CC BY
51
retrospective and actuality // Vestnik Rossijskoj Akademii Medicinskikh Nauk. - 2009. - №5. - P.33-37. (in Russian)
8. Onishchenko G.G., Ezhlova E.B., Melnikova A.A., et al. Sanitary-and-Epidemiologic Well-Being of Children in the Russian Federation // Pediatricheskaia farmakologia. - 2013. -Vol. 10. №3. - P.10-18. (in Russian)
9. Piven D.V., Boiko T.V., Koroleva T.Yu. On primary disablement of children's population in the Irkutsk Region //
Sibirskij Medicinskij Zurkal (Irkutsk). - 2005. - Vol. 56. №S7. -P.74-75. (in Russian)
10. Tutelian V.A. Eating healthy and sick child: A Manual for Physicians. - Moscow: Dynasty, 2007. - 324 p. (in Russian)
11. Filippov E.S., Savchenkov M.F., Gomellja M.V., et al. The health of children is strategy of national security // Sibirskij Medicinskij Zurkal (Irkutsk). - 2001. - Vol. 25. №2. - P.50-54. (in Russian)
Информация об авторах:
Тармаева Инна Юрьевна - д.м.н., профессор кафедры, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 3, ИГМУ, кафедра
гигиены труда и гигиены питания; Погорелова Ирина Геннадьевна - к.м.н., доцент кафедры, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 3, ИГМУ, кафедра коммунальной гигиены и гигиены детей и подростков, тел (3952) 622615,
e-mail: [email protected]
Information About the Authors:
Tarmaeva Inna - MD, PhD, Professor of, 664003, ul. Red Rebellion, 3, IGMU, Department of Occupational Health and nutrition; Pogorelov Irina G. - MD, PhD, assistant professor, 664003, ul. Red Rebellion, 3, IGMU, Department of Municipal Hygiene and Hygiene of Children and Adolescents, tel (3952) 622615, e-mail: [email protected]
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
© ГАРМАЖАПОВ А.Ж., ХАСНАТИНОВ М.А., ОЮУНЦЭЦЭГ Н., ДАНЧИНОВА Г.А., ЛЯПУНОВ А.В. - 2014 УДК: 615.32
ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА ДЭВА-5 НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА А H3
Амгалан Жаргалович Гармажапов1, Максим Анатольевич Хаснатинов2, Намсрай Оюунцэцэг1, Галина Анатольевна Данчинова1, Александр Валерьевич Ляпунов2 ('Монгольский государственный медицинский университет, Улан-Батор; 2Научный центр проблемы здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Иркутск, директор - член корр. РАМН, д.м.н., проф. Л.И. Колесникова)
Резюме. Был изучен препарат традиционной монгольской медицины ДЭВА-5 и его составляющие с целью изучения наличия противовирусных свойств в отношении вируса A H3. Изучение противовирусной активности препаратов велось методом определения индекса нейтрализации и определения дозы 90% подавления бляшкоо-бразования. Исследованные препараты обладали низким индексом нейтрализации и не оказывали существенного противовирусного действия. Отвары Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis и Terminalia chebula содержат водорастворимые компоненты, обладающие противовирусной активностью. Препараты Chiazospermum erectum и Terminalia chebula достоверно проявляли слабые вирусонейтрализующие свойства в двух независимых тестах.
Ключевые слова: противовирусная активность, традиционная монгольская медицина, Gentiana decumbens, Chiazospermum erectum, Polygonum alopecuroides, Terminalia chebula, Momordica cochichinensis, Дэва-5 (Растительный сбор).
