CC BY
62
УДК 616.982.27
Т.А.Гришкина, Е.В.Тимофеева, В.А.Спиридонов
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ХРАНЕНИЯ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ САПА В ТЕЧЕНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ПЕРИОДА
. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
В работе проведено изучение 21 штамма Burkholderia mallei. Показано, что лиофильное высушивание позволяет сохранять редкие коллекционные культуры на протяжении длительного периода (до 24 лет). При этом сохраняются и основные биологические свойства музейных штаммов. В случае утраты отдельных признаков или изменения морфологии колоний для восстановления исходного фенотипа можно использовать повторные пассажи на полноценных питательных средах. Штаммы возбудителя сапа обладают различной чувствительностью к процессу высушивания, повторные циклы лиофилизации могут приводить к снижению ферментативной активности культур, что уменьшает их ценность как референтных штаммов.
Одним из важных направлений развития микробиологии и биотехнологии является разработка и оценка способов сохранения жизнеспособности и основных биологических свойств типовых культур микроорганизмов. Большинство культур Burkholderia mallei (Pseudomonas mallei) [4], хранящихся в лабораторных условиях на косяках мясопептонного агара с глицерином, при ежемесячных пересевах вскоре теряют свою исходную вирулентность, а иногда и жизнеспособность [1]. В связи с этим в практике противочумных учреждений широкое распространение получил метод лиофильного высушивания, позволяющий в различных температурных режимах компактно содержать значительное количество штаммов возбудителей особо опасных инфекций с сохранением исходных биологических свойств бактериальных культур. Однако наряду с бесспорными достоинствами метода лиофилизации, он характеризуется как стрессовый фактор, способный вызывать у микробных клеток ряд различных изменений, вплоть до летальных [5, 6]. Подобные наблюдения за коллекционными штаммами Burkholderia mallei, проведенные ранее, были ограничены 3 годами [1].
Целью настоящей работы являлось изучение эффективности использования метода лиофилизации при хранении штаммов возбудителя сапа в течение длительного периода и оценка сохранения ими морфологических, биохимических и серологических свойств.
Материалы и методы
В работе использован 21 штамм Burkholderia mallei. Культуры хранились в коллекционном центре ВолгНИПЧИ при 4 °С в лиофилизированном состоянии от 1 до 24 лет. Высушивание штаммов проведено на коллекторном аппарате конструкции К.Е.Долинова Для высушивания использовали среду М.М.Файбича [3]. Культуры возбудителя сапа за период хранения подвергались лиофилизации от 1 до 4 раз (кратность высушивания) с нефиксированным интервалом от 2 до 7 лет.
Регидратацию штаммов проводили 0,15 М раствором хлорида натрия (pH 6,8), для последующего
культивирования и изучения морфологии колоний использовали агар Хоттингера с 5 % глицерина и бульон Хоттингера, pH 6,8.
Изучение культур возбудителя сапа проводили в соответствии с действующими методическими рекомендациями [2]. Для определения биохимических свойств исследуемых штаммов использовали среды Гисса, Хью-Лейфсона, Биргера-Крушинской, протеолитическую активность изучали на среде с желатиной, ауксотрофность - на среде Джилларди, подвижность - в полужидком мясопептонном агаре. Чувствительность к полимиксину (50 мкг), гента-мицину (4 мкг/мл), способность к росту при 42 °С и на средах с высокой концентрацией NaCl (0,4 М и 1,1 М) определяли чашечным методом. Серологическую специфичность проверяли в реакции агглютинации на стекле. Для этого использовали бактериальную суспензию не менее 109м.к./мл и мелиои-дозную агглютинирующую сыворотку (титр 1:50, специфичный для возбудителя сапа).
Результаты
В работе был изучен 21 штамм Burkholderia mallei различных сроков хранения, всего 38 вариантов. Показано, что во всех случаях микробные клетки сохраняли жизнеспособность. У большей части изученных штаммов морфология колоний не изменена. Колонии были округлой формы, выпуклые, гладкие (S-форма). Их величина достигала 2 мм в диаметре через 48 ч культивирования. В отдельных культурах, хранившихся свыше 10 лет, отмечалось уменьшение размера колоний до 0,5 мм при первичном высеве. Типичная макроморфология восстанавливалась после двух-трех пассажей на полноценных питательных средах. Окраска колоний изменялась в процессе культивирования от бесцветной (через 24 ч) до серовато-желтой (через 48 ч). В бульоне Хоттингера с 5 % глицерина возбудитель сапа вырастал с образованием равномерного помутнения.
Практически все штаммы возбудителя сапа окисляли глюкозу до кислоты без образования газа и не разлагали лактозу, мальтозу, ксилозу, не ферментировали глюкозу в анаэробных условиях. От-
Таблица 1
Изменение способности ВигккоМегш таИе! утилизировать глюкозу в зависимости от сроков хранения и циклов лиофилизации
Таблица 2
Изменение желатиназной активности штаммов Burkholderia mallei в процессе хранения
Наименование Срок хранения, Кол-во циклов Окисление
штаммов годы лиофилизации глюкозы
И 22 1 + (К)
1 2 -
Z-12 18 1 + (К)
10 2 -
5584 14 1 + (К)
12 2 + (К)
10 3 -
Примечание. К - образование кислоты.
