CC BY
64
УДК 547.783
ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛИЧЕСТВНОЕННОГО СОСТАВА АЛЛАНТОИНА В КОРЕ МОЛОДЫХ И ПРОШЛОГОДНИХ ПОБЕГОВ ОБЛЕПИХИ ВИДА HIPPOPHAE RHAMNOIDES L. СОРТОВ LEIKORA И HERGO
С.А. Воронцов, студент гр. 15-ПБ /б, механико-технологический факультет, ФГБОУ ВО «Калининградский государственный технический университет», е-mail: [email protected] О.Я. Мезенова, д.т.н., профессор, зав. кафедрой пищевой биотехнологии ФГБОУ ВО «Калининградский государственный технический университет», е-mail: [email protected]; Й.-Т. Мёрзель, д.е.н., профессор, Берлинский технический университет (TU Berlin), е-mail: [email protected]
результаты исследования биопотенциала облепихи крушиновидной Hippophae rhamnoides L. и количественного содержания аллантоина в коре молодых (2018) и прошлогодних (2017) побегов облепихи крушиновидной Hippophae rhamnoides L. на примере сортов Лейкора (Leicora) и Херго (Hergo), произрастающих на территории Германии. В работе модифицирована методика определения аллантоина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с предварительной водно-спиртовой экстракцией. Результаты показывают, что кора и молодые стебли облепихи могут быть использованы для дальнейшей вторичной переработки с целью получения аллантоина в виде готового продукта, применяемого в медицине и косметологии. Установлены рациональные значения pH и соотношения воды и спирта в растворе для экстракции аллантоина из сырья. Показано, что сорт облепихи Херго содержит большее количество аллантоина, чем сорт Лейкора. Актуально его выделение по обоснованным параметрам и использование в биотехнологии, косметической и медицинской промышленности.
аллантоин, облепиха, Hippophae rhamnoides L, кора, молодые побеги, ВЭЖХ
ВВЕДЕНИЕ
Облепиха является источником ценного сырья для получения концентратов поливитаминов и важных лечебных препаратов в связи с присутствием в ее плодах, листьях и корнях ценных биологически активных веществ (БАВ): легкоусвояемых сахаров, органических кислот, каротина, витаминов (С, Р, В1, В2, В9), дубильных и красящих веществ, минеральных солей [1].
В мякоти, кожуре и косточках плодов облепихи содержатся липиды, которые успешно используются в лечебной практике. Известно, что в листьях и коре облепихи содержится редкое биологически активное вещество - аллантоин, являющееся продуктом окисления мочевой кислоты [2]. Аллантоин применяется в биотехнологии и медицине, как специализированная добавка к БАДам и лекарственным препаратам, а также он один из основных компонентов в производстве косметических кремов [2].
Одним из важнейших направлений развития человечества на сегодняшний день является здравоохранение, направленное на повышение качества жизни человека. Вследствие этого за последние 20 лет активно разрабатываются и внедряются новые лекарственные препараты, получаемые синтетическим путем, которые в большинстве случаев проявляют строго определённую активность [3].
Поскольку организм человека представляет собой сложную саморегулирующуюся систему, то лечение монолекарствами оказывает воздействие не только на больные, но и на здоровые органы, что приводит к подавлению и снижению общих защитных свойств ор-
ганизма [3]. Из-за этого иммунитет человека падает, а опасные бактерии и вирусы, находящиеся под постоянным действием лекарств, мутируют и вырабатывают иммунитет, в результате чего лекарства перестают оказывать должное влияние.
Данные факторы объясняет возросший интерес к лекарственным препаратам из растений. Одним из таких растений является облепиха, прежде всего, ее плоды, которые известны в качестве противоцинготного, отхаркивающего, болеутоляющего, противоожогового средства, традиционно применялись при ревматизме, заболеваниях желудка и язвенной болезни [1].