EVALUATION OF THE ANTIVIRAL PROPERTIES OF THE DRUG DEVA-5 BASED ON VEGETABLE RAW MATERIALS
AGAINST INFLUENZA A VIRUS H3
A.Z. Garmazhapov1, M.A. Khasnatinov2, N. Oyuuntsetseg1, G.A. Danchinova1, A.V. Liapunov2 ('Mongolian State Medical University, Ulanbaatar, Mongolia; 2Scientific Center of family health and human reproduction problems of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk, Russia)
Summary. Was studied a drug of traditional Mongolian medicine DEVA-5 and it's components to study the availability of antiviral properties against virus A H3. Study of antiviral activity of drugs was carried out by determining the neutralization index and determine the dose 90 % inhibition of plaque formation. Studied drugs had low neutralization index and no significant antiviral action . Decoctions Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis and Terminalia chebula contain water-soluble components having antiviral activity. Drugs Chiazospermum erectum and Terminalia chebula showed significantly antiviral properties in two independent tests.
Key words: Antiviral activity, traditional Mongolian medicine, Gentiana decumbens, Chiazospermum erectum, Polygonum alopecuroides, Terminalia chebula, Momordica cochichinensis, DEVA-5 ( Floral collection).
В традиционной монгольской медицине вирусные заболевания, вызванные вирусом гриппа А Н3, связаны в первую очередь с нарушением равновесия в организме, которое определяется гармонией трех начал или трех конституций - Ветер, Желчь и Слизь. Для восстановления нарушения конституций в монгольской медицине используется препа-
рат ДЭВА-5, в состав которого входят следующие компоненты: Gentiana decumbens, Chiazospermum erectum, Polygonum alopecuroides, Terminalia chebula, Momordica cochichinensis.
Целью настоящего исследования явилось изучение противовирусных свойств в отношении вируса гриппа A H3 препарата на основе растительного сырья монгольской тради-
ционной медицины ДЭВА-5.
Материалы и методы
Препараты были взяты в высушенном и измельченном виде.
В исследовании использовали клеточную линию почки собаки MDCK (NBL-2), 85 пассаж (ООО «БиоЛот», Санкт-Петербург, РФ). Культуру клеток поддерживали на питательной среде DMEM c добавлением 10% сыворотки эмбрионов коровы, 25мМ HEPES, 0,2% БСА и смеси антибиотиков. Условия культивирования клеток поддерживали в соответствии с паспортом производителя клеточной культуры.
Исследование содержало 4 стадии. На стадии 1 оценивали токсичность тестируемых препаратов для клеток MDCK, на стадии 2 определяли концентрацию используемого вируса и производили тесты, подтверждающие идентичность субтипа вируса Н3, на стадии 3 определяли индекс нейтрализации каждого препарата и на стадии 4 для каждого препарата оценивали дозу 90% подавления бляшкообразования.
Приготовление отваров препаратов
На стадии 1 для приготовления отвара брали 30 г каждого препарата растительного происхождения, заливали 200 мл дистиллированной воды и приготавливали отвар путем кипячения на слабом огне до тех пор, пока общий объем жидкости не достигал 100 мл. Отвар процеживали через марлю, затем центрифугировали при 2700 об/мин. в течение 5 мин. и фильтровали через ряд грубых бумажных фильтров. Отвар Gentiana decumbens в концентрации 30% получился слишком густым, поэтому для этого препарата использовали 10% отвар. Полученные отвары стерилизовали фильтрацией через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Для образцов Gentiana decumbens и Polygonum allopecuroides, стерилизация через 0,22 мкм фильтр не удалась из-за густоты отваров. Эти препараты стерилизовали с помощью инкубации на водяной бане при 100оС в течение 30 мин.
Результаты, полученные на стадии 1, показали, что для получения препаратов воспроизводимого качества, необходима более стандартная методика приготовления отваров. Кроме того, необходимо было уменьшить исходную концентрацию препаратов и снизить возможное влияние дополнительных процедур стерилизации.
