CC BY
10
УДК 577.1 13.3
Оценка противовирусного потенциала модифицированных гетероциклических оснований и 5'-норкарбоциклических аналогов нуклеозидов в отношении SARS-CoV-2
Е. С. Матюгина1, М. С. Новиков2, Л. И. Козловская3,4, В. П. Волок3, Е. Ю. Шустова3, А. А. Ишмухаметов3,4, С. Н. Кочетков1, А. Л. Хандажинская1*
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 119991 Россия
2 Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград, 400131 Россия 3Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН, Москва, 108819 Россия
4Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, 119991 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 25.10.2021
Принята к печати 10.12.2021
DOI: 10.32607/actanaturae.11479
РЕФЕРАТ Пандемия, вызванная новым бетакоронавирусом SARS-CoV-2, унесла уже почти 5 млн жизней. Несмотря на разработку и широкое применение вакцин против COVID-19, это заболевание остается главной проблемой мирового здравоохранения. В рамках перепрофилирования существующих лекарственных средств ведутся интенсивные исследования препаратов, созданных для терапии других вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний с целью создания эффективного терапевтического средства. В данной работе в результате фенотипического скрининга библиотек модифицированных гетероциклических оснований и 5'-норкар-боциклических аналогов нуклеозидов, синтезированных нами ранее, выявлены два соединения-лидера, способные ингибировать размножение вируса SARS-CoV-2 со значениями EC50 в диапазоне 20-70 мкМ. Структуры этих соединений могут быть использованы для дальнейшей оптимизации с целью создания противовирусного препарата.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА SARS-CoV-2, противовирусные препараты, нуклеозиды, аналоги нуклеозидов. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ EC50 - 50% эффективная концентрация, т.е. концентрация соединения, подавляющая репродукцию вируса в 50% тест-объектов; NHC - N-гидроксицитидин; ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ДМСО - диметилсульфоксид; ТЦД50 - 50% тканевая цитотоксическая доза, т.е. доза вируса, вызывающая появление признаков цитопатического действия в 50% тест-объектов.
ВВЕДЕНИЕ
Coronaviridae - семейство вирусов, включающее два подсемейства: Orthocoronavirinae и Letovirinae. Опасные для здоровья человека патогены относятся к подсемейству Orthocoronavirinae. В 60-х годах XX века впервые были идентифицированы коронавиру-сы человека (HCoV) - НСо^ОС43 (ОС43) и НСо^-229Е (229Е) [1]. Позднее обнаружили и другие коро-навирусы человека: НСо^№Ь63 (№Ь63) в 2004 году и НСоУ-НКШ (НКи1) в 2005 году [1]. Эти четыре вируса обычно вызывают острые заболевания верхних, реже нижних дыхательных путей, но тяжелые слу-
чаи коронавирусной инфекции регистрировали редко и связывали, как правило, с сопутствующей патологией и/или иммунологическим старением. Два более опасных коронавируса человека - SARS-CoV (2003 г.) и MERS-CoV (2012 г.) вызывают атипичные поражения верхних и нижних дыхательных путей, которые особенно тяжело протекают у людей старше 65 лет и пациентов с сопутствующими заболеваниями [1].
Седьмым в группе коронавирусов человека стал SARS-CoV-2, идентифицированный в декабре 2019 года в городе Ухань (Китай). Инфекция, вызываемая этим вирусом, получила название COVID-19 и бы-
78 | ACTA NATURAE | ТОМ 13 № 4 (51) 2021
HN
сЛм
н
1-5
О
нхУ
Н 6-7
О'
HN
л
8-9
R = 3-Me (1), R = NHPh (6), R = H (8),
4-Me (2), 4-Bu (3), NHBn (7) 4-Bu (9)
4-OBu (4), 4-OPh (5)
5-Ариламинопроизводные урацила и 6-азаурацила
Рис. 1. Аналоги гетероциклических оснований
N
-ТТЛ
NH2
Щ';«
N N
Н
10
12
Флексимерные аналоги 8-аза-7-деазааденина, 8-аза-1,7-дидеазааденина и 8-аза-3,7-дидеазааденина
стро распространилась по всему миру. Всемирная организация здравоохранения объявила 11 марта 2020 года о пандемии COVID-19 [2]. Объединенные усилия ученых всего мира, позволившие быстро выявить этиологический агент, получить информацию о структуре и жизненном цикле вируса, а также опыт разработки вакцин против «атипичной пневмонии», вызванной SARS-CoV, привели к появлению вакцин, некоторые из которых успешно прошли доклинические и клинические испытания и используются для массовой вакцинации [2].