мечено, что с увеличением сублимационных циклов высушивания наблюдалось снижение окислительной активности штаммов Burkholderia mallei по отношению к глюкозе, в то время как сама способность не зависела от сроков хранения штамма (табл. 1). Трехкратные пассажи на плотных питательных средах не приводили к восстановлению способности исследованных штаммов утилизировать глюкозу. Следует также отметить, что окисление глюкозы возбудителем сапа происходило достаточно медленно и у различных штаммов составляло от 2 до 5 сут.
Тесты на аргининдигидролазу, лизиндекарбок-силазу и орнитиндекарбоксилазу у всех изученных культур не претерпели изменений в процессе хранения и соответствовали начальным характеристикам штаммов (аргинин «+», лизин «-», орнитин «-»).
Негативное воздействие лиофилизации в наибольшей степени сказалось на протеолитической способности культур по отношению к желатине, и это свойство было утрачено во всех случаях вне зависимости от сроков хранения и кратности высушивания штаммов (табл. 2). Однако последующие пассажи, на плотных питательных средах, как правило, восстанавливали данный признак. Исключение составили четыре штамма: Burkholderia mallei Ц-5, «Будапешт», 5584, Z-12, которые представлены вариантами, отличающимися по срокам хранения.
Для штаммов Burkholderia mallei Ц-5 и Будапешт, хранившихся 24 года в лиофилизированном состоянии, отмечена стабильная утрата признака гидролиза желатины, тогда как лиофилизированные варианты этих штаммов с меньшими сроками хранения (от 10 до 18 лет) восстанавливали желатиназ-ную активность после 2-кратных пересевов. Но, вероятно, и повторные циклы лиофилизации также могут оказывать отрицательное воздействие на сохранение исходного фенотипа коллекционных штаммов, что наблюдалось при исследовании Burkholderia mallei Z-12. В данном случае утрату изучаемого признака отмечали у варианта, подвергнутого 2-кратному высушиванию за период хранения. Наиболее чувствительным оказался штамм Burkholderia mallei 5584, утративший способность окислять глюкозу и ферментировать желатину после 1- и 3-кратного высушивания соответственно.
Все изученные штаммы возбудителя сапа были неподвижны, чувствительны к гентамицину и устойчивы к полимиксину. В отличие от непатогенных псевдомонад культуры не росли на питатель-
Наимено-
вание
штаммов
Срок
хранения,
годы
Кратность
лиофильных
высушиваний
Желатиназная активность различных штаммов после пассажей на плотных питательных средах
о І і
3
Ц-5
Будапешт
Z-12
5584
Богор 37 11
Ц-4
Иванович Муксувар В-120 Загреб 8
Р-1
10230
24
18
13 12
24
10
18
10
14 12 10 12 22 22 22 12 13 12 22 22 22
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + + + + + + ' + + +
Примечание. «+» - ферментация желатины.
ных средах с повышенным содержанием соли. Сохранилась и их серологическая активность в реакции агглютинации до диагностического титра сыворотки.
Таким образом, проведенные исследования показали, что метод лиофильного высушивания позволяет сохранить жизнеспособными коллекционные штаммы Burkholderia mallei на протяжении длительного времени. По нашим данным, этот период превышает двадцать лет. Особо следует отметить, что основные свойства культур не претерпевают значительных изменений. В случае утраты отдельных признаков, в том числе морфологических особенностей, для восстановления исходного фенотипа возможно использование нескольких пассажей на полноценных питательных средах. Однако следует учесть, что отдельные штаммы возбудителя сапа характеризуются особой чувствительностью к процессу высушивания, в результате чего при повторных циклах лиофилизации (1-, 3-кратных с интервалом до 7 лет) возможны изменения биохимической активности культур, что снижает их ценность как референтных штаммов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сурнина Н.С., Бородько C.JL, Быкова О.И., Волкова Е.Р.// Особо опасные и редко встречающиеся тропические инф. - Волгоград, 1980. - С. 80-82. - 2. Илюхин В.И., Батманов В.П., Храпова Н.П. и др. Лаб. диагн., лечение и профилакт. сапа: Мет. реком. - Волгоград, 1995. -26 с. -3. Файбич М.М. // ЖМЭИ. -1968. -№ 2. - С. 59-68. -
4.Garrity G.M., Johnson K.L., Bell J., Searles D.B.// Berdeys Manual of Systematic Bacteriology. - 2002. - P. 58. -
5. Ray B., Jezeski J.J., Busta F.F.// Appl. Microb. - 1971. -Vol. 22, N 3. - P. 401-407. - 6. Sinskey T.J., Silverman G. J. // J. Bacterid. - 1970. - Vol. 101, N 2. - P. 429-437.