Оценка токсичности препаратов для культуры клеток MDCK
Монослой клеток MDCK инкубировали с тестируемым образцом в серии двукратных разведений в течение 7 суток. Параллельно инкубировали контрольные образцы клеток, в которых вместо отваров использовали стерильный фосфатно-солевой буфер в соответствующих разведениях. Эксперимент воспроизводили в 4 независимых повторах. Через 7 дней среду поддержки убирали, монослой клеток промывали стерильным фосфатно-солевым буфером и фиксировали 10% формалином в течение 12 ч. Фиксированные монослои клеток окрашивали в течение 30 мин. кристаллическим фиолетовым (0,05% водный раствор). Для сравнительной оценки количества жизнеспособных клеток, проводили экстракцию красителя в 100 мкл метанола и измеряли оптическую плотность (ОП) экстрактов при длине волны 630 нм. Измерения производили с помощью спектрофотометра Immunochem 2100 (High Technology Inc., США).
При статистической обработке результатов, предельной допустимой концентрацией препарата, считали ту,
при которой сохранялись единичные выжившие клетки. Исследование проводили с помощью прямой световой микроскопии фиксированных и окрашенных монослоев.
Выживаемость клеток при контакте с исследуемым препаратом в заданной концентрации рассчитывали как отношение ОП экстракта кристаллического фиолетового в лунке с препаратом к ОП экстракта кристаллического фиолетового в лунке с контрольным монослоем в соответствующем разведении и выражали в процентах.
Усредненные показатели оптической плотности экстрактов кристаллического фиолетового приведены в таблице 1.
Максимальную концентрацию, при которой выживаемость клеток составляла более 80%, считали максимальной нетоксичной концентрацией.
Титрование вируса гриппа А и подтверждение субтипа гемагглютинина
В работе использовали изолят ВГА A/H3/Teal/ Tunka/7/2010, выделенный нами от чирка-свистунка (Anas crecca) в 2010 г. Вирус прошел 3 пассажа в куриных эмбрионах и 1 пассаж в культуре клеток MDCK. Культивирование и наработку ВГА Н3 производили в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения [5], используя среду DMEM с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 25 мМ HEPES, 2ug/ml TPCK-трипсина и смеси антибиотиков. Титрование бляшкообразующих единиц (БОЕ) проводили согласно [3]. Титр вируса выражали в LgБОЕ/мл вирусной суспензии.
РНК выделяли из 100 мкл вирусной суспензии с помощью наборов Рибо-Преп (Амплисенс, Москва), обратную транскрипцию проводили с помощью набора Реверта^50 (Амплисенс, Москва) согласно инструкции производителя. Субтип гемагглютинина ВГА идентифицировали с помощью субтип-специфичной ОТ-ПЦР [2,4]. Кроме того, проводили анализ первичной нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина с помощью инструмента BLAST [2].
Определение индекса нейтрализации препаратов
Клетки MDCK выращивали в 24-луночных планшетах до формирования монослоя в среде для роста клеток. Перед нанесением инокулятов ВГА клетки промывали трехкратно средой для культивирования ВГА. В день эксперимента приготавливали свежий 2% отвар препаратов одновременно. В качестве положительного контроля использовали антисыворотку против ВГА субтипа H3N2 производства НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург, РФ) в разведении 1:10.
После остывания отваров до комнатной температуры приготавливали смесь из 500 мкл соответствующего отвара, 500 мкл среды для культивирования ВГА и приблизительно 10 0000 БОЕ ВГА Н3. Рабочая концентрация препарата при этом составляла 1%. Положительный контроль приготавливали из 100 мкл антисыворотки, 900 мкл среды для культивирования ВГА и приблизительно 10 0000 БОЕ ВГА Н3. Рабочее разведение сыворотки составляло 1:100. Отрицательный контроль приготавливали из 500 мкл стерильной бидистил-лированной воды, 500 мкл среды для культивирования ВГА и приблизительно 10 0000БОЕ ВГА Н3. Выбранная доза вируса обеспечивала множественность инфекции, равную 1БОЕ на клетку. Смеси инкубировали при 37оС в течение 30 минут и затем определяли титр вируса в каждой из смесей, включая контроли.