Тем не менее, на 27 октября 2021 диагноз COVID-19 подтвержден более чем у 274 млн пациентов в мире, из которых 4.96 млн умерли [2]. К настоящему моменту не существует общепринятых эффективных методов терапии COVID-19, в связи с чем создание специфических препаратов для лечения этого заболевания остается весьма актуальной задачей. Разрабатывают препараты на основе антител, ингибиторов вирусных ферментов (РНК-зависимой РНК-полимеразы, протеаз и др.), ингибиторов проникновения вируса в клетку и др. [3]. В рамках перепрофилирования существующих лекарственных средств во всем мире ведутся интенсивные исследования препаратов, созданных для терапии других вирусных (грипп, ВИЧ-инфекция, гепатит С, лихорадка Эбола и др.), бактериальных и паразитарных инфекций, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний [3].
В контексте данной стратегии мы провели скрининг библиотеки аналогов гетероциклических оснований и нуклеозидов, полученных нами ранее и показавших противовирусную [4-8], антибактериальную [7, 9-11], противопаразитарную [12, 13] или антипролиферативную активность [14, 15].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Стоковые растворы тестируемых соединений в концентрации 5 мкМ готовили в 100% ДМСО. Для оценки противовирусной активности использовали штамм ПИК35 вируса SARS-CoV-2 (а^АГО ГО EPI_ISL_428851) [16]. Вирус прошел пять пассажей
в клетках Vero и хранился в виде суспензии инфицированных клеток при температуре -70°С. Линия клеток почки зеленой мартышки Vero получена из Biologicals, ВОЗ, Швейцария (RCB 10-87). Клетки вели на культуральной среде ДМЕМ («ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Россия) с фетальной сывороткой крупного рогатого скота (Gibco, США, 5%), стрептомицином (0.1 мг/мл) и пенициллином (100 ед./мл) («ПанЭко», Россия).
Методика фенотипического скрининга апробирована ранее [16]. Готовили восемь двукратных разведений стоковых растворов соединений в среде ДМЕМ. Далее разведения соединений смешивали с равными объемами вирусной суспензии, содержащей 50-200 ТЦД50 на лунку, инкубировали в течение 1 ч при 37°C, далее смеси вирус-соединение добавляли к конфлюентным монослоям клеток Vero в двух повторностях. После 5-дневной инкубации при 37°C цитопатический эффект (ЦПЭ) оценивали микроскопически. Значения ЕС50 рассчитывали по методу Кербера как описано ранее [16]. Эксперимент повторяли не менее 2 раз для каждого соединения. В качестве положительного контроля использовали N-гидроксицитидин (NHC), в качестве отрицательного - ДМСО.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведен фенотипический скрининг библиотеки аналогов гетероциклических оснований (рис. 1) и нуклеозидов (рис. 2), синтезированных нами ранее, на активность против SARS-CoV-2. Первая группа аналогов гетероциклических оснований представляет собой 5-ариламинопроизводные урацила и 6-азаура-цила (рис. 1), проявившие себя как ненуклеозидные ингибиторы ВИЧ и ингибиторы роста Mycobacterium tuberculosis [7, 11]. Вторая группа представляет собой новые флексимерные аналоги аза/дезазапуриновых оснований (рис. 1) [17]. Известно, что аза/дезазапури-ны, как и соответствующие нуклеозиды, проявляют широкий спектр противопаразитарных, противоопухолевых и противовирусных свойств [18]. С другой стороны, флексимерные основания обладают высокой
13-17
R = СзН7 (13), С6Н,3 (14), С8н17 (15), С,оН21 (16),С Н (17)
Гт
"•с/
18-24
R = С3Н7 (18), С5н„ (19), С6Н13 (20), С8Н17 (21), С12Н25 (22), 4-1Ви-Р1п (23), 4-^5Н„-РЬ(24)
К*-г =\ А
\ к
(25): R1 = Вг
(26): R1 = Н,
(27): R1 = Н,
(28): R1 = Н,
(29): R1 = Н,
(30): R1 = Н,
(31): R1 = Н,
(32): R1 = Н,
(33): R1 = Н,
(34): R1 = Н,
(35): R1 = Н,
(36): R1 = Н,
(37): R1 = Н,
(38): R1 = Н,
25-38
^ = Н, ^ = Н, R. = Н