T.A.Grishkina, E.V.Timofeyeva, V.A.Spiridonov
Assessment of the Effects of Long Storage on Glanders Pathogen Museum Collection Stains
Volgograd Anti-Plague Research Institute
Twenty one Burkholderia mallei strains were studied to demonstrate that the lyophilization and drying method makes it possible to conserve rare collectional cultures for long periods of time (up to 24 years). All the most
important biologic properties are retained under these conditions. If any of the characters are lost or colony morphology is changed, the original phenotype can be restored as a result of repeated subculturing on complete nutritional media. B. mallei strains vary in their sensitivity to drying procedures, repeated lyophilization cycles being apt to cause deceleration in the activity of the microbial cultures thus diminishing their value as reference strains.
Поступила 03.04.03
УДК 616.932:577.1
С.П.Заднова, Н.Д.Исаев, Н.П.Коннов, Т.Л.Захарова, Н.И.Смирнова
БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДВУХ ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ КЛОНОВ ШТАММА VIBRIO CHOLERAE ДАККА35 01
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В работе представлены данные по биохимическому анализу двух фенотипически различных клонов (токси-генного и нетоксигенного) штамма Vibrio cholerae Дакка35 классического биовара, которые отличаются не только по продукции холерного токсина, но и гемагглютинин/протеазы и подвижности. На поверхности нетоксигенного клона впервые обнаружен дополнительный слой полисахаридной природы, отсутствующий у токси-генных клонов, с которым связано изменение его морфологии колоний. Полученные данные наряду с продукцией нетоксигенными клонами белка внешней мембраны OmpU, обладающего защитными свойствами, позволили предположить, что названные клоны формируются в популяции штамма Дакка35 при попадании из орга-
низма человека в неблагоприятные условия внешней
Холера - опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae. Холерный вибрион является одним из самых давних и изменчивых видов, приспособленный к существованию в разных экологических системах -в поверхностных водоемах и кишечнике человека. Переход из одной среды обитания в другую сопровождается изменением метаболизма клеток, а также структуры и функции его генома.
При обитании в водной среде холерный вибрион подвергается воздействию различных неблагоприятных факторов, но, обладая уникальной вариабельностью, может адаптироваться к их воздействию путем изменения фенотипических свойств. К числу таких приспособительных реакций относятся защитная модификация клеточной стенки, выражающаяся в изменении ее гидрофобности, синтез дополнительных полисахаридных слоев и капсулы и т.д. При попадании в организм человека у холерных вибрионов происходят изменения экспрессии генов, связанных с синтезом факторов агрессии (токсинов, ферментов), что отражается на их фенотипе [5, 12].
В ранее опубликованных работах сообщалось об обнаружении токсигенного штамма классического биовара V. cholerae Дакка35 Огава, выделенного в 1958 г. в Пакистане от больного человека, продуцирующего 10-12 мкг/мл холерного токсина в среду выращивания. При изучении популяции указанного штамма установлено, что она гетерогенна и состоит из двух типов колоний: продуцирующих (Тох+) и не продуцирующих (Тох~) холерный токсин. При этом колонии Тох+ и Тох" заметно отличались друг от друга по морфологии и размерам. Клетки Тох формировали мелкие прозрачные колонии, тогда как колонии
среды.
клеток Тох~ были более крупные и мутные [3].
Цель нашей работы заключалась в сравнительном изучении биохимических свойств токсигенных и нетоксигенных клонов штамма классического биовара V. cholerae Дакка35.
Материалы и методы
В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера (pH 7,2), LB-бульон и агар. Белковый спектр клеток определяли, используя электрофорез в полиакриламидном геле по U.K.Laemmli [8]. Выделение экзополисахаридного материала с поверхности клеток штамма Дакка35 осуществляли по модифицированной методике [4]. Для этого бактерии токсигенного и нетоксигенного вариантов штамма Дакка35 выращивали в течение суток при 37 °С. Выросшую культуру центрифугировали при lOOOOg в течение 30 мин, затем бактериальные клетки ресуспендировали в 25 объемах стерильного физиологического раствора, обрабатывали на Vortex в течение 2 мин и для отделения антигенов, расположенных на поверхности клеток, центрифугировали. Осадок клеток отбрасывали, а к на-досадочной жидкости, содержащей растворенный полисахаридный материал, добавляли медленно с покачиванием три объема 95 % этанола. Образовавшийся преципитат, состоящий из полисахаридов, центрифугировали при 3000g в течение 30 мин, дважды отмывали этиловым спиртом и еще один раз -абсолютным этанолом, высушивали при комнатной температуре и анализировали методом тонкослойной хроматографии. Хромосомную ДНК выделяли по методу, описанному в пособии по молекулярному клонированию [2]. Полимеразную цепную реакцию