Индекс нейтрализации (в логарифмическом выражении)
Таблица 1
Оптическая плотность экстрактов окрашенных монослоев клеток MDCK (OD630±станд. отклон)
Концентрация Gentiana decumbens* Chiazospermum erectum Polygonum alopecuroides (bistorta) Terminalia chebula Momordica cochochinensis Дэва-5 Контрольный образец
15,00% 0,05±0,002 0,12±0,02 0,05±0,05 ND 0,05±0,05 0,15±0,01 0,41±0,1
7,50% 0,05±0,01 0,09±0,01 0,11±0,03 ND 0,05±0,01 0,1±0,02 0,45±0,06
3,75% 0,2±0,1 0,07±0,02 0,23±0,12 0,06±0,01 0,05±0,01 0,18±0,07 0,59±0,04
1,87% 0,47±0,25 0,05±0,02 0,33±0,19 ND 0,05±0,01 0,26±0,13 0,57±0,07
0,94% 0,58±0,31 0,09±0,04 0,46±0,25 ND 0,05±0,02 0,26±0,13 0,56±0,12
0,47% 0,60±0,32 0,24±0,12 0,49±0,27 0,06±0,02 0,11±0,06 0,30±0,16 0,54±0,11
0,20% 0,55±0,3 0,42±0,21 0,57±0,3 0,06±0,03 0,31±0,16 0,46±0,23 0,50±0,07
0,10% 0,52±0,26 0,55±0,28 0,57±0,29 0,06±0,03 0,43±0,23 0,39±0,21 0,52±0,06
Примечания: "концентрации для Gentiana decumbens составляют 5,00%, 2,50%, 1,25%, 0,62%, 0,30%, 0,15%, 0,08% и 0,04% сверху вниз соответственно.
рассчитывали как отношение титра ВГА в отрицательном контроле и титра ВГА в образце, обработанном исследуемым препаратом [1]. Данный тест был воспроизведен в 6 независимых повторах.
Оценка дозы 90% подавления бляшкообразования
Клетки MDCK выращивали в 24-луночных планшетах до формирования монослоя. Перед нанесением инокулятов ВГА клетки промывали трехкратно средой для культивирования ВГА. В день эксперимента приготавливали свежий 2% отвар препаратов одновременно. В качестве положительного контроля использовали антисыворотку против ВГА субтипа H3N2 производства НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург, РФ) в разведении 1:10[1].
Приготавливали серию двукратных разведений тестируемых образцов с концентрациями от 2% до 0,016% в среде для культивирования ВГА. После этого приготавливали смесь из 150 мкл соответствующего разведения тестируемого образца и 150 мкл среды для культивирования ВГА содержащей ~150 БОЕ ВГА. Отрицательный контроль приготавливали смешивая 150 мкл стерильной воды и 150 мкл среды для культивирования ВГА содержащей ~150 БОЕ ВГА. Смеси инкубировали при 37оС в течение 30 мин. и затем инокулировали в соответствующую лунку 24-луночной планшеты. После адсорбции ВГА в течение 30 мин. инокулят удаляли, монослои зараженных клеток MDCK промывали однократно чистой средой для культивирования ВГА и покрывали средой для культивирования ВГА с 1% агарозы. После затвердения среды планшеты инкубировали при 37оС в течение 3 суток, после чего фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Для оценки ингибирующей активности, подсчитывали количество бляшек, сформировавшемся при каждом разведении тестируемого препарата и сравнивали его с количеством бляшек, сформировавшемся в соответствующем разведении отрицательного контроля. Минимальную концентрацию препарата, при которой сформировалось не более 10% бляшек по сравнению с отрицательным контролем, считали дозой 90% подавления бляшкообразования. Данный тест был воспроизведен в 4 независимых повторах.