Между тем листья облепихи изучены не достаточно хорошо. Известно, что в листьях и коре облепихи содержатся дубильные вещества, небольшое количество нейромедиатора серотонина, а также аллантоина, обладающего анестетическими, вяжущими и противовоспалительными свойствами.
В связи актуальностью проблемы целью настоящего исследования являлось изучение количественного состава аллантоина в коре молодых (2018) и прошлогодних (2017) побегов облепихи вида Hippophae rhamnoides L. сортов Лейкора (Leikora), произрастающего в своей основной массе на побережьях Германии вдоль Балтийского моря, и Херго (Hergo), распространенного по всей территории Германии.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить биопотенциал облепихи вида Hippophae rhamnoides L.
2. Исследовать кору молодых и прошлогодних побегов зелёных веточек облепихи на содержание растительного аллантоина.
3. Установить рациональные значения pH и соотношения воды и этилового спирта в экстракционном растворе при выделении аллантоина из сырья.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования по извлечению аллантоина из старых (коричневых) и молодых (зелёных) веточек облепихи проводились в экспериментальной биохимической лаборатории Научно-консультационного исследовательского центра UBF - Untersuchungs-, Beratungs, Forschungs-Laboratorium GmbH (Германия, г. Берлин). Испытания проводили в 2018 г. с конца мая до середины августа.
В исследовании использовались молодые и прошлогодние побеги облепихи крушино-видной Hippophae rhamnoides L. и её кора двух различных сортов. Сорт Лейкора (Leicora) произрастает в своей основной массе на побережьях Германии вдоль Балтийского моря, сорт Херго (Hergo) наиболее распространен на всей территории Германии.
Первоначально был изучен и определен наиболее рациональный метод экстракции аллантоина из коры молодых побегов облепихи. Экстракты анализировались на содержание аллантоина методом ВЭЖХ на высокопроизводительном жидкостном хроматографе с установленными на нём помпой LC10AD фирмы «SHIMADZU», детектором диодной матрицы SPD-M10A «SHIMADZU», системным контроллером SCL-10A фирмы «SHIMADZU», авто-семплером серии 1050 от фирмы «Hewlett Packard», дегазатором с моделью D6-1210 фирмы «Uniflows» [4].
Первоначально кору от побегов прошлогодних и молодых веточек облепихи отделяли и измельчали с помощью кофемолки со скоростью вращения рабочих органов 500-700 об/мин. После высушивания облепиховую смесь взвешивали на аналитических весах с массой навески 2 г (± 0,0005 г), ссыпали в мерные колбы объёмом 25 мл и доводили до метки водным раствором с различным рН.
Для экстракции использовали два раствора с pH 7 (процентное соотношение воды и этанола 100:0, 75:25 и 50:50) и pH 5 (процентное соотношение воды и 0,1 н раствора ацетата аммония 100:0, 75:25 и 50:50).
После соединения облепиховой массы и экстрагируемого раствора их тщательно перемешивали с помощью УЗ-бани серии RK100H «SONOREX» при температуре (20...25°С) на 15 мин.
По завершении экстракции полученные взвеси фильтровали через бумажный фильтр, после чего раствор переносили в специальные колбы объёмом 2 мл для последующего анализа методом ВЭЖХ.
Предварительно необходимо было подготовить раствор подвижной фазы хроматографа и стандартные растворы аллантоина, которые необходимы для корректной работы ВЭЖХ.
При подготовке подвижной фазы смешивали дистиллированную воду, метанол и аце-тонитрил в соотношении 50:30:20, смесь помещали в УЗ-баню при комнатной температуре (22°с) на 15 мин.
Время обработки каждой пробы с аллантоином в хроматографе заняло более 30 мин для каждого из образцов [5]. Таким образом, на анализ всех экспериментальных проб, включая стандартные растворы и время смены подвижной фазы, понадобилось более суток реального времени.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В табл. 1 представлены полученные данные по анализу образцов облепихи, экстрагированных водным раствором с кислотностью рН7.
