CC BY
40
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-1-227-232
УДК - 615.072
ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ СУММЫ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В КРЕМЕ
«ГИПОКРЕМ 0,5%»
Джавахян1,2 МА., Куляк1,2 О.Ю., Мизина1 П.Г.
1ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, г. Москва,
Российская Федерация
2ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Развитие фармацевтической отрасли преимущественно связано с расширением перечня препаратов, выпускаемых на территории нашей страны, с улучшением их качества и методов контроля. Объектом нашего исследования стал сухой экстракт облепихи крушиновидной - гипорамин, входящий в состав крема «Гипокрем® 0,5%», обладающего противовирусной активностью. Биологически активные вещества, содержащиеся в экстракте, а именно танины (казуаринин, стриктинин, изостриктинин, казуариктин, гипофенин В), флаваноиды, каротинойды, токоферолы, органические и жирные кислоты обладают широким и разнообразным спектром действия, проявляя антиоксидантную, гепатопротекторную, противовоспалительную и противовирусную активность. В статье описана методика количественного определения суммы таннинов в пересчете на казуаринин в составе крема «Гипокрем® 0,5%». Исследование хроматографических свойств действующих веществ в экстракте листьев облепихи и препаратах на его основе представляет определённый научный и практический интерес, что связано как с проблемой более точного и достоверного определения действующих веществ, а также с перспективой и возможностью стандартизации препаратов на основе данной субстанции. Таким образом, целью данной работы являлась разработка и валидация методики количественного определения суммарного содержания соединений танинового ряда, в пересчете на ка-зуаринин.
Ключевые слова: ВЭЖХ, гипорамин, казуаринин, УФ.
Введение. Одним из главных направлений развития фармацевтической отрасли является внедрение и расширение ассортимента лекарственных средств препаратами на основе лекарственного растительного сырья [2]. Преимущества использования препаратов растительного происхождения неоспоримы и к ним относятся: мягкое терапевтическое действие, высокая эффективность, при этом минимизация побочных эффектов и противопоказаний. Все это демонстрирует необходимость разработки новых лекарственных препаратов и методов их контроля качества [1].
Одним из таких препаратов является сухой экстракт листьев облепихи крушиновидной (гипорамин). Биологически активные вещества, содержащиеся в данном растении, обладают антиоксидантным [7], ге-патопротекторном [6], противовоспалительным и противовирусным действием в отношении вирусов гриппа А и В, парамиксовируса, аденовируса, герпесвируса др., преимущественно это гидролизуемые таннины, содержание суммы которых регламентировано не менее 60%, а также метиловый эфир инозита-квебрахит (около 15 %), флавоноидов (не более 20%), неоргани-
ческие соли макро- и микроэлементов, общими структурными элементами которых являются глюкоза, гал-лоильный и гексагидроксидифеноильный остатки [3,5].
Исследование хроматографических свойств действующих веществ в экстракте листьев облепихи и препаратах на его основе представляет определённый научный и практический интерес, что связано как с проблемой более точного и достоверного определения действующих веществ, а также с перспективой и возможностью стандартизации препаратов на основе данной субстанции. Таким образом, целью данной работы являлась разработка методики количественного определения суммарного содержания соединений танинового ряда, в пересчете на казуаринин.
Материалы и методы. Анализ проводили методом обращено-фазовой ВЭЖХ с УФ детектированием.
Все приборы и средства измерения, используемые в ходе данного эксперимента, зарегистрированы в Государственном реестре средств измерений и имели действительные свидетельства о поверке.
Объект исследования. Сухой экстракт облепихи крушиновидной - гипорамин (биологически активными компонентами являются гидролизуемые танины: казуаринин, стриктинин, изостриктинин, казуариктин, гипофенин В).
Гипокрем 0,5% (состав препарата: гипорамин, воск эмульсионный, масло вазелиновое, глицерин, кислота сорбиновая, вода очищенная).
Таблица 1
Условия хроматографического анализа
Колонка Диасфер-110-С8 250x4,0 мм
Температура колонки 200 С
Подвижная фаза ацетонитрил/вода (pH=2, ТФУ)
Градиент От 5 до 38 % ацетонитрила
Скорость потока 1,0 мл/мин
Объем вводимой пробы 10 мкл
Детектирование УФ 275 нм
Время анализа 40 минут
Точную навеску сухого экстракта облепихи крушиновидной (0,1 мг/мл) растворяли в 20% растворе метанола, подкисленного раствором трифторуксусной кислоты до рН 2,5. Полученный раствор фильтровали через стеклянный фильтр с размером микропор 45мкм для последующего ВЭЖХ-УФ анализа.
Для количественной оценки содержание суммы таннинов в креме. Точную навеску крема 250 мг помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 20 мл 20% метанола (рН=2, ТФУ) и доводили до метки
тем же растворителем. Полученный образец тщательно перемешивали и фильтровали через стеклянный фильтр с диаметром пор 45 мкм для дальнейшего ВЭЖХ анализа.