Статистическая обработка результатов
Данные представляли в виде средних значений показателя по результатам как минимум четырех независимых повторов эксперимента. Для оценки вариабельности результатов, рассчитывали стандартное отклонение. Нормальность распределения оценивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Статистическую значимость обнаруженных различий оценивали с помощью т-критерия Стьюдента, при этом различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Дозы 90% и 50% подавления бляшкообразования рассчитывали с помощью пробит-анализа при уровне значимости p=0,05. Анализ данных выполняли с помощью программ Statistica 6.1 and MSOffice EXCEL 2003.
Результаты и обсуждение
Исследуемые препараты токсичны для клеток MDCK в концентрациях выше 1-2%.
В результате эксперимента выявлено сильное цитопати-ческое действие экстрактов на клетки MDCK в концентрациях выше 1%.
Выживаемость клеток достигала 80% отсекающей границы при концентрациях не выше 2%. При этом наиболее токсичными для клеток млекопитающих были экстракты Terminalia chebula - клетки погибли во всех исследованных разведениях и Momordica cochochinensis (0,1%).
Наименьшей токсичностью для клеток млекопитающих обладают экстракты Gentiana decumbens и Polygonum alopecuroides - гибель клеток не наблюдалась даже при концентрации препарата 2%. Более того, в лунках, обработанных Polygonum alopecuroides в концентрации 0,2-2%, относительное количество клеток было в 1,5 раза выше, чем в контрольных лунках. Не исключено, что в такой концентрации данный препарат обладает стимулирующей активностью, однако для проверки этого наблюдения необходимы целенаправленные исследования.
Препарат ДЭВА-5 токсичен для клеток в концентрации 0,2-2%, однако токсичность низкая - от 70 до 87% клеток выживают при таких концентрациях препарата. В концен-
трациях ниже 0,2% выживаемость клеток не отличается от контрольных образцов.
Препарат Chiazospermum erectum высокотоксичен для клеток MDCK в концентрации выше 1%, погибает более половины клеток. Однако, при концентрации 1% и ниже препарат нетоксичен.
На основе полученных данных, в дальнейших экспериментах для Gentiana decumbens, Chiazospermum erectum, Polygonum alopecuroides и ДЭВА-5 приготавливали 2% отвары препаратов и тестировали эти препараты в двукратных разведениях от 1 до 0,008%. Для препаратов Terminalia chebula и Momordica cochochinensis приготавливали 1% отвары и тестировали их в двукратных разведениях от 0,5 до 0,004%.
Изолят ВГА A/H3/Teal/Tunka/7/2010 относится к субтипу H3 и способен к репродукции в культуре клеток MDCK
Клетки MDCK заражали стоковой суспензией A/H3/Teal/ Tunka/7/2010 в разведении 1:10 и инкубировали в течение 3-4 суток до проявления цитопатического действия (ЦПД). После этого надосадочную жидкость собирали, центрифугировали при 10000g для удаления дебрисаб распределяли на аликвоты и хранили полученную таким образом вирусную суспензию при -80оС до использования.
Концентрация ВГА A/H3/Teal/Tunka/7/2010 составила в среднем 6,45±0,7 Lg БОЕ/ml, что достаточно для проведения запланированных тестов. Вирус формировал четко различимые бляшки на третьи сутки после заражения.
Идентификация субтипа гемагглютинина с помощью субтип-специфичной ОТ-ПЦР показала, что изолят A/H3/ Teal/Tunka/7/2010 относится к субтипу H3.
Анализ нуклеотидной последовательности с помощью инструмента BLAST также подтвердил принадлежность А/ H3/Teal/Tunka/7/2010 к ВГА Н3 с высокой степенью статистической значимости (>99,5%).
Исследование прямого противовирусного действия в отношении ВГА A/H3/Teal/Tunka/7/2010
При обработке большинством препаратов, титр ВГА A/ H3/Teal/Tunka/7/2010 не изменяется. Исключение составили препараты Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis и Terminalia chebula. При обработке этими препаратами в концентрации 1% (Chiazospermum erectum) или 0,5% (Momordica cochochinensis и Terminalia chebula), титр снижался на 0,7-0,9 Lg БОЕ/мл (p=0,0073, p=0,005, p=0,007 соответственно), что означает снижение инфекционности вируса в 4-6 раз. Для сравнения, контрольный противовирусный препарат «H3N2 Abs» в разведении 1:100 снижал инфекционность вируса более чем в 300 раз (p=0,0001).