Таблица 1 - Количественные данные по содержанию аллантоина в водно-спиртовых экстрактах из коры облепихи сортов Лейкора (Ьекога) и Херго (Не^о), экстрагированных при рН=7_
рН7
Ьекога Негцо
время сбора процентное соотношение вода:этанол С* [мг/10мл] X* * время сбора процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] X
Июль 100:0 59,38 34658979,5 Июль 100:0 40,84 24146494,5
75:25 87,51 50601544,5 75:25 57,40 33534184
50:50 41,94 24770405 50:50 37,48 22244262,5
Август 100:0 40,84 24146494,5 Август 100:0 16,81 10531125
75:25 57,40 33534184 75:25 19,04 11792118
50:50 37,48 22244262,5 50:50 12,78 8244722,5
Примечание: С* - концентрация аллантоина в растворе при экстракции из облепихи за июль - август 2017 г. при рН=7. X** - среднее арифметическое высоты пиков ВЭЖХ растворов экстракции аллантоина.
Из данных табл. 1 можно сделать вывод, что растворы экстракции из коры облепихи вида Hippophae rhamnoides L. сорта Лейкора (Ьекога) содержат в себе большее количество аллантоина, чем экстракты из коры облепихи сорта Херго (Не^о). Наибольшее количество аллантоина экстрагируется спиртовым раствором при соотношении вода: этанол, как 75:25%, далее по убыванию - растворами с соотношением воды и этанола 100:0 и 50:50% соответственно.
После получения результата был проведён анализ данных о содержании аллантоина в экстрактах коры облепихи и количественного состава аллантоина в экспериментальных навесках облепихи. Для этого было необходимо высчитать концентрацию аллантоина в образце (мг/10 мл), которую рассчитывали на основе уравнения линейной регрессии стандартной кривой площади пика поглощения (РА) при длине волны 210 нм.
Далее производили перерасчёт навески экспериментальной пробы из 25 мл на 10 мл:
2 г/25 мл = 0,08 г/мл, (1)
0,08 г/мл* 1000 = 80 мг/мл, (2)
80 мг/млх10 = 800 мг/10 мл. (3)
Для получения информации о содержании аллантоина в экспериментальных пробах необходимо было найти среднее арифметическое значение значений С и, основываясь на полученных данных, установить количество аллантоина в исследуемой навеске.
Х(рН7)= Е(АрН7 +ВрН7 +СрН7 +...)/ N х(рН5)= £(АрН5+ВрН5 +СрН5 +...)/ N.
(4)
(5)
Если сравнивать содержание аллантоина в навесках (показатели X и ю), то можно заметить, что наибольшее количество приходится на облепиху сорта Лейкора, в то время как в облепихе сорта Херго эта цифра ниже при всех условиях экстракции (табл. 2).
Таблица 2 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и водно-спиртовых экстрактах из коры облепихи сорта Лейкора (Lekora), экстрагированных при pH=7_
Lekora
Июль Август
процентное процентное
соотношение C [мг/10мл] погрешность соотношение C [мг/10мл] погрешность
вода : этанол вода : этанол
100:0 0,074 ±0,001 100:0 0,051 ±0,001
75:25 0,109 ±0,001 75:25 0,072 ±0,001
50:50 0,052 ±0,001 50:50 0,047 ±0,001
X* 0,079 X 0,057
ю**, мг% 0,393 ю, мг% 0,285
Примечание: X *- средняя арифметическая концентрация аллантоина в растворах экстракции облепихи;
ю**- содержание аллантоина в облепиховом сырье, мг%.
Из данных табл. 2 видно, что наибольшее содержание аллантоина установлено в образцах, собранных в июле (0,393 мг%): в 1,39 раза больше, чем в образцах, собранных месяцем позже (0,285 мг%).