Результаты. Наличие гидроксильных радикалов в структурных формулах гидролизуемых танинов свидетельствует о полярности молекул и о возможности их хроматографического разделения. На рисунке 1 представлена структурная формула биологически активного вещества, входящего в состав гипорамина - казу-аринин.
Рис. 1. Структурная формула гидролизуемого танина, входящего в состав гипорамина - казуаринин.
Для определения качественного состава проводили идентификацию действующих веществ по различным временам удерживания каждого из компонентов. Для оценки количественного содержания веществ использовали метод абсолютной калибровки. На наш взгляд использование данного метода является наиболее предпочтительным и дает возможность получать достоверные результаты.
На рисунке 2 приведены спектры хроматографиче-ских пиков основных компонентов субстанции. В первую группу вошли соединения флавоноидной природы, вторую группу составляют таннины. Полученная информация использовали для идентификации компонентов субстанции.
-
210 230 250 270 290 310 330
длиаа волны, нм
Рис. 2. УФ спектр основных компонентов субстанции гипорамина. 1-спектр флавоноидов, 2-спектр танинов.
Для подбора длин волн детектирования использовали спектры поглощения субстанции гипорамина с концентрацией 0,1 мг/мл (рис. 3).
2-,
1.5-
0.5-
250
300
длина волны, нм
Рис. 3. УФ спектр субстанции гипорамина. 1-в 20% метаноле, 2-в ацетонитриле.
Полученные спектры субстанции гипорамина в метаноле и ацетонитриле практически совпадают и имеют нечётко выраженный максимум поглощения в области 220 нм с плато и небольшим наклоном в области 260-280 нм, что связано, с присутствием в данном образце соединений с максимумом поглощения в области 255 нм - флавоноиды. Более выраженные макси-
мумы соответствуют раствору субстанции в 20% метаноле, который и был выбран в качестве растворителя для дальнейшего анализа.
Дополнительно изучали УФ спектр стандартного образца казуаринина 0,1мг/мл (рис 4). Полученный спектр имеет максимум поглощения в области 276±1 нм. Отсутствие поглощающих примесей позволяет выбрать длину волны 275 нм для дальнейшего исследования.
200 220 240 200 200 300 >0 34Е
длина волны, нм Рис. 4. УФ спектр казуаринина.
Для подбора условий хроматографирования исследуемый образец казуаринина 0,1мг/мл подвергали хро-матографическому анализу (рис. 5). Представленная
^Jv.
хроматограмма получена в системе ацетонитрил: вода при линейном градиенте ацетонитрила 5-18%.
время, мнк
Рис. 5. Хроматограмма стандартного образца казуаринина.
Для определения содержания суммы таннинов в креме «Гипокрем-0,5%» использовали методику ВЭЖХ анализа с УФ детектором (рис.6-2), используя градиентный способ элюирования. Данный способ позволяет установить подлинность препарата по содержания суммы таннинов в пересчете на казуаринин. Для оценки влияния сопутствующих компонентов
крема, проводили ВЭЖХ-УФ анализ холостого образца, в состав которого входили все компоненты крема, за исключением действующего вещества гипо-рамина (рис. 6-1). На основании полученных результатов установлено, что присутствующие вспомогательные компоненты не мешают определению суммы танинов (время выхода 11-17 мин) в креме «Гипокрем-0,5%».
315 -
310 ^
305
"S 300 ^ 295 -
2К5 J !
»ft
тетттщтйШ 6 8 10 12
14
щж 16
ядел is
шпркр
20 22 24 время, мин
Рис. 6. Хроматограмма холостого образца крема (1) и хроматограмма крема «Гипокрем-0,5%» (2).
Для количественного определения суммы таннинов был применён метод абсолютной градуировки по казу-аринину (рис. 7). Установлено, что аналитическая область методики, в диапазоне концентраций 50-400
мг/мл входит в пределы линейной зависимости и имеет коэффициент корреляции 0,99991, со среднеквадратичным отклонением 4,62%.
I зоооа
I
i 20000.
я
и
M
R
(Ч
I .....
о о,1 0,2 о,з
Рис. 7. Калибровочный график определения содержания казуаринина в диапазоне концентраций 50-400 мг/мл.
0,4
время, мин
Достоверность предлагаемой методики определения суммы таннинов проверялась опытами с «добавками» компонентов стандартных образцов. Экспериментальные данные представлены в таблице 2.
Таблица 2
Определение суммы таннинов с помощью метода добавок образца сухого экстракта гипорамина.
Содержание компонента, мг Добавлено компонента, мг Полученное содержание, мг Фактически обнаружено, мг Относительная ошибка, %
0,300 0,050 0,350 0,356 +1,6
0,100 0,400 0,393 -1,7
0, 150 0,450 0,443 -1,5
На основании результатов определения суммы та- Для количественной оценки содержания суммы танинов методом добавок установлено, что полученные нинов в креме «Гипокрем 0,5%» использовали 3 об-значения находится в пределах случайной ошибки и разца крема (табл.3). свидетельствуют о достоверности результатов, полученных с помощью разработанной методики.
Таблица 3
Результаты количественного определения суммы таннинов в креме «Гипокрем 0,5%», Б=0,95%.