Индекс нейтрализации (ИН) исследуемых препаратов варьировал от 1,1±0,04 до 1,3±0,3. Отличия от ИН контрольного образца - 1±0,1 - были в пределах погрешности. Индекс нейтрализации контрольного противовирусного препарата «H3N2 Abs» в разведении 1:100 составил 2,4±0,7.
При обработке ~200 БОЕ ВГА A/H3/Teal/Tunka/7/2010 экстрактами, 90% подавления бляшкообразования не обнаружено ни при одной концентрации исследуемых препаратов. Контрольный противовирусный препарат подавлял 90% бляшек при концентрации ~0,5% (разведение антисыворотки к ВГА H3N2 - 1:4).
Однако исследуемые экстракты различались по степени воздействия на ВГА Н3. Так, отвары Chiazospermum erectum и Terminalia chebula нейтрализовали более 50% БОЕ при концентрации препаратов 1-0,25%. Хорошо выражено снижение активности препаратов по мере их разбавления, причем динамика снижения активности сопоставима с падением специфической нейтрализующей активности контрольного препарата антител. Препараты Polygonum alopecuroides и Momordica cochochinensis нейтрализовали более 50% БОЕ в концентрации 1%. Однако, при титровании этих экстрактов, не отмечено достоверной зависимости нейтрализующей активности от концентрации препарата - уже при двукратном разведении эти отвары не проявляли значимой нейтрализующей активности. При обработке препаратами Gentiana decumbens и ДЭВА-5 отмечено некоторое снижение количества БОЕ в образцах ВГА Н3, однако различия с контролем были на уровне статистической погрешности.
Таким образом, отвары 7 препаратов из растительного сырья исследованы на токсичность для культур клеток MDCK и на наличие противовирусной активности в отно-
шении вируса гриппа А субтипа H3.
Наименьшей токсичностью для клеток млекопитающих обладают экстракты Gentiana decumbens и Polygonum alopecuroides - при концентрации препарата не более 2% выживает более 80% клеток. Все остальные препараты в концентрациях выше 1% токсичны для клеток MDCK. Наиболее токсичными являются экстракты Terminalia chebula и Momordica cochochinensis. Эти экстракты оказывают сильное токсическое воздействие на клетки MDCK даже в концентрациях 0,2%.
Изучение противовирусной активности препаратов велось двумя независимыми методами - определение индекса нейтрализации и определение дозы 90% подавления бляш-кообразования.
Все исследованные препараты обладали низким индексом нейтрализации и не оказывали существенного противовирусного действия. Однако при обработке препаратами Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis и Terminalia chebula в концентрации 1%, инфекционность ВГА H3 статистически значимо снижалась в 4-6 раз (p=0,05). Противовирусная активность отваров гораздо ниже, чем у специфических антител, которые в равной концентрации снижают инфекционность ВГА в 300 раз, однако наблюдаемое слабое противовирусное действие стабильно воспроизводится в повторных независимых экспериментах и имеет выраженную зависимость от концентрации отвара.
Ни один из исследованных отваров не обеспечивал 90% подавления бляшкообразования в исследованных концентрациях от 1% до 0,008%. При этом, препараты Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis, Terminalia chebula нейтрализовали более 50% БОЕ ВГА Н3 в концентрациях 1% - 0,25%. Для 3 препаратов - Chiazospermum erectum, Terminalia chebula и Scutellaria baicalensis - отмечена зависимость подавления бляшкообразования от концентрации препарата.
