the shortest passage time of the maze was at a temperature of RF 27.0°C (group II).
It was 7.18 and 3.27 times less than in groups I and III, respectively. When using PFD, the shortest time was in group VI with a temperature of 32.0°C, which was 3.45 times less than in group V.
In all groups, we watched a significant increase in the passage time of the last levels of the maze compared with the first. In group III, with a PFH temperature of 32.0°C, the animals either passed the maze quickly or slowly. In turn, in group VI, animals with a PFD temperature of 32.0°C animals either passed the maze soon or did not pass it at all.
In all groups, after passing the maze, we observed a decrease in rectal body temperature, and the degree of reduction was proportional to the body temperature and the duration of testing.
When studying computed tomograms of the chest, the researchers found that the lung parenchyma was almost filled with respiratory fluid in all animals that failed the test (Figure 3).
During a macroscopic examination of the lungs in all animals that did not pass the test, the lungs were full-blooded; we observed venous stagnation and isolated areas of preservation of airiness. There are no cases of perfluorocarbonothorax.
When assessing the outcomes of the LR, we found that when using PFH, the death of laboratory animals
A B
Fig. 3. Animal lungs computed tomography scan (A — normal reference; B — after liquid respiration).
the difference with group II is significant (p<0.05).
was 60-70%. While no adverse effects in the PFD groups (Table 4).
Researchers recorded the death of animals after the LR PFG either early (during the first hour after testing) or late (at the end of the first — beginning of the second day).
There were no significant differences in the structure of adverse outcomes depending on the temperature regime of the LR PFH.
The death of animals, both in the early and late periods after the LR, was due to one reason — the development of acute respiratory and cardiovascular insufficiency.
We observed the phenomena of acute respiratory failure in animals that died in the early stages after switching to gas respiration, rapidly progressed causing an unfavorable outcome within the first hour after the LR. At a late date, death developed against the background of rapidly progressive respiratory failure that occurred after a long latent period at the end of the first — beginning of the second day after the LR.
Discussion. In order to carry out this study, it was necessary to create equipment that allows the study of conditioned reflex activity on small laboratory animals with independent liquid respiration in conditions of immersion of respiratory fluid, and the choice of the conditioned reflex itself. However, based on the analysis of existing approaches to the assessment of conditioned reflex activity, the conditioned reflex of active avoidance we have chosen for this study [10]. To do this, in a gaseous environment, we have developed a conditioned reflex of active avoidance of drowning, which, when drowning in respiratory fluid, encourages animals to pass a maze to complete the test (to eliminate the threat).
Table 4
Survival rates of animals after liquid respiration (M±m)
Animal Number of dead animals Total number of dead animals Average time of death
group No. on the 1st day after the 1st day on the 1st day, minutes after the 1st day, hours
I. 4 3 7 51±10 22±2
II. 3 4 7 47±8 26±3
III. 4 2 6 49±12 23±3
IV. 0 0 0 0 0
V. 0 0 0 0 0
VI. 0 0 0 0 0
Оригинальные статьи
The analysis of the obtained results indicates that the physicochemical properties of the selected RF had a significant impact on the test results.
Considering the latter, the use of PFH was preferable to PFD since, on the one hand, it has a lower viscosity (7.63 times) and density (1.17 times), and on the other, more excellent solubility for oxygen and carbon dioxide. Based on these differences, we assumed that the reason for the better test results in the groups receiving PFH is both a decrease in energy consumption for the LR process itself and a more optimal gas exchange in the lungs, which leads to less pronounced hypoxia.
There is a significant influence of the temperature of the respiratory fluid (RF) on the process of independent liquid respiration (LR) during immersion in the work of J.A. Kylstra and co-authors (1962) [1]. Thus, in the temperature range of 6.0-41.0°C, the survival time of mice in LR conditions varied from 11 to 247 minutes. At the same time, we observe the maximum survival duration at a respiratory fluid temperature of 20°C. A temperature deviation of 1.0-2.0°C leads to a decrease in the latter by 2-3 times. The maximum duration of survival we observed at a temperature of 20.0°C, and a temperature deviation of 1.0-2.0°C led to a decrease in the latter by 2-3 times. We can explain that hypothermia leads to a slowdown in metabolic processes in the body. At a temperature of 20 degrees, there is a speed at which energy consumption is at a minimum level sufficient to maintain life at rest.