Подобную зависимость в содержании аллантоина мы видим в табл. 3, показывающей, что процентное содержание аллантоина сорта Херго составило 0,101 мг%, в то время как в июльских образцах этот показатель был равен 0,158 мг%.
Таблица 3 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и водно-спиртовых экстрактах из коры облепихи сорта Херго (Hergo) при pH=7_
Hergo
Июль Август
процентное процентное
соотношение C [мг/10мл] погрешность соотношение C [мг/10мл] погрешность
вода : этанол вода : этанол
100:0 0,025 ±0,001 100:0 0,021 ±0,001
75:25 0,038 ±0,001 75:25 0,024 ±0,001
50:50 0,032 ±0,001 50:50 0,016 ±0,001
X 0,032 X 0,020
ю, мг% 0,158 ю, мг% 0,101
Примечание: см. пояснения к табл. 2.
По результатам анализа образцов облепихи крушиновидной, экстрагированной растворами с кислотностью pH5, были также подготовлены табл. 5-6.
Из данных табл. 4 можно сделать вывод, что из коры облепихи вида Hippophae rhamnoides L. сорта Лейкора (Lekora) также экстрагируется большее количество аллантоина, чем из коры облепихи сорта Херго (Hergo) при всех условиях экстракции при рН 5.
Зависимость, установленная выше в экспериментах с кислотностью pH 7, подтвердилась и в данных экспериментах, проводимых в кислой среде (рН 5): наибольшее количество аллантоина было экстрагировано с помощью раствора вода : этанол в соотношении 75:25%, далее эффективность извлечения убывала при концентрации этанола 0 и 25% соответственно. При этом важно отметить, что при pH5 извлечение аллантоина осуществляется более эффективно, чем при pH7, не зависимо от состава экстракционного раствора.
Таблица 4 - Количественное содержание аллантоина в экстракте из коры облепихи сортов Лейкора ^екога) и Херго (Не^о), экстрагированного при рН=5_
рН5
Ье1кога Негйо
время сбора процентное соотношение вода:этанол С [мг/10мл] X время сбора процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] X
Июль 100:0 75,86 43998581 Июль 100:0 49,43 24744473
75:25 123,10 70773662,5 75:25 80,74 40838214
50:50 83,20 48158975 50:50 76,92 39895072,5
Август 100:0 41,89 29017326,5 Август 100:0 47,28 27797481,5
75:25 70,28 46765863 75:25 86,92 50266068
50:50 68,62 44599107,5 50:50 59,00 34444024
Примечание: см. пояснения к табл. 1.
Из данных табл. 5 можно сделать вывод, что наибольшее количество аллантоина приходится на раствор экстракта из коры облепихи сорта Лейкора, собранной в июле, при проведении спиртовой экстракции при рН=5. Определенное количество составляет 0,588 мг% в июльском и 0,431 мг% в августовском сырье.
Таблица 5 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и экстракте из коры облепихи сорта Лейкора ^екога), экстрагированного при рН=5_
Ьекога
Июль Август
процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] погрешность процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] погрешность
100:0 0,095 ±0,001 100:0 0,062 ±0,001
75:25 0,154 ±0,001 75:25 0,101 ±0,001
50:50 0,104 ±0,001 50:50 0,096 ±0,001
X 0,117 X 0,086
ю, мг% 0,588 ю, мг% 0,431
Примечание: см. пояснения к табл. 2
Аналогичный вывод можно сделать по данным табл. 6, в которой приведены данные анализа коры облепихи сорта Херго в зависимости от времени сбора при рН 5: количество аллантоина в сырьевых образцах, собранных в июле, составило 0,376 мг%, при этом в августовских образцах этот показатель был несколько ниже - 0,403 мг%.