Действующие Количество ДВ Полученное значение Полученное % содержа-
вещества (ДВ) в г/100г крема ДВ в г/100г крема ние ДВ vs норма
Казуаринин 0,1020 0,1066 104,5
0,1046 102,5
0,1054 103,3
Сумма танинов 0,3200 0,3139 98,12
0,3200 100,0
0,3131 97,85
Из таблицы 1 следует, что с помощью ВЭЖХ можно определять количественное содержание казуаринина и сумму таннинов в модельной смеси препарата с относительной погрешностью определения не более 5,0% при доверительной вероятности 95%.
Выводы. Разработана ВЭЖХ методика с УФ детектированием для количественного определения суммы танинов в пересчете на казуаринин в препарате «Гипокрем 0,5%».
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Богоявленский А.П., Алексюк П.Г., Турмагамбетова А.С., Березин В.Э. Актуальные проблемы стандартизации фитопрепаратов и растительного сырья для их производства // Фундаментальные исследования. -2013. - № 6-5. - С. 1184-1187;
[2] Богоявленский А.П., Турмагамбетова А.С., Березин В.Э. Противовирусные препараты растительного происхождения // Фундаментальные исследования. -2013. - № 6-5. - С. 1141-1145;
[3] Гуленкова, Г. С. Особенности биохимического состава плодов облепихи // Вестник КрасГАУ -2013. -№11. - С. 262-265;
[4] ГФ XIII, Министерство здравоохранения Российской Федерации, 01.01.2016г;
[5] Зенькова М.Л., Тимофеева В.Н., Акулич А.В. Сравнительная оценка химического состава и технологических свойств сортов облепихи // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2007. - №8. - С. 24-26;
[6] Чукаев С.А., Николаев С.М., Роднаева О.А., Нагасла-ева Л.А. Гепатопротекторное действие сухого экстракта листьев облепихи крушиновидной // Сибирский медицинский журнал. - 2005.- №1. - С. 61-64;
[7] Чукаев С.А., Роднаева О.А. Оценка спектра антиокси-дантной активности гипорамина in vitro // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009.- №2 (66). - С. 140-142.
THE ASSESSMENT OF THE SUM OF TANNINS IN "HYPOCREAM 0.5%"
Dzhavakhyan1,2M.A., Kulyak1,2 O.Yu., Mizina1 P.G.
1Federal state budgetary research institution All-Russian research Institute of medicinal and aromatic plants, Moscow,
Russian Federation 2Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
Annotation. The development of the pharmaceutical industry is mainly associated with the expanding of the nomenclature of drugs manufactured in our country, with the improvement of their quality and methods of control. Dry extract of Hippophae rhamnoides , -giporamin which is part of the cream "Hypocrem® 0.5%", which has antiviral activity. There are biologically active substances in the extract, exactly tannins (casuarinin, strictinin, isostrictinin, casuarictin, hypofenin B), flavanoids, carotinides, tocopherols, organic and fatty acids. They have an extensive and different spectrum of action: antioxidant, hepatoprotective, anti-inflammatory and antiviral activity. The article describes the method quantitative determination of the sum of tannins in conversion of casuarinin in the cream of "Hypocrem® 0.5%". The study of the chromatographic properties of the active substances in the extract of Hippophae rhamnoides and preparations based on it is of a some scientific and practical interest, this is due to the need for an accurate and reliable determination of the active substances, as well as the prospect and the possibility of standardizing preparations that have this substance. Thus, the purpose of this work was the development and validation of a method for quantifying the sum of tannin compounds, in conversion of casuarinine.
Key words: HPLC, hyporamine, casuarinin, UV.
REFERENCES
[1] Bogoyavlenskiy A.P., Alekxyuk P.G., Turmagambetova A.S., Berezin V.E. Current problems of standardization of phytopreparations and plant materials for their production // The fundamental researches. - 2013. - № 6-5. - p. 11841187;
[2] Bogoyavlenskiy A.P., Turmagambetova A.S., Berezin V.E. Antiviral preperations of plant origin // The fundamental researches - 2013. - №6-5. - p. 1141-1145;
[3] Gulenkova, G. S. Tha biochemical composition peculiarities of the sea-buckthorn berries // Vestnik KrasGAU -2013. -№11. - p. 262-265;
[4] GF XIII (2015);
[5] Zen'kova M.L., Timofeeva V.N., Akulich A.V. Comparative estimation of chemical contents and technological properties of high-quality sea-buckthorn berries of Belarus // Hranenie i pererabotka selhozsyirya. - 2007. - №8. - p. 24-26;
[6] Chukaev S.A., Nicolaev S.M., Rodnaeva O.A., Nagaslaeva L.A. Hepatoprotective activity of dry extract of hippophae rhamnoides L. // Sibirskiy meditsinskiy zhurnal. - 2005.-№1. - p. 61-64;
[7] Chukaev S.A., Rodnaeva O.A. The estimation of antioxidant activity's spectrum of hiporamine in vitro // Byulleten VSNTs SO RAMN. - 2009.- №2 (66). - p. 140142.