2 '3 '4
R2 = Ме, R3 = Н, R4 = Н R2 = Ме, Rз = Bz, Р!4 = Н : Вп, R4 = Н
= Н, R3 = Н, R3 =
3,5-Ме2Вп, R4 = Н
, = Ме, ^ = 3,5-Ме2Вп, R4 = Н
= Н, R3 =
Н, R4 = 3,5-С12
: Н, R3 = Н, ^ = 3^
= Н, R3 =
3,5-С1^, R4 = 3,5-С12
: Н, R3 = Вп, ^ = 3-CN
' Н, ^ : Н, R3 = Н, R4 : Н, R3 = Н, R4 = Н, ^
: Вп, R4 = 3,5-С12 : 4-РЬ : 4-РЬО
: Н, ^ = 4-РЬОСН,
42
2
2
2
2
2
2
2
2
2
о
о
ны
ТГ
но он 39
НИ , \
° нп
ио^у ^
НО ОН НО он 40 41
О
ын2
N
N
<' Т мн
нг^г
44
45-49
R = Н (45), Ме (46), I (47), ЫНРЬ (48),
С-СС12Н25 (49)
ын2
<" X У®
но он 42
о
ЕЮ 'ОН'
7
0Е1
НО- ^ N
О^М
"ЧУ
50-51
R = с-сс6Н13 (50), ЫНРЬ (51)
НО ОН
43
О
нгм'
АСО^М'
52-53
R = С12Н25 (52),
С14Н29 (53)
.хж
Рис. 2. 5'-Норкарбоциклические аналоги нуклеозидов
подвижностью (гибкостью) структуры, которая создается за счет размыкания пуринового кольца на отдельные гетероциклические фрагменты. Свободное вращение вокруг С-С-связи позволяет подобным соединениям наилучшим образом подстраиваться к пространственной структуре активного центра фермента-мишени, что в ряде случаев позволяет обходить возникающие в последнем точечные мутации, тем самым обеспечивая механизм преодоления лекарственной устойчивости [17].
Другая группа соединений включает 5'-норкарбо-циклические аналоги пуриновых и пиримидиновых
нуклеозидов (рис. 2). Структурная особенность этих аналогов нуклеозидов - отсутствие 5'-метиленовой группы и, как следствие, невозможность превращаться в фосфорилированные формы под действием клеточных ферментов и проявлять биологическую активность по традиционным для обычных модифицированных нуклеозидов механизмам. Однако представители соединений данного класса способны выступать в качестве ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) ВИЧ, а кроме того, обладают антибактериальной и противоопухолевой активностью [4-7, 9-11, 15].
80 | АСТА ^ТиИАЕ | ТОМ 13 № 4 (51) 2021
Противовирусную активность определяли по способности исследуемых соединений ингибировать гибель клеток Vero, индуцированную заражением штаммом ПИК35 вируса SARS-CoV-2. В качестве положительного контроля использовали N-гидроксицитидин (NHC), известный ингибитор репродукции SARS-CoV-2, активность которого в данной серии экспериментов соответствовала ранее полученным данным [16]. Всего протестировано 53 соединения, большинство из которых не проявили активности в концентрации до 100 мкМ. Только два соединения, (1-(4'-гидрокси-2'-циклопентен-1-ил)-6-(4-третбутилфенил)-3Н-пирроло[2,3-^]-пиримидин-2-он 23 и 1-(4'-гидрокси-2'-циклопентен-1-ил)-6-(4-пентилфенил)-3Н-пирроло[2,3-^]-пиримидин-2-он) 24, показали дозозависимую способность ингибировать размножение SARS-CoV-2 со значениями EC50 = 53 и 21 мкМ соответственно (таблица). При этом наблюдалась довольно выраженная цитотоксичность, что соответствует ранее полученным данным [14].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе методами фенотипического скрининга выявлены два аналога нуклеозидов, 5'-нор-
Константы противовирусной активности и цитотоксич-ности активных соединений
Соединение ЕС„, мкМ 50' (M ± SEM) СС50, мкМ (M ± SEM) Индекс селективности (SI)
23 53 ± 18 75 ± 25 1.42
24 21 ± 6 53 ± 18 2.52
NHC 5.3 ± 0.9 >100 > 19
карбоциклические производные бициклических фурано[2,3-^]пиримидинов 23 и 24, способных ингибировать репродукцию вируса SARS-CoV-2 in vitro. Структуры этих соединений могут быть использованы для дальнейшей оптимизации с целью создания противовирусного препарата.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-04-60414. Синтез флексимерных аналогов гетероциклических оснований был осуществлен при поддержке РНФ № 19-74-10048.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shi Z., Brugere-Picoux J. // Bull. Acad. Natl. Med. 2021. V. 205. P. 732-736.