Таблица 6 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и экстрактах из коры облепихи сорта Херго (Не^о), экстрагированных при рН=5_
Негйо
Июль Август
процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] погрешность процентное соотношение вода : этанол С [мг/10мл] погрешность
100:0 0,052 ±0,001 100:0 0,059 ±0,001
75:25 0,088 ±0,001 75:25 0,109 ±0,001
50:50 0,086 ±0,001 50:50 0,074 ±0,001
X 0,075 X 0,080
ю, мг% 0,376 ю, мг% 0,403
Примечание: см. пояснения к табл. 2
Обобщая представленные выше данные, можно сделать вывод, что выход аллантоина из коры облепихи крушиновидной вида Шрроркав тЬатпо1ёв8 Ь. при экстрагировании водно-спиртовыми растворами этанола выше у сорта Лейкора (Leikora), чем у сорта Херго (Хе^о). При этом экстракция в среде с рН=5 во всех сортах облепихи, независимо от времени сбора и состава водно-спиртового раствора, осуществляется более эффективно, чем при рН=7 (табл. 7 и 8).
Таблица 7 - Количественные данные о содержании аллантоина в водно-спиртовых экстрактах из коры и молодых побегов облепихи сорта Лейкора (Lekora) при pH=7 и pH=5
Кора Побеги
кислотность процентное соотношение вода : этанол C [мг/10мл] X кислотность процентное соотношение вода : этанол C [мг/10мл] X
pH7 100:0 96,01 34658979,5 pH7 100:0 79,11 34658979,5
75:25 159,83 50601544,5 75:25 134,63 50601544,5
50:50 145,62 24770405 50:50 119,68 24770405
pH5 100:0 90,59 34658979,5 pH5 100:0 77,90 34658979,5
75:25 99,07 50601544,5 75:25 83,17 50601544,5
50:50 94,85 24770405 50:50 77,62 24770405
Примечание: см. пояснения к табл. 1
Кора облепихи крушиновидной вида Hippophae rhamnoides L. сорта Лейкора (Lekora) содержит в себе большее количество аллантоина, чем молодые побеги вместе с корой того же вида (табл. 7). При этом можно говорить о следующей зависимости: наибольшее количество аллантоина экстрагируется с помощью 25%-ного водного раствора этанола, в котором соотношение «вода : этанол» составляют 75:25%.
Таблица 8 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и экстрактах из коры облепихи сорта Лейкора (Ъекога), проводимой в кислой (рН 5) и нейтральной водно-спиртовых средах (рН 7)_
Lekora Кора
pH7 pH5
процентное соотношение вода : этанол C [мг/10мл] погрешность процентное соотношение вода : этанол C [мг/10мл] погрешность
100:0 0,120 ±0,001 100:0 0,113 ±0,001
75:25 0,200 ±0,001 75:25 0,124 ±0,001
50:50 0,182 ±0,001 50:50 0,119 ±0,001
X 0,167 X 0,119
ю, мг% 0,837 ю, мг% 0,593
Примечание: см. пояснения к табл. 2
Из данных табл. 8 видно, что наибольшее содержание аллантоина при экстрагировании из коры облепихи сорта Лейкора переходит в экстракт при pH 7 и составляет 0,837 мг%, что в 1,4 раза выше, чем при проведении процесса при pH=5.
Аналогичная зависимость может быть констатирована по результатам экстракции, приведенным в табл. 9: в нейтральной среде концентрация аллантоина, экстрагированного из облепихового сырья, составила 0,695 мг%, что в 1,39 раза меньше, чем при экстрагировании в кислой сред при pH=5 (0,495 мг%).
Таблица 9 - Содержание аллантоина в облепиховом сырье и водно-спиртовых экстрактах из молодых побегов облепихи сорта Лейкора (Lekora) при проведении экстракции в кислой и нейтральной средах
Lekora Молодые побеги
pH7 pH5
процентное соотношение вода : этанол C [mg/mg] погрешность процентное соотношение вода : этанол C [mg/mg] погрешность
100:0 0,099 ±0,001 100:0 0,097 ±0,001
75:25 0,168 ±0,001 75:25 0,104 ±0,001
50:50 0,150 ±0,001 50:50 0,097 ±0,001
X 0,139 X 0,099
ю, мг% 0,695 ю, мг% 0,495
Примечание: см. пояснения к табл. 2.