In the study, the best testing time we recorded in group II when breathing PFH at a temperature of 27.0°C. An increase in the optimal temperature of RF by 7.0 °C compared to the results obtained by J.A. Kylstra and co-authors (1962) [1] is due to different experimental conditions and registered indicators. The metabolic rate at a temperature of 20.0°C was sufficient for long-term maintenance of life at rest but not optimal for performing heavy physical work. This assumption supported the fact that in the study at 22.0°C, the animals became sluggish and refused to move around the maze while
they continued to breathe liquid. In turn, at a temperature of RF 32.0°C, the metabolic rate, on the contrary, turned out to be too high. At the same time, the LR process itself turned out to be the most important, as the key to ensuring vital activity. We use the remaining energy for motor activity. However, this did not apply to animals that quickly passed through the maze, as it was in group VI.
As can be seen from the presented data, we do not link the refusal to pass the test either with an incomplete filling of the lungs by RF or with the development of hydrothorax (perfluorocarbonthorax) in animals.
In turn, the death of animals both in early and late periods during the respiration of PFH associated with the peculiarities of the physicochemical properties of the latter.
Conclusions:
1. The researchers used the developed experimental stand to study the effect of various types of respiratory fluid on the condition of the conditioned reflex activity of small laboratory animals, including in combination with various physical factors.
2. The proposed approach of developing a conditioned reflex of active avoidance in a gaseous environment with subsequent testing in immersion in RF you can use to assess the state of conditioned reflex activity in small laboratory animals with independent LR.
3. Conditioned reflex activity during spontaneous LR in small laboratory animals in normobaric conditions persists.
4. Its physico-chemical properties, as well as the temperature of the latter, have a significant impact on the state of conditioned reflex activity during independent liquid respiration (LR) in immersion in the respiratory fluid (RF).
5. The survival rate of animals after LR directly depends on the physicochemical properties of RF. So, if PFD does not cause severe respiratory failure in Syrian hamsters, leading to adverse outcomes after the LR, then the use of PFH leads to the death of animals in 66.7% of cases. The death of animals when using PFH can occur both in the early stages during the first hour after the LR and in the late at the end of the first or beginning of the second day (after the latent period).
References
1. Kylstra J.A., Tissing M.O. van der Maen. Of mice as fish. Trans Am Soc Artif Intern Organs. 1962; 8: 378-83. https://doi. org/10.1097/00002480-196204000-00077
2. Kylstra J.A. Breathing of pressure oxygenated salt solutions. Dis Chest. 1965; 47: 157-9. https://doi.org/10.1378/ chest.47.2.157
3. Clark Jr. L.C., Gollan F. Survival of mammals breathing organic liquids equilibrated with oxygen at atmospheric pressure. Science. 1966; 152(3730): 1755-6. https://doi.org/10.1126/ science.152.3730.1755
4. Gollan F., ClarkJr. L.C. Rapid decompression of mice breathing fluorocarbon liquid at 500 PSI. Ala J Med Sci. 1967; 4(3): 3367.
5. Kylstra J.A., Nantz R., Crowe J., Wagner W., Saltzman H.A. Hydraulic compression of mice to 166 atmospheres. Science. 1967; 158(3802): 793-4. https://doi.org/10.1126/ science.158.3802.793
6. Lundgren C.E., Ornhagen H.C. Heart rate and respiratory
frequency in hydrostatically compressed, liquid-breathing mice. Undersea Biomed Res. 1976; 3(4): 303-20.
7. Lynch P.R., Wilson J.S., Shaffer T.H., Cohen N. Decompression incidence in air- and liquid-breathing hamsters. Undersea Biomed Res. 1983; 10(1): 1-10.
8. Harris D.J., Coggin R.R., Roby J., Feezor M., Turner G., Bennett P.B. Liquid ventilation in dogs: an apparatus for normobaric and hyperbaric studies. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1983; 54(4): 1141-8. https://doi.org/10.1152/ jappl.1983.54.4.1141
9. Harris D.J., Coggin R.R., Roby J., Turner G., Bennett P.B. EEG and evoked potential changes during gas- and liquid-breathing dives to 1000 msw. Undersea Biomed Res. 1985; 12(1): 1-24.
10. Dubravina N.I., Savostyanova D.A. Effects of forced swimming and behavioral strategies on the resistance of the memory trail to amnestic influences. Byulleten SO ^MN. 2002; 9(103): 115-20.