Полученные данные позволяют интерпретировать результаты следующим образом: возможно, что отвары Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis и Terminalia chebula содержат водорастворимые компоненты, обладающие противовирусной активностью. Однако концентрация этих веществ в отваре низка, вследствие чего их противовирусная активность не проявляется на биологически значимом уровне. Наиболее перспективным способом проверить это предположение представляется химическое фракционирование экстрактов препаратов Chiazospermum erectum, Momordica cochochinensis и Terminalia chebula с последующим изучением противовирусной активности индивидуальных фракций.
При дальнейших исследованиях особое внимание стоит обратить на препараты Chiazospermum erectum и Terminalia chebula, поскольку только эти отвары достоверно проявляли слабые вирусонейтрализующие свойства в двух независимых тестах (индекс нейтрализации и PRNT).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гулд E., Клегг Дж. Культивирование, титрование и очистка тогавирусов // Вирусология. Методы. / Под ред. Б. Мейхи. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1988. - С.66-111.
2. Altschul S.F., Gish W., Miller W., et al. Basic local lignment search tool // J. Mol. Biol. - 1990. - Vol. 215. - P.403-410.
3. Gaush C.R., Smith T.F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells // Applied Microbiology. - 1968. - Vol. 16 - P.588-594.
4. Tsukamoto K., Ashizawa H., Nakanishi K., et al. Subtyping of H1 to H15 Hemagglutinin Genes of Avian Influenza Virus by RT-PCR Assay 4 and Molecular Determination of the Pathogenic Potential // J. Clin. Microbiol. - 2008 - Vol. 46. №9. - P.3048-3055.
5. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. // WHO Department of Communicable Diseases Surveillance and Control, Switzerland, Geneva. - WHO/CDS/ CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. - 98 p.
REFERENCES
1. Guld E., Klegg Dg. Cultivation, tittering and clearing of togavirus // Virology. Methods. - Translated of English. - Moscow: Mir, 1988. - P.66-111. (in Russian)
2. Altschul S.F., Gish W., Miller W., et al. Basic local lignment search tool // J. Mol. Biol. - 1990. - Vol. 215. - P.403-410.
3. Gaush C.R., Smith T.F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells // Applied Microbiology. - 1968. - Vol. 16 - P.588-594.
4. Tsukamoto K., Ashizawa H., Nakanishi K., et al. Subtyping of H1 to H15 Hemagglutinin Genes of Avian Influenza Virus by RT-PCR Assay 4 and Molecular Determination of the Pathogenic Potential // J. Clin. Microbiol. - 2008 - Vol. 46. №9. - P.3048-3055.
5. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. // WHO Department of Communicable Diseases Surveillance and Control, Switzerland, Geneva. - WHO/CDS/ CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. - 98 p.
Информация об авторах:
Гармажапов Амгалан Жаргалович - магистрант, ул. Зориг, д.3, Улан-Батор, Монголия, Монгольский Государственный Медицинский Университет, тел. (976) 11326894, (e-mail: [email protected]; Хаснатинов Максим Анатольевич - к.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Оюунцэцэг Намсрай - докторант, e-mail: [email protected]; Данчинова Галина Анатольевна - руководитель лаборатории, e-mail: [email protected];
Ляпунов Александр Валерьевич - старший научный сотрудник, e-mail: [email protected].
Information About the Authors:
Garmazhapov A.Z. - Master of the Mongolian State Medical University of Traditional Mongolian Medicine department, 3 Zorig street, Mongolia, Ulaanbaatar, tel: (976) 11326894, e-mail: [email protected]; Khasnatinov M.A., Ph.D. - leading research scientist at "Scientific Center of family health and human reproduction problems" of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk, [email protected]; Oyuuntsetseg N. - Doctoral Mongolian State Medical University of Traditional Mongolian Medicine department, e-mail: [email protected]; Danchinova G.A., D.Sc. - head of laboratory of transmissive infections at "Scientific Center of family health and human reproduction problems" of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk, e-mail:[email protected]; Liapunov A.V., Ph.D. - leading research scientist at "Scientific Center of family health and human reproduction problems" of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk,
e-mail: [email protected].