ВЫВОДЫ
Содержание аллантоина в коре облепихи крушиновидной вида Hippophae rhamnoides L. у сорта Лейкора (Leikora) выше, чем в молодых побегах. Экстрагирование аллантоина из образцов коры и молодых побегов водно-спиртовым раствором этанола при pH=7 проходит эффективнее, чем в кислой среде при pH=5.
Рациональной концентрацией этанола в водном растворе при извлечении аллантоина из коры молодых и прошлогодних побегов облепихи является величина 25% (вода и этанол берутся в соотношении 75:25).
В количественном анализе сорт облепихи Херго менее эффективен по содержанию и извлечению аллантоина, чем сорт Лейкора, независимо от рН экстрагируемого водно-спиртового раствора.
В свежей коре облепихи аллантоина содержится практически в 1,5 раза больше, чем в образцах, хранившихся год или более, независимо от вида облепихи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мельник, А. В. Облепиха - источник здоровья / А. В. Мельник // Наука и жизнь. -2018. - №10. - С. 2-4.
2. Орасмяэ-Медер, T. Биохимические свойства аллантоина / Т. Орасмяэ-Медер, О. Шатрова // Наука красоты: Из чего на самом деле состоит косметика. - 2016. - 376 с.
3. Рахимов, И. Ф. Биохимический состав и фармакологические свойства масел облепихи и каперсов колючих, произрастающих в Таджикистане: дис.... д-ра мед. наук: 14.00.25: защищена 22.01.06: утв. 15.07.06 / Рахимов Исматулло Фатхуллоевич. - Душанбе, 2006. -5-9 с.
4. Компания производитель «Шимадзу»: руководство по эксплуатации: жидкостная хроматоргафия. - 2016. - С. 25-34, 112-115. [Электронный ресурс]. - Режим доступа к электрон. журн.: https://www.shimadzu.ru/sites/default/files/application handbook hplc.pdf / Корпорация Шимадзу: пер. с англ [Shimadzu manufacturer: Liquid Chromatography, 2016, p. 25-34, 112-115].
5. Клауде, М. Научная хроматография: руководство ВЭЖХ / М. Клауде, А. Йарди: пер. с нем. [ (Hand book of HPLC)]. - 1998. - Т. 78. - Рр. 325-333.
INVESTIGATION OF QUANTITATIVE COMPOSITION OF ALLANTOINE IN BARK AND YOUNG BRANCHES OF 2017 AND 2018 HIPPOPHAE RHAMNOIDES L, OF THE VARIETIES LEIKORA AND HERGO
S.A. Vorontsov, student [email protected] O.Ya. Mezenova, Dr. of Techn. Sciences, Professor, [email protected] Kaliningrad State Technical University
The results of the biopotential research of the sea buckthorn Hippophae rhamnoides L. and the quantitative content of allantoin in the bark of the young (2018) and last year (2017) shoots of the sea buckthorn and the buckthorn Hippophae rhamnoides L. are shown using the example of Leicora and Hergo. In this paper, the method of determination of allantoin was modified using highperformance liquid chromatography (HPLC) with preliminary water-alcohol extraction. The results show that the bark and young stalks of sea buckthorn can be used for further recycling in order to obtain allantoin in the form of a finished product used in medicine and cosmetology. Established rational pH values and the ratio of water and alcohol in solution for the extraction of allantoin from raw materials. It is shown that this variety of sea-buckthorn Hergo contains a larger amount of al-
lantoin than the Leikora variety. It is relevant to isolate it according to reasonable parameters and use in the biotechnology, cosmetic and medical industries.
allantoin, sea-buckthorn, Hippophae rhamnoides L, bark, young branches, HPLC, extraction