2. https://covid19.who.int/
3. https://covid-nma.com/living_data/index.php.
4. Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Novikov M.S., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Balzarini J., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Medchemcomm. 2013. V. 4.
P. 741-748.
5.Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Geisman A.N., Novikov M.S., Chizhov A.O., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Medchemcomm. 2013. V. 4. P. 1443-1451.
6. Matyugina E., Valyev-Elliston V.T., Novikov M.S., Alexandrova L.A., Chernoysova L.N., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // FEBS J. 2013. V. 280. P. 358-359.
7. Matyugina E.S., Novikov M.S., Babkov D.A., Valuev-Elliston V.T., Vanpouille C., Zicari S., Corona A., Tramontano E., Margolis L.B., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N. // Acta Naturae. 2015. V. 7. P. 113-115.
8. Matyugina E.S., Seley-Radtke K.L., Andronova V.L., Galegov G.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Russ. J. Bioorg Chem. 2010. V. 36. P. 730-733.
9. Matyugina E., Khandazhinskaya A., Chernousova L., Andreevskaya S., Smirnova T., Chizhov A., Karpenko I., Kochetkov S., Alexandrova L. // Bioorgan. Med. Chem. 2012. V. 20. P. 6680-6686.
10. Matyugina E.S., Andreevskaya S.N., Smirnova T.G., Khandazhinskaya A.L. // Acta Naturae. 2012. V. 4. P. 73-77.
11. Matyugina E., Novikov M., Babkov D., Ozerov A.,
Chernousova L., Andreevskaya S., Smirnova T., Karpenko I., Chizhov A., Murthu P., et al. / / Chem. Biol. Drug Des. 2015. V. 86. P. 1387-1396.
12. Alzahrani K.J., Matyugina E.S., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., de Koning H.P. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2017. V. 27. P. 3081-3086.
13. Khandazhinskaya A.L., Matyugina E.S., Solyev P.N., Wilkinson M., Buckheit K.W., Buckheit R.W., Chernousova L.N., Smirnova T.G., Andreevskaya S.N., Alzahrani K.J., Natto M.J., Kochetkov S.N., de Koning H.P., Seley-Radtke K.L. // Molecules. 2019. V. 24. P. 19E3433.
14. Klimenko A.A., Matyugina E.S., Logashenko E.B., Solyev P.N., Zenkova M.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Molecules. 2018. V. 23. P. 2654.
15. Matyugina E.S., Logashenko E.B., Zenkova M.A., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L. // Heterocycl. Commun. 2015. V. 21. P. 259-262.
16. Kozlovskaya L.I., Volok V.P., Shtro A.A., Nikolaeva Y.V., Chistov A.A., Matyugina E.S., Belyaev E.S., Jegorov A.V., Snoeck R., Korshun V.A., et al. // Eur. J. Med. Chem. 2021. V. 220. P. 113467.
17. Khandazhinskaya A., Eletskaya B., Fateev I., Kharitonova M., Konstantinova I., Barai V., Azhayev A., Hyvonen M., Keinanen T., Kochetkov S., et al. // Organic. Biomol. Chem. 2021. V. 19. P. 7379-7389.
18. Matyugina E.S., Kochetkov S.N., Khandazhinskaya A.L.// Russ. Chem. Rev. 2021. V. 90. P. 1454-1491.
